הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ"א ארבידופסיס In vivo

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחשוף אינטראקציות בין חלבונים ל-DNA בכרומטין של תאי ארבידופסיס. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הצמח, כגון אילו גנים מווסתים על ידי גורם שעתוק נתון, או אילו שינויים במערכת קשורים למצב שעתוק של גנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שבאמצעות שלב הקישור ניתן לתקן וללכוד שינויים בארגון הכרומטין המתרחשים במהלך התפתחות הצמח.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציה בין חלבונים ב-arabidopsis thaliana, ניתן ליישם אותה גם על סדרי צמחים שונים ולהתאים אותה למיני צמחים אחרים. ידגימו הליך זה דורוטה קומאר ואלפונסו מוריז, שני דוקטורנטים במעבדה שלנו. לאחר גידול ארבידופסיס על פי פרוטוקול הטקסט, אספו 1.5 גרם חומר צמחי בצינורות של 50 מיליליטר, ושמרו אותם על קרח במהלך קישור צולב.

לאחר מכן, השתמש במחט המחוממת על ידי מבער מעבדה כדי ליצור חורים קטנים במכסי הצינורות. הוסף 40 מיליליטר של 1x pbs ו -1.08 מיליליטר פורמלדהיד לצינורות. הברג את המכסים על הצינורות, והניח את הצינורות בחומר ייבוש.

הסתנן בוואקום למשך 10 דקות, ולאחר מכן שחרר בזהירות את הוואקום כדי למנוע ערבוב התמיסה. לאחר ערבוב הדגימה, חזור על שלבי הוואקום והערבוב. עם החדירה, התבונן בחומר הצמחי וודא שהוא הופך מעט שקוף ושוקע לתחתית הצינור.

הוסף 2.5 מיליליטר של שני גליצין מולארי לריכוז סופי של 0.125 מולארי והחל את הוואקום למשך חמש דקות. לאחר שחרור הוואקום, השליכו את התמיסה על ידי היפוך הצינורות ואפשרו לה לטפטף דרך החורים במכסים. השתמש ב- pbs כדי לשטוף את הצמחים פעמיים, ולשטוף במים פעם אחת.

לאחר מכן יבש את השתילים על מגבת נייר לפני השימוש בחנקן נוזלי להקפאה. לכל משקעים חיסוניים, הכינו 15 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של משקעים חיסוניים של כרומטין, או מאגר דילול שבבים, לחרוזים, ערבב בסיבוב והנח את צינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר במתלה מגנטי.

לאחר שאפשרתם לחרוזים להיצמד למגנט למשך כדקה, השתמשו בפיפטמן כדי להסיר את הסופרנטנט לפני שתחזרו על הכביסה. השעו מחדש את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של מאגר דילול שבבים. עבור משקעים חיסוניים, הוסף את הכמות הנדרשת של הנוגדן הספציפי לאחד משני הצינורות שהוכנו לכל צמח עיוור.

גורם מפתח בניסוי שבב מוצלח הוא הנוגדן הנבחר למשקעים החיסוניים של החלבון המבוקש. נוגדנים הגדלים כנגד גורם שעתוק צמחי יכולים להיות שימושיים לניסויי שבב, אך יש לבדוק את הסרום ביסודיות. לדוגמה, נוגדנים שנבדקו רק בניתוח כתמים מערביים אינם בהכרח תקפים לשבב.

כבקרה שלילית, הוסף את אותה כמות של IGG לא ספציפי לצינור השני. דגרו את הצינורות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על גלגל מסתובב כדי לאפשר לנוגדנים להיצמד לחרוזים. בעזרת מכתש ועלי טוחנים היטב את החומר הצמחי הקפוא בחנקן נוזלי עד שהאבקה הופכת הומוגנית וירוקה בהירה.

מעבירים את האבקה לצינור חדש של 50 מיליליטר. מתחת למכסה אדים, מוסיפים 30 מיליליטר של חיץ מיצוי אחד, ומערבבים היטב כדי להשרות את אבקת הרקמות. משלב זה ואילך, שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס כל הזמן, וודא שהרקמה מופשרת לחלוטין לפני שתמשיך הלאה.

נקה את התרחיץ על ידי העברתו דרך רקמת סינון בגודל נקבוביות של 22 עד 25 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מיליליטר. ואז צנטריפוגה ב -1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שפכו בעדינות את הסופרנטנט מהגלולה, שאמורה להיות בנפח של כשני מיליליטר.

עם חמישה מיליליטר של מאגר מיצוי שניים, השעו מחדש את הגלולה. ואז צנטריפוגה ב -1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר סילוק הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה ב-300 מיקרוליטר של מאגר מיצוי שלוש.

בצינור נפרד, הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר מיצוי שלוש ולאחר מכן שכב בזהירות את הגלולה המושעה מחדש על גבי המאגר הנקי. צנטריפוגה של הצינור למשך שעה אחת ב-16,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס, ואחריה שאיבת הסופרנטנט עם פיפטה. לאחר מכן, השתמש ב-300 מיקרוליטר של מאגר סוניקציה כדי להשעות לאט לאט את הגלולה הגרעינית, הימנעות מהיווצרות בועות, שעלולה להשפיע על יעילות הסוניקציה.

