Name: כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: למדו שיטת הכנת כרומוזומים מהירה ביבוש אוויר לצמחים המתאימה לזיהוי FISH בבדיקות DNA. שיטה זו משפרת את איכות וכמות הכרומוזומים לניתוח ציטוגנטי ומחקר גנום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מקרב לב ל-DFG על התמיכה הכספית (HO 1779/21-1) וכן לקטרין קומקה וד"ר וייט שוברט (IPK, Gatersleben) על הייעוץ הטכני.

1. הכנת כרומוזום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נביטת זרעים וקיבעון של טיפים שורש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנבוט זרעי שעורה 10-20 בשתי שכבות של נייר סינון לח בצלחת פטרי בתנאים חשוכים במשך 2 ימים ב22-24 מעלות צלזיוס. חותך את שורשים נמרצים עם האורך של 1-2 סנטימטר מהזרע באמצעות סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מים קרים כקרח על ידי הצבת בקבוק זכוכית 500 מיליליטר המכיל מים ברז קר לקרח מים מרוסקים. לאוורר את המים קרים כקרח ולטבול טיפים שורש במשך 20 שעות כדי להגביר את התדירות של תאי metaphase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השורשים ממים 50 מיליליטר של אתנול: חומצה אצטית (3: 1) מקבע לתקן אותם על RT עבור 2 ימים. שורשי חנות באתנול מוכן טרי: חומצה אצטית (3: 1) מקבע על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש עד שנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול כביסה ואנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את השורשים 10-20 במים ברז קר כקרח 30 מיליליטר במשך 5 דקות פעמיים באמצעות כוס זכוכית 50 מיליליטר. השתמש במיקרוסקופ דו עיני. העבר את שורשים אחד אחד לתוך30 מיליליטר 0.01 מאגר M ציטרט (0.01 חומצת לימון + M 0.01 M נתרן ציטרט, pH 4.8) באמצעות מלקחיים ולשטוף ידי טלטול כוס הזכוכית למשך 5 דקות פעמיים. מניחים על נייר שורשי מסנן כדי להסיר את הנוזל לחלוטין ובאמצעות סכין גילוח לחתוך את הרקמה שאינה meristematic לא רצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עד 20 טיפים שורש בתערובת אנזים 1 מיליליטר ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ -50 דקות כדי לרכך את רקמות הצמח (טבלה 1) בזכוכית שעון. תערובת אנזים מכילה 0.7% R10 cellulase, cellulase 0.7%, pectolyase 1% וcytohelicase 1% בדילול מלא 0.01 M חיץ ציטרט. אחסן את תערובת האנזים ב -20 ° C ושימוש חוזר עד חמש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האנזים על ידי pipetting ולשטוף את הטיפים שורש על קרח עם 5 מיליליטר 0.01 M חיץ ציטראט פעמיים כדי להחליף את האנזים שיורית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שריית שורש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים שורש לשטוף עם 1 מיליליטר אתנול 96% פעמיים בזהירות באותו זכוכית השעון. החלף אתנול עם מקבע (75% חומצה אצטית: 25% אתנול) מוכן טרי. השתמש 10-15מקבע μl לקצה שורש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים העברת שורש יחד עם מקבע לתוך צינור 2 מיליליטר וmeristems השורש להתפורר עם מחט לנתח או מלקחיים. הקש הצינור 20 פעמים מחדש להשעות תאים להשיג השעיה תא. אחסן את ההשעיה התא בC עד -20 ° עד חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרור של ההשעיה התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 2-3 שכבות של רקמת נייר ספוג מים על פלטה חשמלית על 50 מעלות צלזיוס. לטבול את השקופיות מיקרוסקופיות במים ברז קר כקרח במקרר למשך 30 דקות. ומקום מחליק על גבי רקמת נייר הלחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 7-10 μl של השעיה תא ושחרר אותו ממרחק של 20 סנטימטרים לשקופית מקוררת מונחת על הצלחת החמה. פיפטה 10 μl של תערובת חומצה אצטית-אתנול באותו המקום כמו השעיה תא בשקופית ולשמור את השקופית על הצלחת החמה למשך 2 דקות נוספות. מניחים את השקף על הצלחת החמה ללא רקמות הרטובות ולתת לו להתייבש במשך 1 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקרת איכות וstoragדואר של שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו שקופיות באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד לשליטה באיכות התפשטות כרומוזום. השתמש בשקופיות או באותו היום או בחנות על ידי טבילה ב -96% אתנול בצנצנת Coplin ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול מקדים של שקופיות לפני FISH; כל הצעדים נעשים בRT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מקום בצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 2x SSC (20x SSC מכיל 3 M NaCl ו -300 ציטראט Trisodium מ&quot;מ) במשך 5 דקות. בעזרת מלקחיים, שקופיות העברה לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 45% חומצה אצטית עבור 3-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של 2x SSC במשך 10 דקות. העברת שקופיות לצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר של פורמלדהיד 4% (ב2x SSC) ושקופיות לטבול במשך 10 דקות לתקן כרומוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פורמלדהיד על ידי שטיפת השקופיות 3 פעמים במשך 4 דקות כל אחד, בצנצנת Coplin המכילה 50 מיליליטר 2x SSC. מייבשים שקופיות בצנצנת Coplin למשך 2 דקות בסדרה של 70%, 90% ו 100% אתנול, בהתאמה ומגלשות יבשות באנכימַצָב. </li></ol></li></ol> 2. פלורסנט באתרו הכלאה (דגים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל שקופית, להכין פתרון הכלאה של 20 μl בסך הכל משתמש 10 μl של פוראמיד deionized, 5 μl של חיץ הכלאת 4x (200 חיץ μl מכיל 80 μl 20x SSC, 8 μl 1 M טריס- HCl pH 8.0, 1.6 μl 0.5 M EDTA, 11.2 μl 10 מיקרוגרם / μl זרע סלמון וללא מים DNase 99.2 μl), 3 μl של החללית ו -2 μl מים ללא DNase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון הכלאה לכל שקופית וכיסוי עם כיסוי להחליק 24 x 32 מ&quot;מ ולעצור את הכיסוי להחליק עם מלט גומי. לפגל שקופיות עם בדיקות בו זמנית על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות על פלטה חשמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות לחדר לח ודגירת שקופיות ב 37 מעלות CO / אור הימנעות N. הסר התלושים לכסות על ידי שטיפת השקופיות בצנצנת Coplin עם 2x SSC. מגלשות מקום בצנצנת Coplin המכילה 55-60 מעלות צלזיוס 2x SSC ודגירה של 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות ל2x SSC בצנצנת Coplin למשך 2 דקות על RT. מייבשים שקופיות בצנצנת Coplin למשך 2 דקות בסדרה של 70%, 90% ו 100% אתנול, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש השקופיות וcounterstain עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) בantifade הרכבה בינוני, להימנע מאור חזק. </li></ol> 3. מיקרוסקופי ניתוח ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. הבחירה של מסנן תלוי בfluorochrome משמש לתיוג בדיקה. במידת צורך, שקופיות חנות ב 4 ° C בתנאים חשוכים עד שנה. </li></ol>

