פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

המטרה הכוללת של רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית זו היא להבדיל בין המיוגלובין של יונקים ימיים לזה של כלבי ים ובעלי חיים אחרים. שיטה זו יכולה לספק סינון מהיר ומיידי, ובכך לרסן את הסחר והצריכה הבלתי חוקיים שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לראות תוצאה מוצלחת ישירות תוך חמש עד עשר דקות לאחר הומוגניזציה של 03 גרם שריר, עם ספציפיות ורגישות יוצאות דופן.

כך ששיטה זו יכולה לספק זיהוי מהיר של בשר יונקים בשטח. ניתן ליישם אותו גם על בשר אחר כגון בשר סוס, או חזיר. כדי לתכנן פפטידים סינתטיים להעלאת נוגדנים חד-שבטיים עם תגובתיות כלפי המיוגלובין של יונקים ימיים, מנותחים רצפי חומצות האמינו של אזורים תגובתיים אנטיגניים של מיוגלובין מבעלי חיים שונים.

התחל בשליפת רצפי חומצות האמינו של מיוגלובין מטונה, עוף, יען, יונקים ביתיים, כלבי ים ו-18 מינים של יונקים ימיים. לאחר מכן, יישר את הרצפים באמצעות התוכנה המתאימה. הפעל את סייר היישור על-ידי בחירה באפשרות יישור עריכה/בנייה בסרגל ההפעלה.

בחר Create New Alignment ולחץ על OK. יופיע דיאלוג ששואל, האם אתה בונה יישור DNA או רצף חלבון? לחץ על הכפתור שכותרתו חלבון, בחר נתונים פתח אחזור רצפים מקובץ, ובחר קובץ רצף. בחר בפקודת התפריט ערוך בחר הכל כדי לבחור את כל האתרים עבור כל רצף בסל הנתונים ליצירת יישור רצפים מרובים.

בחר Alignment Align by ClustalW מהתפריט הראשי. בחר BLOSUM כמטריצת משקל החלבון ולאחר מכן לחץ על כפתור אישור. השלב השלישי הוא ניתוח יישור הרצף.

התמקדו בחמישה אתרים תגובתיים אנטיגניים ומצאו את השבר שמור בקרב יונקים ימיים. כוכבית מסמלת קונצנזוס ביישור ומציינת מיקום שיש בו שאריות בודדות שנשמרו במלואן. נמצאו שני שברים שהשתמרו ביונקים ימיים.

לאחר מכן מסנתזים שברי רצף מועמדים ומשמשים להעלאת נוגדנים חד-שבטיים. התחל הליך זה על ידי קביעת ה-pH האופטימלי עבור תמיסת הזהב הקולואידית המוגדרת כ-pH המינימלי השומר על הנוגדן החד-שבטי ותערובת תמיסת הזהב הקולואידית בצבע אדום למשך שעתיים. הוסף 0.15 מיקרוגרם של נוגדן חד שבטי לזיהוי מטוהר ל-100 מיקרוליטר של תמיסת זהב קולואידית עם ערכי pH המשתנים בין חמישה לתשעה.

למטרות הדגמה זו, נבדקים pH שש ו- pH שמונה. pH שמונה נחשב ל- pH האופטימלי בשלב אופטימיזציה זה. לאחר מכן, קבע את הריכוז האופטימלי של הנוגדן החד-שבטי על ידי הוספת כמויות שונות של נוגדן חד שבטי מטוהר ל-100 מיקרוליטר של תמיסת זהב קולואידית ב-pH שמונה.

הריכוז האופטימלי, שהוא שישה מיקרוגרם למיליליטר במחקר זה, ישמור על צבע התערובת אדום ללא משקעים שחורים. בהתבסס על התוצאות משלבי האופטימיזציה, הוסף 60 מיקרוגרם של נוגדן חד שבטי לזיהוי מטוהר טיפה ל-10 מ"ל של תמיסת זהב קולואידית. תחליב את התערובת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות.

הוסף לתערובת שני מיליליטר של תמיסת BSA 5% ב-PBS והתחלב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להפחית הפרעות ברקע. צנטריפוגה את התערובת בחום של 10, 000 פעמים גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט עם נוגדן לא מצומד והשהה את הגלולה המתקבלת ב-4 מ"ל של PBS-T המכיל 1% BSA ו-0.1% Tween-20.

חזור על הצנטריפוגה וההשעיה פעם או פעמיים. השעו את המשקעים הסופיים ב-1 מ"ל PBS-T ואחסנו בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. גרפיקה של עיצוב רצועת החיסון מוצגת כאן.

מידות הקרטון, הרפידות וקרום הניטרוצלולוזה מפורטות בטקסט הפרוטוקול. כדי להאריך את חיי האחסון, יש להכין ולהרכיב את רצועות החיסון בתנאי סביבה מעבדתיים עם לחות נמוכה. השתמש במיקרופיפטה כדי להוסיף את תמיסת הנוגדנים החד-שבטית הקולואידית עם תווית זהב לכרית המצומד כדי להרוות אותה ולאחר מכן יבש את הרפידה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפני ההרכבה.

