כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להכין כרומוזומים צמחיים המתאימים לפלואורסצנטיות בטכניקת הכלאה של C שני באמצעות בדיקות DNA בעותק יחיד וגבוה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בציטוגנטיקה ובחקר הגנום, כגון זיהוי סידורים מחדש של כרומוזומים, סידור סמנים גנטיים על כרומוזומים וניתוח השוואתי בין מינים שונים. היתרון העיקרי בהליך זה הוא שהכנת ממרחי הכרומוזומים הופכת למהירה, קלה ויעילה.

ניתן לאחסן תרחיף תאים במינוס 20 מעלות עד חודשיים ולהשתמש בו להכנת כרומוזומים בעת הצורך. הרעיון הזה של שיטה זו עלה לראשונה כאשר ראינו שהאיכות ומספר הכרומוזומים המתאימים גדלו באופן דרמטי בימי אדם להנביט 10 עד 20 זרעי שעורה על שתי שכבות של נייר סינון לח בצלחת פטרי בתנאי חושך במשך יומיים בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס לאחר יומיים. חותכים שורשים נמרצים באורכים של סנטימטר עד שני סנטימטרים מהזרע באמצעות סכין גילוח.

לאחר מכן, הכינו מים קרים כקרח על ידי הנחת בקבוק זכוכית של 500 מיליליטר המכיל מי ברז קרים למי קרח כתושים. אווררו את המים הקרים כקרח וטבלו את קצות השורש למשך 20 שעות כדי להגביר את תדירות תאי המטאפאזה. העבירו את השורשים ממים ל -50 מיליליטר אתנול של קיבוע חומצה אצטית כדי לתקן אותם בטמפרטורת החדר למשך יומיים לאחר הקיבוע.

שטפו 10 עד 20 שורשים עם 30 מיליליטר מי ברז קרים כקרח ברמקול זכוכית של 50 מיליליטר למשך חמש דקות פעמיים. העבירו את השורשים בזה אחר זה ל -30 מיליליטר של מאגר ציטראט בעזרת מלקחיים. שטפו את השורשים על ידי ניעור רמקול הזכוכית למשך חמש דקות פעמיים.

לאחר מכן הניחו את השורשים על נייר פילטר כדי להסיר את הנוזל לחלוטין תחת מיקרוסקופ. חותכים את הרקמה הלא מריסטמטית הלא רצויה בעזרת סכין גילוח. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא קביעת זמן העיכול הנכון שעשוי להשתנות בין מינים שונים.

כאן מודגרים עד 20 קצות שורש במיליליטר אחד של תערובת אנזימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-50 דקות. כדי לרכך את רקמת הצמח בכוס שעון תחת מיקרוסקופ, הסר את האנזים על ידי פיפטינג ושטוף את קצות השורש על קרח עם חמישה מיליליטר של 0.01 מולרי ציטראט כדי להחליף את האנזים השיורי. המשיכו לשטוף את קצות השורש עם מיליליטר אחד של 96% אתנול פעמיים בזהירות באותה זכוכית שעון.

לאחר מכן החלף את האתנול ב -10 עד 15 מיקרוליטר של קיבוע טרי שהוכן לכל קצה שורש. העבירו את קצות השורש יחד עם הקיבוע לצינור של שני מיליליטר ופוררו את גבעולי השורש בעזרת מחט חיתוך או מלקחיים. הקש על הצינור 20 פעמים כדי להשעות מחדש את התאים ולקבל תרחיף תאים.

לאחר מכן הניחו שתיים עד שלוש שכבות של נייר טישו ספוג במים על פלטה חמה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס. טבלו את המגלשות המיקרוסקופיות בקרח, מי ברז קרים במקרר למשך 30 דקות. לאחר מכן הניחו את השקופיות על גבי נייר הטישו הלח, פיפטה שבעה עד 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים, וזרקו אותו ממרחק של 20 סנטימטרים על המגלשה המקוררת המונחת על הפלטה החמה.

עקוב אחר זה עם 10 מיקרוליטר של תערובת אתנול חומצה אצטית באותו מקום כמו תרחיף התאים בשקופית, ושמור את השקופית על הפלטה החמה. לאחר שתי דקות, הניחו את השקופית על הפלטה החמה ללא הרקמה הרטובה ותנו לה להתייבש דקה נוספת. בדוק את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פנים כדי לשלוט באיכות התפשטות הכרומוזומים.