<ol><li>Geber, G., Schweizer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+heterochromatin+differentiation+in+Sinapis+alba+%28Cruciferae%29+using+a+simple+air-drying+technique+for+producing+chromosome+spreads%5BTitle%5D)+AND+%22Pl+Syst+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads.</a> Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).</li>
<li>Andras, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drop-spreading+technique+to+produce+cytoplasm-free+mitotic+preparations+from+plants+with+small+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes.</a> Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).</li>
<li>Rothfels, K. H., Siminovitch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+air-drying+technique+for+flattening+chromosomes+in+mammalian+cells+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro.</a> Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).</li>
<li>Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+preparation+of+plant+chromosomes+for+high-resolution+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy.</a> Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).</li>
<li>Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+fluorescence+in+situ+hybridization+signal+detection+in+maize+using+directly+labeled+probes+produced+by+high+concentration+DNA+polymerase+nick+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation.</a> Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).</li>
<li>Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy+%27SteamDrop%27+method+for+high+quality+plant+chromosome+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation.</a> Mol. Cytogenet. 7, 21(2014).</li>
<li>Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+chromosome+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Dynamics of chromosome spreading.</a> Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synteny+between+Brachypodium+distachyon+and+Hordeum+vulgare+as+revealed+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH.</a> Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).</li>
<li>Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+painting+using+repetitive+DNA+sequences+as+probes+for+somatic+chromosome+identification+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).</li>
<li>Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+cell+synchronization+in+plant-roots+by+hydroxyurea+and+amiprophos-methyl+or+colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine.</a> Genome. 36 (2), 387-390 (1993).</li>
<li>Kim, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+karyotyping+of+sorghum+by+in+situ+hybridization+of+landed+BACs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs.</a> Genome. 45 (2), 402-412 (2002).</li>
<li>Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+physical+mapping+with+barley+BAC+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FISH physical mapping with barley BAC clones.</a> Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).</li>
<li>Aliyeva-Schnorr, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+mapping+with+centromeric+BAC+contigs+shows+that+this+recombination-poor+region+comprises+more+than+half+of+barley+chromosome+3H%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H.</a> Plant J. 84, 385-394 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניסוי הכנת כרומוזום בוצע באמצעות שורשים צעירים של דגנים השייכת למשפחת הדשא (Poaceae). כל המינים ניתחו 14 כרומוזומים mitotic הארוך יחסית metaphase (11-15 מיקרומטר) בסט הגנום דיפלואידי ושייכים למינים גדול הגנום (5.1-7.9 GBP). אורך של שורשים מונבטים לא היה יותר מ 2 סנטימטר כדי להשיג מקסימום של רקמת meristematic. סנכרון של תאי החלוקה הושג על ידי טיפול קרח מים באורך של 20 שעות ששפרו את כמות metaphase mitotic מתפשטת <s...