לאחר שהרפידה המצומדת יבשה, השתמש בסרט דו צדדי כדי להדביק תחילה את קרום הניטרוצלולוזה על הקרטון. באמצעות מדפסת אימונוסטריפ, הפץ את הנוגדן החד-שבטי הספציפי הלוכד אנטיגן ואת ה-IGG המהיר נגד עכבר על אזור הבדיקה ואזור הבקרה, בהתאמה, על קרום הניטרוצלולוזה. שמור על מרחק של יותר מחמישה מילימטרים בין שני האזורים.

לאחר מכן הדביקו את הכרית המצומדת בצד אחד של קרום הניטרוצלולוזה, ואת כרית הספיגה בצד השני, וחופפים את הרפידות מכל צד בכשני מילימטרים. הניחו את כרית הדגימה מעל כרית המצומד בשני מילימטרים והדביקו אותה על הקרטון. השתמש בחותך נייר כדי ליצור רצועות ברוחב שישה מילימטרים.

אורזים את הרצועות בשקית נייר אלומיניום עם חומר ייבוש ושומרים בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. להכנת דגימה לבדיקת התגובתיות הצולבת, הוסף 1 מ"ל PBS המכיל 0.1% BSA ל-0.03 גרם שריר גולמי. והשתמש במקל במבוק או במוט שחיקה כדי להומוגניזציה של הדגימה.

החזק את רצועת החיסון בקצה הנגדי לאזור הבדיקה וטבל את חלק כרית הדגימה בדגימה למשך חמש עד עשר דקות. התבונן בתוצאה ישירות. בדוק דגימות שרירים שונות בשלוש עותקים.

קו בדיקת ה-T נועד להראות אות חיובי כאשר שני הנוגדנים החד-שבטיים מזהים מיוגלובין ימי. מכיוון שניתן לזהות את המיוגלובין מבעלי חיים שאינם יונקים רק על ידי אחד משני הנוגדנים החד-שבטיים הללו, קו הבדיקה מראה תוצאה שלילית כאשר דגימות שריר מבעלי חיים אחרים נבדקות. קו הבקרה C צריך תמיד להראות תוצאה חיובית מכיוון ש-IGG מהיר נגד עכבר קושר את נוגדן הזיהוי הקולואיד בעל תווית הזהב.

תוצאה כושלת בקו הבקרה מצביעה על כך שאיכות החומרים ברצועה ירודה. ניתוח דם מערבי באמצעות סופרנטנטים היברידיים מראה כי הנוגדן החד-שבטי CGF5H9 מזהה יונקים ימיים ויונקים אחרים כרצועה מוכתמת אחת במשקל מולקולרי חזוי של כ-17kDa. לוויתן המינקה המצוי מראה פס חיוור יחסית ללהקות של יונקים ימיים אחרים.

להקות נעדרות לטונה, כלבי ים ועוף. ואילו רצועה בסביבות 50kDa נצפית לחזיר. תוצאות זהות מתקבלות על ידי ניתוח דם נקודתי.

למרות שניתוח דם מערבי באמצעות הנוגדן החד-שבטי CSF1H13 מראה מספר רצועות לא ספציפיות לחזיר וטונה, CSF1H13 ספציפי מאוד מכיוון שהוא מגיב רק עם יונקים ימיים. ולחותם יש פס במשקל מולקולרי חזוי של כ-17kDa. תוצאות זהות מתקבלות על ידי ניתוח דם נקודתי.

תוצאות מ-ELISA עקיף של תמציות שרירים ממינים שונים באמצעות CGF5H9 מטוהר מדגימות אותות חיוביים עבור פרה, עז, כלב, ארנב ויונקים, אות חיובי חלש לחזיר ואותות שליליים לטונה, עוף וכלבי ים. CSF1H13 מראה זיקה גבוהה ליונקים ימיים וכלבי ים. שני הנוגדנים החד-שבטיים יכולים להגיב בעוצמה עם כל ארבעת מיני היונקים המגיעים ממשפחות שונות, מה שמעיד על תגובתיות רחבה שלהם למינים שונים של יונקים ימיים.

הספציפיות של פס הזהב הקולואידי החיסוני מודגמת על ידי התוצאות המייצגות הללו. השימוש בדגימות שריר שאינן יונקים מביא רק לרצועה אחת בקו הבקרה. עם זאת, כאשר משתמשים בדגימות שריר ימיות, רצועות האות קיימות הן בקו הבדיקה והן בקו הבקרה.

לאחר השליטה, הכנת הנוגדנים המסומנים ובניית הרצועות הזו יכולה להיעשות תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לתכנן את הפפטיד בקפידה. השתמש במספר שיטות לבדיקת נוגדנים חד שבטיים מתאימים.

והשתמש באיכות גבוהה של זהב קולואידי להכנת נוגדנים מסומנים. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח DNA מבוסס PCR על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מין היונקים ומהיכן הוא הגיע. הנוגדן החד-שבטי CSF1H13 שהוא חזק ומפגין זיקה ליונקים ימיים בלבד יכול לשמש בפורמטים שונים של ELISA המציעים הזדמנויות רבות אחרות לחקר ההיבטים הביולוגיים, הפיזיולוגיים והכימיים של מיוגלובין ביונקים ימיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח נוגדנים חד שבטיים ספציפיים ולאחר מכן ליישם אותם על רצועת בדיקה מהירה.