פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

המטרה הכללית של רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זו מזהב קולואידלי היא להבדיל בין המיוגלובין של דומעות (cetaceans) לזה של כלבי ים ובעלי חיים אחרים. שיטה זו יכולה לספק סריקה מהירה ובאתר עבור בשר דומעות, ובכך לסייע בבלימת הסחר והצריכה הבלתי חוקיים שלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להבחין בתוצאה מוצלחת ישירות תוך חמש עד עשר דקות לאחר הומוגניזציה של 0.3 gram של שריר, עם סגוליות ורגישות יוצאות דופן.

לפיכך, שיטה זו יכולה לספק זיהוי מהיר של בשר יונקיים ימיים בשטח. ניתן ליישם אותה גם על סוגי בשר אחרים, כגון בשר סוסים או בשר חזיר. כדי לתכנן פפטידים סינתטיים להעלאת נוגדנים מונוקלונליים בעלי תגובהיותToward המיוגלובין של יונקיים ימיים, מנתחים את רצפי חומאות האמינו של אזורים אנטיגניים תגובתיים של מיוגלובין מבעלי חיים שונים.

התחילו בשליפת רצפי חומצות האמינו של מיוגלובין מ-GenBank עבור טונה, תרנגולת, בת יענה, יונקים ביתיים, כלב ים ו-18 מינים של דומחים. לאחר מכן, יישרו את הרצפים באמצעות התוכנה המתאימה. הפעילו את ה-Alignment Explorer על ידי בחירה ב-Align Edit/Build Alignment בסרגל ההפעלה.

בחרו ב-Create New Alignment, ולחצו על OK. יופיע תיבת דו-שיח השואלת האם אתם בונים יישור רצפי DNA או חלבון? לחצו על הכפתור המסומן Protein, בחרו ב-Data Open Retrieve sequences from File, ובחרו את קובץ הרצפים. בחרו בפקודת התפריט Edit Select All כדי לבחור את כל האתרים עבור כל רצף במערך הנתונים לצורך יצירת יישור רצפים מרובה.

בחר Align by ClustalW תחת Alignment מהתפריט הראשי. בחר ב-BLOSUM כמטריצת המשקלים של החלבון ולאחר מכן לחץ על כפתור ה-OK. השלב השלישי הוא ניתוח יישור הרצפים.

התמקדו בחמישה אתרים תגובתיים אנטיגניים ומצאו את הפרגמנט השמור בקרב דג-יונקים. כוכבית מסמלת קונסנסוס ביישור ומצביעה על מיקום בעל שארית בודדת השמורה באופן מלא. נמצאו שני פרגמנטים שמורים בדג-יונקים.

לאחר מכן מסנתזים מקטעי רצפים מועמדים ומשתמשים בהם להעלאת נוגדנים מونوקלונליים. התחילו הליך זה בקביעת ה-pH האופטימלי עבור תמיסת הזהב הקולואידלי, המוגדר כערך ה-pH המינימלי השומר על צבע אדום של תערובת הנוגדן המונוקלונלי ותמיסת הזהב הקולואידלי למשך שעתיים. הוסיפו 0.15 µg של נוגדן מונוקלונלי מזוקק לזיהוי ל-100 µL של תמיסת זהב קולואידלי עם ערכי pH הנעים בין חמישה לתשעה.

לצרכי הדגמה זו, נבדקו pH 6 ו-pH 8. pH 8 נחשב ל-pH האופטימלי בשלב אופטימיזציה זה. לאחר מכן, קבעו את הריכוז האופטימלי של הנוגדן המונוקלונלי על ידי הוספת כמויות שונות של נוגדן מונוקלונלי מזוקק לגילוי ל-100 µL של תמיסת זהב קולואידי ב-pH 8.

הריכוז האופטימלי, אשר במחקר זה הוא שישה מיקרוגרם למילליליטר, ישמור על צבע אדום של התערובת ללא משקע שחור. בהתבסס על התוצאות משלבי האופטימיזציה, הוסיפו בטפטוף 60 מיקרוגרם של נוגדן מונוקלונאלי מזוקק לזיהוי ל-10mL של תמיסת זהב קולואידי. אמולסו את התערובת בעדינות בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות.

הוסיפו שתי מיליליטר של תמיסת 5%BSA ב-PBS לתערובת ואמולסו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות כדי להפחית רעשי רקע. סובבו את התערובת בצנטריפוגה ב-10,000 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסבוב, הסירו בזהירות את העלייה (supernatant) המכילה נוגדן לא מצומד והשאיבו את המשקע שהתקבל ב-4mL של PBS-T המכיל 1%BSA ו-0.1%Tween-20.

חזור על הצנטריפוגציה וההסספנסיה פעם אחת או פעמיים. הסספה את המשקעים הסופיים ב-1mL של PBS-T ואחסן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש. איור של תכנון פס רצועת החיסון מוצג כאן.

ממדי הקרטון, הרפידות וממברנת הניטרוסלולוז מפורטים בטקסט של הפרוטוקול. כדי להאריך את משך האחסון, יש להכין ולהרכיב את פסי החיסון בתנאי סביבה של מעבדה בעלת לחות נמוכה. השתמש במיקרופיפט כדי להוסיף את תמיסת הנוגדן המונוקלונלי המסומן בננו-חלקיקי זהב קולואידי לרפידת הצמידה כדי להרוות אותה, ולאחר מכן ייבש את הרפידה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת לפני ההרכבה.