הקרינה הכלאה באתר (דגים) היא כלי יעיל למיפוי הפיזי של רצפי עותק יחידים וגבוהים ברמת כרומוזומליות. התנאי המוקדם הוא הכנת ממרחי כרומוזום באיכות גבוהה. אין פרוטוקול הכנת כרומוזום כללי שיהיה פחות מתאים לתאים של בעלי חיים וצמחים. הכנה של כרומוזומים צמח היא מאתגרת במיוחד בשל הקיר הנוקשה תא ועקביות ציטופלסמה שונות במינים שונים. אחת השיטות הטובות להכנה של כרומוזומים צמח הוא טכניקת ירידה כביכול הידוע גם בטכניקה מתפשט שחררה ו1,2 טכניקת אוויר ייבוש. שיטה זו הוצגה לראשונה בשנת 1958 על ידי Rothfels וSiminovitch במבחנה תאי יונקים גדלו 3. מאוחר יותר מרטין et al. 4 וקאטו et al. 5 מותאם שיטה זו לצמחים. לאחרונה, &#39;SteamDrop שיטה בשם &amp;# 39; פותח אשר משמש קיטור מים להכנה של כרומוזומים שאינם חופף 6. אמנם, ההשפעה החיובית של לחות גבוהה נצפתה קודם לכן 7, &#39;SteamDrop&#39; מספק זרימת עבודה מבוקרת של הכנות כרומוזום באיכות גבוהה 6. טיפול הקיטור גורם מתיחה של כרומוזומים כנראה קשורים לכמה שינויים של חלבוני כרומוזומליות. איכות וכתוצאה מכך מתפשט metaphase היא גבוהה מאוד, אם כי התמך של מספר המספיק של metaphase המלא מתפשט לניסויי דגים שלאחר מכן דורשים מומחיות טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנת כרומוזומים דגני mitotic המתאימים לזיהוי הדגים של בדיקות יחידים וגבוה עותק 5,8. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת שחרור האוויר יבש שתוארה על ידי קאטו 9 מבוצעים בלחות היחסית של 50% -55% (איור 1). פרוטוקול זה כולל מספר מופחתצעדי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. שימוש בפרוטוקול זה השגנו מרווחי כרומוזום באיכות גבוהה ותוצאות דגים לvulgare Hordeum, bulbosum ח &#39;, ח&#39; marinum, murinum ח &#39;, ח&#39; וpubiflorum cereale Secale.

<table><tbody><tr><td>פלטה חמה</td><td>MEDAX GmbH</td><td>12603</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז R10</td><td>Duchefa</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>צלולאז&nbsp;</td><td>CalBioChem</td><td>219466</td><td></td></tr><tr><td>פקטוליאז</td><td>סיגמא</td><td>P3026</td><td></td></tr><tr><td>ציטוהליקאז</td><td>סיגמא</td><td>C8274</td><td></td></tr><tr><td>טקסס אדום-12-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C3176</td><td>פלואורוכרום ישיר&nbsp;</td></tr><tr><td>פלואור488-5-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>C11397</td><td>פלואורוכרום ישיר&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסנס</td><td>Olympus BX61</td><td>BX61</td><td></td></tr><tr><td>CCD מצלמה</td><td>Orca ER, Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)&nbsp;</td><td>מעבדות וקטור</td><td>H-1200</td><td>צבע פלואורסצנט</td></tr></tbody></table>