השתמש במגלשות באותו יום או אחסן אותן על ידי טבילה באתנול 96% בצנצנת קופלין במינוס 20 מעלות צלזיוס כדי לטפל במגלשות לפני הדגים. מניחים את השקופיות בצנצנת קופין המכילה 50 מיליליטר של שני XSSC למשך חמש דקות בעזרת מלקחיים. מעבירים את השקופיות לצנצנת קופלן המכילה 50 מיליליטר של חומצה אצטית 45% למשך שלוש עד 10 דקות.

לאחר מכן, העבירו את השקופיות לצנצנת קופלן המכילה 50 מיליליטר של שני XSSC למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של פורמלדהיד 4%, וטבלו את השקופיות למשך 10 דקות כדי לתקן את הכרומוזומים. הסר את הפורמלדהיד על ידי שטיפת השקופיות שלוש פעמים למשך ארבע דקות כל אחת בצנצנת קופלין המכילה 50 מיליליטר של שני XSSC.

לאחר מכן ייבשו את המגלשות למשך שתי דקות בסדרה של 70%90% ו-100% אתנול, וייבשו את המגלשות במצב אנכי. עבור כל שקופית, הכינו תמיסת הכלאה של 20 מיקרוליטר באמצעות 10 מיקרוליטר של אמיד בצורה דה-יונית, חמישה מיקרוליטר של ארבעה מאגר הכלאה X, שלושה מיקרוליטר של הגשושית ושני מיקרוליטרים של מים חופשיים D ns. הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת הכלאה לכל שקופית וכסה בהחלקת כיסוי בגודל 24 על 32 מילימטר.

לאחר איטום החלקת הכיסוי עם מגלשות דנטור מלט גומי עם בדיקות בו זמנית ב 80 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות על פלטה חמה, העבירו את המגלשות לתא לח ודגרו אותן ב -37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הימנע מאור, הסר את החלקות הכיסוי על ידי שטיפת השקופיות בצנצנת צימוד עם שני XSSC. לאחר מכן מניחים את השקופיות בצנצנת קופלן המכילה 55 עד 60 מעלות צלזיוס, שני XSSC ודוגרים למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הניחו את השקופיות בשני XSSC בצנצנת קופלן למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. בטוח. ייבשו את המגלשות בצנצנת קופלן למשך שתי דקות בסדרה של 70%90% ו-100% אתנול. אוויר. יבש את השקופיות והכתים עם dappy במדיום הרכבה של אנטיפה, הימנע מאור עז.

נתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי. בחירת המסנן תלויה בפלואורוכרום המשמש לתיוג בדיקה במידת הצורך. אחסן את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס בתנאי חושך עד שנה.

ממרחי מטפאזה מיטוטיים שהוכנו בשיטת הכנת כרומוזומים לירידה יבשה באוויר מהיר מוצגים כאן. ניתוח הדגים בוצע באמצעות רצפים חוזרים ונשנים ורצפים של עותק בודד. התמונות התקבלו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי עם סט מסננים המאפשרים עירור של רביעיות פלואורו מתאימות ונלכדו על ידי מצלמת מונוכרום CCD בעלת רגישות גבוהה.

ניסוי הדגים על כרומוזומי מטפאזה מיטוטיים של מטמון וולגרי באמצעות בדיקה של עותק יחיד וחמישה S-R-D-N-A חשפו אותות מובהקים ואיכותיים. הכלאה של מיקרו-לוויין CTT 10 CTT על הכרומוזומים של הורדי ו-BULBUS הביאה לדפוס ספציפי ומובחן. ניסוי הדגים על כרומוזומי מטפאזה מיטוטיים של סדרת סאלה באמצעות PSC 119 שני בדיקות הביא לאותות ספציפיים ואיכותיים.

היתרונות הברורים של גישה זו הם מפוזרים היטב, לא פגומים וכרומוזומי מטפאזה רבים המשמשים כתנאי מוקדם מושלם לניתוח דגים מוצלח. לאחר המאסטר, ניתן לבצע הליך זה תוך פחות משעתיים אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את האיכות הגבוהה של מרחב כרומוזום מטא פנים מיטוטי עבור דגים IDE ולשעבר , גובה יכול להיות מסוכן ביותר, תמיד להשתמש בגרפים ובמכסה המנוע בעת ביצוע הליכים אלה.