לאחר שפד התג (conjugate pad) התייבש, השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי להדביק תחילה את ממבנה הניטרוסלולוז על גבי הקרטון. באמצעות מדפסת immunostrip, פזרו את הנוגדן החד-סגולי הספציפי ללכידת האנטיגן ואת ה-IGG נוגד-עכבר המהיר על גבי אזור הבדיקה (test zone) ואזור הבקרה (control zone), בהתאמה, על ממבנה הניטרוסלולוז. שמרו על מרחק של יותר מחמישה מילימטרים בין שני האזורים.

לאחר מכן, הדביקו את רפידת הצמידה (conjugate pad) בצד אחד של ממбраסת הניטרוסלולוז, ואת רפידת הספיגה בצד השני, כך שהרפידות יחפפו לממב soon בערך שני מילימטרים מכל צד. הניחו את רפידת הדגימה מעל רפידת הצמידה בחפיפה של שני מילימטרים והדביקו אותה על גבי הקרטון. השתמשו בחתרני נייר כדי ליצור רצועות ברוחב שישה מילימטרים.

ארוזו את הפסים בשקיות נייר אלומיניום עם חומר מייבש ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius עד לשימוש. להכנת דגימה לבדיקת תגובתיות צולבת, הוסיפו 1mL של PBS המכיל 0.1%BSA ל-0.03 גרם של שריר גולמי. השתמשו במקל במבוק או במוט ריסוק כדי להומוגניзировать את הדגימה.

החזיקו את רצועת החיסון מהקצה opposite לאזור הבדיקה וטבלו את חלק פד הדגימה בתוך הדגימה למשך חמש עד עשר דקות. צפו בתוצאה באופן ישיר. בצעו את הבדיקה על דגימות שריר שונות בשלוש חזרות.

קו הבדיקה (T test line) נועד להראות אות חיובי כאשר שני הנוגדנים המונוקלונליים מזהים מיוגלובין של דו-חיוביים (cetacean). מכיוון שמיוגלובין מבעלי חיים שאינם דו-חיוביים יכול להיות מזוהה על ידי רק אחד משני הנוגדנים המונוקלונליים הללו, קו הבדיקה מראה תוצאה שלילית כאשר נבדקים דגימות שריר מבעלי חיים אחרים. קו הבקרה (C control line) אמור תמיד להראות תוצאה חיובית, מכיוון ש-anti-mouse IGG מהיר נקשר לנוגדן הגילוי המסומן בזהב קולואידאלי.

תוצאה כושלת בקו הבקרה מעידה על כך שאיכות החומרים על הרצועה ירודה. אנליזה של דם בשיטת Western blood באמצעות על-נוזלים (supernatants) של היברידומות מראה כי הנוגדן החד-סגמי CGF5H9 מזהה דג-ממיים ויונקים אחרים כפס צבוע יחיד במשקל מולקולרי חזוי של כ-17kDa. לווייתן המינקה הנפוץ מראה פס חלש יותר באופן יחסי מהפסים של דג-ממיים אחרים.

פסים אינם נראים עבור טונה, כלב ים ועוף. לעומת זאת, פס בערך של 50kDa נצפה עבור חזיר. תוצאות זהות התקבלו בניתוח דם בשיטת dot blood.

אף על פי שניתוח דם מערבי באמצעות הנוגדן המונוקלונלי CSF1H13 מראה רצועות לא ספציפיות מרובות עבור חזיר וטונה, CSF1H13 הוא ספציפי ביותר מכיוון שהוא מגיב רק עם יונקי מים. ובכלב ים קיימת רצועה במשקל מולקולרי חזוי של כ-17kDa. תוצאות זהות מתקבלות בניתוח דם בשיטת dot blood.

תוצאות של ELISA עקיף של תכלילי שריר ממינים שונים באמצעות CGF5H9 מטוהר מראות אותים חיוביים עבור פרה, עז, כלב, ארנב ויונקי מים, אות חיובי חלש עבור חזיר, ואותים שליליים עבור טונה, תרנגול וכלב ים. CSF1H13 מראה זיקה גבוהה כלפי יונקי מים וכלבי ים. שני הנוגדנים המונוקלונליים יכולים להגיב בעוצמה לכל ארבעת מיני יונקי המים השייכים למשפחות שונות, מה שמעיד על תגובתיות רחבה למינים מגוונים של יונקי מים.

הסגוליות של רצועת הזהב הקולואידי האימונולוגית מוצגת בתוצאות מייצגות אלו. שימוש בדגימות שריר שאינן מיונקים מימיים מוביל להופעת פס בודד בלבד בקו הבקרה. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בדגימות שריר של יונקים מימיים, פסי אות מופיעים הן בקו הבדיקה והן בקו הבקרה.

לאחר השליטה בשיטה, הכנת נוגדנים מסומנים ובניית הרצועות יכולים להתבצע תוך ארבע שעות, במידה והדבר נעשה כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לתכנן את הפפטיד בקפידה. השתמשו במספר שיטות לסריקה של נוגדנים מונוקלונאליים מתאימים.

יש להשתמש בזהב קולואידלי באיכות גבוהה להכנת נוגדנים מסומנים. לאחר ביצוע הליכים אלו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ניתוח DNA מבוסס PCR, כדי להשיב על שאלות נוספות, כגון זן היונקה הימית ומ מקורה. ניתן להשתמש בנוגדן המונוקלונלי CSF1H13, החזק ומגלה זיקה רק ליונקים ימיים, בפורמטים שונים של ELISA המציעים הזדמנויות רבות נוספות לחקר ההיבטים הביולוגיים, הפיזיולוגיים והכימיים של המיוגלובין ביונקים ימיים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי הפיתוח של נוגדנים מונוקלונאליים ספציפיים והיישום העוקב שלהם על פסי בדיקה מהירה.