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

הכנת ממרחי כרומוזום היא תנאי הכרחי לביצוע המוצלח של הקרינה הכלאה באתר (דגים). הכנת ממרחי כרומוזום צמח באיכות גבוהה היא מאתגרת בשל קיר התא הנוקשה. אחת השיטות שאושרו להכנה של כרומוזומים מפעל הוא הכנת ירידה כביכול, הידוע גם בהפצה-טיפה או טכניקת אוויר ייבוש. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנה המהיר של כרומוזום mitotic מתפשט מתאים לזיהוי הדגים של בדיקות DNA עותק יחידים וגבוהות. שיטה זו היא גרסה משופרת של שיטת טיפת האוויר יבש מבוצעת בלחות היחסית של 50% -55%. פרוטוקול זה כולל מספר מופחת של שלבי כביסה עושים יישומה קל, יעיל ושחזור. יתרונות ברורים של גישה זו הם גם התפשטות, כרומוזומים metaphase ניזוק ורבים המשרתים כתנאי מושלמים לניתוח FISH מוצלח. שימוש בפרוטוקול זה השגנו כרום באיכות גבוההosome ממרחים ותוצאות FISH לשחזור לvulgare Hordeum, bulbosum ח &#39;, ח&#39; marinum, murinum ח &#39;, ח&#39; וpubiflorum cereale Secale.

שקופיות מיקרוסקופיות עם ממרחי metaphase mitotic הוכנו על ידי השיטה מהירה האוויר יבש כרומוזום שחרור ההכנה שתוארה לעיל (Suppl. איור 1). ניתוח FISH בוצע באמצעות שני, רצפים חוזרים ועותק יחיד. תמונות התקבלו על ידי מיקרוסקופ epifluorescence עם סט של מסננים מאפשרים עירור של fluorophores המתאים ונתפסו על ידי מצלמה בצבע CCD רגישות גבוהה. לרכישת התמונה השתמשנו במחשב עם תוכנת רכישת תמונה. תוצאות של ניסויי הדגים על הכרומוזומים metaphase mitotic באמצעות 5S rDNA, [CTT] 10,...

פרוטוקול מתואר להכנת התפשטות כרומוזומים מיטוטיים איכותיים בשיטת ייבוש אוויר מהירה המתאימה לזיהוי FISH של בדיקות DNA בודדות וגבוהות.