העבירו בזהירות את המתלה לצינור נקי של 1.5 מיליליטר. סוניקציה של התרחיף כדי לליז את הגרעינים ולשתף באופן אקראי את הכרומטין ל-200 עד 600 שברי זוגות בסיסים. ודא את גדלי שברי ה- DNA על ג'ל אגרוז, ואז סובב את התמיסה ב -12, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

העבירו את הסופרנטנט לצינור טרי של 1.5 מיליליטר, והשליכו את הגלולה. קחו עשירית מהסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה, וסמנו אותה כקלט לפני הקפאה במינוס 20 מעלות צלזיוס. לבסוף, בצע דילול פי עשרה של הכרומטין במאגר דילול השבב כדי להשיג ריכוז SDS סופי של 0.1 אחוז.

לאחר מכן ניתן להקפיא דגימות ולאחסן אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. לאחר דגירה של החרוזים עם נוגדנים למשך הלילה, השתמש במיליליטר אחד של מאגר דילול שבבים כדי לשטוף את החרוזים שלוש פעמים, ואז השהה מחדש את החרוזים במיליליטר אחד של הכרומטין המדולל, ודגר את הצינור למשך הלילה על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, הניחו את החרוזים על המדף המגנטי בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר הסרת התמיסה, השתמשו במיליליטר אחד של מאגר כביסה דל מלח כדי לשטוף את החרוזים פעמיים, ולאחר מכן השתמשו במאגר כביסה עתיר מלח כדי לשטוף את החרוזים פעם אחת.

לאחר שימוש במיליליטר אחד של מאגר כביסה ליתיום כלוריד כדי לשטוף את החרוזים פעם אחת, השתמש במיליליטר אחד של מאגר TE כדי לשטוף את החרוזים פעמיים. שאפו כדי להסיר היטב את מאגר הכביסה של TE. לאחר הפשרת דגימות הקלט, העבירו חמישה מיקרוליטר מכל אחד לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר, ובהמשך, התייחסו באופן דומה לדגימות השבב

הפוך את הקישור הצולב על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של שרף חילופי יונים של חמישה אחוזים ודגירה בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך ניעור כל שתיים-שלוש דקות. סובב ב-16,000 פעמים גרם למשך 30 שניות, והעביר בזהירות את הסופרנטנט לצינורות מיקרופוגה חדשים. הוסיפו שני מיקרוליטרים של 10 מיליגרם למיליליטר פרוטונאז K, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לעכל חלבונים ולשחרר DNA.

כדי לעצור את התגובה, דגרו בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, סובבו במהירות ב-16,000 פעמים גרם למשך 30 שניות, והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. לאחר ניקוי ה-DNA על פי פרוטוקול הטקסט, יש לדלל אחד עד עשרה במים, ולהשתמש בחמישה מיקרוליטר לכל תגובה כדי למדוד את שפע אתרי הקישור על ידי qPCR. נתח את הנתונים על פי פרוטוקול הטקסט.

עלי אריבידופסיס מכוסים בשכבות שעווה וטריכומות מעדיפות היווצרות בועות אוויר, שניהם מקשים על ריאגנטים צולבים לחדור לרקמת הצמח. מוצגות כאן דגימות שתילים צולבות שהיו מקושרות בוואקום כדי להגביר את יעילות הקיבוע. איור זה מדגים כי מספר מוגבר של מחזורי סוניקציה מקטין בהדרגה את הגודל הממוצע של ה-DNA בדגימות שבב, ומגיע להעשרה אופטימלית בטווח של 200 עד 600 זוגות בסיסים לאחר 20 עד 30 מחזורים, כפי שמודגם כאן.

כפי שניתן לראות באיור זה, ארבעה אזורים חשובים לוויסות השעתוק של לוקוס FT, גן אב של פריחה, נבחרו לניתוח. תוצאות השבב מראות כי חלבון ה-EBS שילב אחד מארבעת האזורים שנבדקו, רצף רגולטורי קרוב לאתר התחלת השעתוק של FT. לבסוף, בדיקות שבב שבוצעו באמצעות נוגדן המכוון נגד היסטון h3 אצטילציה בליזינים 9 ו-14, אשר מתואם עם כרומטין פעיל שעתוק, חשפו שפע גבוה יותר של H3K9/14ac ב-DBS מוטנטי לעומת צמחים מסוג בר בכל ארבעת המקטעים הגנומיים של FT שנבדקו, בהתאם לוויסות המוגבר שנצפה של גן מאסטר זה של פריחה במוטציה זו. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי.

ביצוע הליך זה, יחד עם אמצעים אחרים כמו ניתוח ביטוי גנים, יכול לתרום למענה על שאלות אחרות, כמו: מה התפקיד הביולוגי של קשירת החלבון ל-DNA? האם זה בהפעלה או הדחקה של שעתוק? ואילו שינויים בהיסטון קשורים?

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה של הצמח לחקור מצבי כרומטין בתאים הרדוקטיביים שלנו. וניתן להרחיב זאת למיני צמחים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח את הקישור של חלבון האריבידופסיס שלך המעניין ל-DNA in vivo.

אל תשכח שעבודה עם ריאגנטים של 2-מתוקסיאתנול, פורמלדהיד או סוניקטור, פתוגנים ומוטציות גזע עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון בגדי מגן, כפפות או מיגון שמיעה בעת השימוש בהליך זה.