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להכין כרומוזומים של צמחים המתאימים לטכניקת היברידיזציה של פלואורסצנציה (FISH) באמצעות גששים של DNA בעותק יחיד או בעותקים מרובים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בציטוגנטיקה ובמחקר הגנום, כגון זיהוי ארגוני מחדש של כרומוזומים, סדר של סמנים גנטיים על גבי כרומוזומים, וניתוח השוואתי בין מינים שונים. היתרון המרכזי של הליך זה הוא שהכנת פריסות כרומוזומים הופכת למהירה, קלה ויעילה.ניתן לאחסן תרחיף תאים בטמפרטורה של 20- מעלות למשך עד חודשיים ולהשתמש בו להכנת כרומוזומים בעת הצורך. רעיון זה לשיטה עלה לנו כאשר הבחנו שהאיכות ומספר הכרומוזומים המתאימים עלו באופן דרמטי. הנביטו 10 עד 20 זרעי שעורה על שתי שכבות של נייר סינון לח בצלחת פטרי בתנאי חוש למשך יומיים בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס. לאחר יומיים, חתכו בעזרת להב תער שורשים חזקים באורך של 1 עד 2 סנטימטרים מהזרע.בשלב הבא, הכינו מים קרים מאוד על ידי הנחת בקבוק זכוכית בנפח 500 milliliters המכיל מי ברז קרים בתוך קרח גרוס ומים. אווררו את המים הקרים והטבילו את קצות השורשים למשך 20 שעות כדי להגדיל את שכיחות תאי המטאפאזה. העבירו את השורשים מהמים ל-50 milliliters של מקבע אתנול-חומצה אצטית כדי לקבע אותם בטמפרטורת החדר למשך יומיים לאחר הקיבוע.שטפו 10 עד 20 שורשים עם 30 milliliters של מי ברז קרים מאוד בביקר זכוכית של 50 milliliters למשך חמש דקות, פעמיים. העבירו את השורשים אחד אחד לתוך 30 milliliters של בופר ציטראט באמצעות פינצטה. שטפו את השורשים על ידי ניעור הביקר למשך חמש דקות, פעמיים.לאחר מכן, הנח את השורשים על נייר סינון כדי להסיר את הנוזל לחלוטין תחת מיקרוסקופ. הסר את הרקמה הבלתי רצויה שאינה מרסטמטית באמצעות להב תער. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא קביעת זמן העיכול המתאים, שעשוי להשתנות בין מינים שונים.כאן מדגירים עד 20 קצוות שורשים במיליליטר אחד של תערובת אנזימים ב-37 °C למשך כ-50 דקות. כדי לרכך את רקמת הצמח בלוחית צפייה תחת מיקרוסקופ, הסירו את האנזים באמצעות פיפט ושטפו את קצוות השורשים על קרח עם חמישה מיליליטר של בופר ציטראט 0.01 M כדי להחליף את שאריות האנזים. המשיכו לשטוף את קצוות השורשים עם מיליליטר אחד של 96% ethanol פעמיים בזהירות באותה לוחית צפייה.לאחר מכן, החליפו את האתנול ב-10 עד 15 µL של מקבע שהוכן טרי לכל קצה שורש. העבירו את קצות השורשים יחד עם המקבע לשפופרת של 2 mL והמיסו את גבעולי השורש באמצעות מחט דיסקציה או פינצטה. הקשקו את השפופרת 20 פעמים כדי לתלות מחדש את התאים ולהוציא תרחיף תאים.בשלב הבא, הניחו שתי עד שלוש שכבות של נייר סופג ספוג במים על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 50 °C. השרו את השקופיות במי ברז קרים בתוך המקרר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את השקופיות מעל נייר הספיג הלח, שאבו בעזרת פיפט 7 עד 10 µL של סספנסיית תאים, והטילו אותם מגובה של 20 סנטימטרים על השקופית המקוררת המונחת על הפלטה המחוממת.הוסיפו לאחר מכן 10 µL של תערובת חומצה אצטית ואתנול לאותו מקום שבו נמצאה תרחיף התאים על השקופית, והשאירו את השקופית על הפלטה החמה. לאחר שתי דקות, הניחו את השקופית על הפלטה החמה ללא הרקמה הרטובה והניחו לה להתייבש למשך דקה אחת נוספת. בדקו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פנים (phase contrast) כדי לבקר את איכות פריסת הכרומוזומים.השתמשו בשקופיות באותו היום, או אחסנו אותן על ידי טבילה ב-96% Ethanol בצנצנת קופלין בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס, כדי להכין את השקופיות לפני תהליך ה-FISH. העבירו את השקופיות באמצעות פינצטה לצנצנת קופלין המכילה 50 milliliters של 2X SSC למשך חמש דקות. העבירו את השקופיות לצנצנת קופלין המכילה 50 milliliters של 45% acetic acid למשך שלוש עד 10 דקות.בשלב הבא, העבירו את העששיות לצנצנת קופלין המכילה 50 milliliters של 2X SSC למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את העששיות לצנצנת קופלין המכילה 50 milliliters של 4% formaldehyde, והשאירו אותן טבולות למשך 10 דקות כדי לקבע את הכרומוזומים. הסירו את ה-formaldehyde על ידי שטיפת העששיות שלוש פעמים, למשך ארבע דקות בכל פעם, בצנצנת קופלין המכילה 50 milliliters של 2X SSC.לאחר מכן,בצעו דהידרטציה לשקופיות למשך שתי דקות בסדרה של אתנול 70%, 90% ו-100%, וייבשו את השקופיות בעמדה אנכית. עבור כל שקופית, הכינו תמיסת היברידיזציה בנפח 20 µL המורכבת מ-10 µL של form amide דה-יוני, 5 µL של תמיסת hybridization buffer בריכוז 4X, 3 µL של הגשוש (probe) ו-2 µL של DNase-free water. הוסיפו 20 µL של תמיסת היברידיזציה לכל שקופית וכסו בכיסוי זכוכית (cover slip) בגודל 24 על 32 מילימטר.לאחר איטום זכוכית הכיסוי בעזרת דבק גומי, דנטורו את השקופיות עם הגששים בו-זמנית בטמפרטורה של 80 °C למשך שתי דקות על פלטה חימום, העבירו את השקופיות לתא לח ודגרו אותן בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. תוך הימנעות מאור, הסירו את זכוכיות הכיסוי על ידי שטיפת השקופיות בצנצנת שטיפה עם 2X SSC. לאחר מכן, הניחו את השקופיות בצנצנת שטיפה המכילה 2X SSC בטמפרטורה של 55 עד 60 °C ודגרו למשך 20 דקות.בשלב הבא, הניחו את השקופיות בשני XSSC בתוך צנצנת coplan למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לשקופיות בצנצנת coplan למשך שתי דקות בסדרה של ethanol בריכוזים של 70%, 90% ו-100%. ייבשו את השקופיות באוויר ובצעו צביעה נגדית עם dappy בתוך תמיסת קיבוע Antifa, תוך הימנעות מחשיפה לאור עז.נתחו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מאיר עליון (epi fluorescence microscope). בחירת המסנן תלויה ב fluorochrome ששימש לסומון הגששים, במידת הצורך. שמרו את השקופיות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בתנאי חוש למשך עד שנה.כאן מוצגות פריסות של שלב המטאפאזה של המיטוזה, שהוכנו בשיטת הכנת כרומוזומים בטפטוף וייבוש מהיר באוויר. ניתוח FISH בוצע באמצעות רצפים חוזרים ורצפים של עותק יחיד. התמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה עם סט מסננים המאפשרים עירור של הפלואורופורים המתאימים, ונלכדו על ידי מצלמה מונוכרומטית מסוג CCD בעלת רגישות גבוהה.ניסוי ה-FISH על כרומוזומי מטאפזה מיטוטיים של hoard ו-vulgari באמצעות גשוש בעותק יחיד ו-five S-R-D-N-A חשף אותות נבדלים ואיכותיים. היברידיזציה של מיקרוסאטלייט CT CTT 10 על כרומוזומי hordy ו-BULBUS הניבה תבנית ספציפית ונבדלת. ניסוי ה-FISH על כרומוזומי מטאפזה מיטוטיים של sala serial באמצעות שני גשושים של PSC 119 הניב אותות ספציפיים ואיכותיים.היתרונות הברורים של גישה זו הם כרומוזומי מטאפאזה רבים, שלמים ופיזורים, המהווים תנאי מוקדם מושלם לניתוח FISH מוצלח. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע הליך זה בפחות משעתיים אם הוא מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה כיצד להכין פריסות איכותיות של כרומוזומי מטאפאזה ממיטוזה עבור FISH. שימוש בחומרים מסוימים עלול להיות מסוכן ביותר, השתמשו תמיד במסכי הגנה ובמCתאבב (fume hood) בעת ביצוע הליכים אלו.

a-fast-air-dry-dropping-chromosome-preparation-method-suitable-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בין השלושה סוגי היתושים,...

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

מאמר זה מתאר מיצוי DNA מקליפס זנב של דג זברה. הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה ויעילה לניתוח גנוטיפים של דגי זברה.

מיצוי DNA מקליפ זנב: שיטה המשמשת בגנוטיפ של דגי זברה

החומר כאן מתאר שיטה שפותחה כדי לשמר את מבנה הכרומטין התלת מימדי של תאי נבט האשכים. שיטה זו נקראה שיטת השקופית התלת-ממדית (תלת-ממדית). שיטה זו משפרת את הרגישות לגילוי מבנים תת-גרעיניים והיא ישימה עבור פלואורסצנטיות חיסונית, דנ"א ופלואורסצנטיות RNA בהכלאה במקום (FISH).

שיטת הכנת שקופיות לשמירה על ארכיטקטורת כרומטין תלת מימדית של תאי נבט האשכים

ציור כרומוזום הוא שיטה שימושית לחקר ארגון גרעין התא והתפתחות הקריוטיפ. כאן, אנו מדגימים גישה לבודד ולהגביר אזורים ספציפיים של עניין מכרומוזומי פוליטן יחיד המשמשים לאחר מכן עבור פלואורסצנט דו מימדי בהכלאה situ (FISH).

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

פיתחנו שיטה לביטוי בשיתוף מספר חלבונים chimeric פיוז'ן פלורסנט בצמחים כדי להתגבר על הקשיים של שיטות קונבנציונליות. זה לוקח את היתרון שבשימוש של פלסמיד ביטוי יחיד המכיל מספר חלבון פונקציונלית עצמאית המבטאת קלטות כדי להשיג חלבון ביטוי משותף.

ביטוי משותף של מספר חלבונים Chimeric פיוז'ן פלורסנט בדרך יעילה בצמחים

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.

בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

למדו שיטת הכנת כרומוזומים מהירה ביבוש אוויר לצמחים המתאימה לזיהוי FISH בבדיקות DNA. שיטה זו משפרת את איכות וכמות הכרומוזומים לניתוח ציטוגנטי ומחקר גנום.

כרומוזום מהיר האוויר יבש השמטת הכנת שיטה מתאימה לדגים בצמחים

גלה סרטונים נוספים