אוסף חלב בעכברוש שימוש נימי צינורות והערכה של שומן חלב תוכן על ידי Creamatocrit
16 בדצמבר 2015
חלב הוא מקור תזונה עיקרי ליילוד. ניתוח מרכיבי החלב עשוי לספק תובנה לגבי גורמים אימהיים המשפיעים על בריאות הצאצאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה ידנית לאיסוף דגימות חלב מהחולדה המניקה, אשר לאחר מכן יכולה לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתאר כיצד לאסוף חלב באופן ידני מחולדה מניקה לצורך ניתוח מעבדה של הרכב החלב. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום בריאות האם והילד, כגון כיצד תזונת האם יכולה להשפיע על הרכב החלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה להתבצע על ידי חוקר יחיד ללא כל ציוד ואקום או יניקה מיוחד.
No.To מתחילים, יש להפריד את הסכר מצאצאיה למשך חמש דקות לפחות לפני החליבה. לאחר מכן, אספו את כל החומרים הנדרשים להליך החליבה כפי שמוצג כאן. לאחר מכן הניחו כרית ספסל סופגת על שולחן כירורגי מחומם, או השתמשו בכרית חום נפרדת כדי למנוע אובדן חום מהסכר במהלך הליך החליבה.
לאחר מכן, בדוק את מערכת ההרדמה על מנת לוודא שלמערכת יש מספיק חמצן ואיזו פלואור לפני ההליך. לאחר מכן חבר את המסכה שתשמש לאינדוקציה הרדמה ראשונית למכונה והניח את מסכת התחזוקה בקרבת מקום. פתח את מיכל החמצן והגדר את הזרימה לליטר אחד לדקה.
לאחר מכן הפעל את זרימת ה-isof fluorine והגדר את זרימתו ל-5%לאחר ההרדמה, העבר את הסכר למסכת התחזוקה. אשר רמת הרדמה מספקת על ידי בדיקת היעדר רפלקס דוושה. לאחר מכן הנח את הסכר במצב שכיבה על כרית הספסל הסופגת.
הפחת את זרימת האיזוף פלואור לשניים עד 3% עקוב באופן רציף אחר הסכר לאורך כל ההליך והתאם את זרימת האיזוף פלואור לפי הצורך כדי למנוע כאב ודיכוי נשימתי. לאחר מכן, השתמש במגבון אלכוהול סטרילי או כרית ניקוי כדי לחטא בקבוקון של אוקסיטוצין באמצעות מזרק מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 25, שאב 0.1 מיליליטר אוקסיטוצין. לאחר מכן הכנס את המחט לרבע הימני התחתון של בטן הסכר כשהמחט מצביעה לכיוון הראש בזווית של 15 עד 30 מעלות, בעומק של כ-0.5 סנטימטרים.
משוך לאחור את הבוכנה כדי להבטיח לחץ שלילי לפני ההזרקה. אם לא נשאב נוזל, הזריק את האוקסיטוצין והשליך את המחט והמזרק מיד למיכל ביולוגי. המתינו כחמש עד 15 דקות עד שהאוקסיטוצין ימריץ את החלב.
הרפו במהלך תקופה זו, בחרו את הטטים מהם ייאסף חלב. השתמש בגוזמים כדי להסיר בעדינות את הפרווה סביב הציצים שנבחרו מכיוון שפרווה עלולה לגרום לקושי באיסוף הדגימות. לאחר מכן נקו את הציצים במים פושרים.
הכינו לפחות שני אתרים מכיוון שייתכן שיידרש יותר מאתר אחד לאיסוף חלב. לאחר שהחלב ירד, סחטו בעדינות את בסיס הטט כדי להוציא חלב ידנית. לאיסוף, אספו את טיפות החלב לצינור נימי של 50 מיקרוליטר.
לאחר התמלאות, הוציאו את החלב מהצינור הנימי לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי על ידי נגיעה בקצה הצינור ששימש לשאיבת חלב מהפטמה לצד צינור המיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן השתמש במחט בגודל 18 המחוברת למזרק מיליליטר אחד כדי לפוצץ כל חלב שלא נשאב לתוך הצינור. חזור על איסוף החלב והעביר אותו לצינור המיקרו צנטריפוגה עד לאיסוף מספיק חלב.
לצורך הניתוח הנבחר, נסה להגביל את הזמן הכולל שהסכר נמצא בהרדמה לפחות משעה. בסיום החליבה, כבה את זרימת הפלואור והחמצן והסר את המסכה מהסכר. המשך לעקוב אחר הסכר עד שהוא יחזור להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה חזה
אם אין צורך בניתוחים נוספים, הבריזו את החלב ב-80 מעלות שליליות. כדי להתכונן למדידת CCR, טען 15 עד 20 מיקרוליטר חלב לתוך צינור מיקרו המטוקריט ישירות מה-Tet. ואז אטום את קצה הצינור בחומר איטום חימר.
הנח את צינור הנימים לתוך ספינר ההמטוקריט כששקע האיטום פונה כלפי חוץ וודא שהצנטריפוגה מאוזנת. לאחר מכן סובב את הדגימה ב 13, 700 פעמים G למשך שתי דקות. לאחר שהדגימה מסיימת להסתובב, הסר את הצינור מהצנטריפוגה.
שימו לב להפרדת הדגימה לשכבת קרם ושכבה שקופה. מדוד ורשום את האורך הכולל של הנוזל בצינור ואת אורך שכבת השומן או הקרם באמצעות סרגל או מחוגה. השתמש במידע זה כדי לחשב את ה-CCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה על מנת לקבוע כיצד תזונה במהלך ההריון וההנקה משפיעה על הרכב החלב.
דגימות חלב נאספו בעת הגמילה מסכרי ווסטר שניזונים מחלבון גבוה, סיבים פרה-ביוטיים גבוהים או תזונה מבוקרת. החלב שנאסף מסכרים בתזונה עשירה בסיבים פרה-ביוטיים היה בעל ההמטוקריט הגבוה ביותר מבחינה מספרית, ריכוז גרוע וערך אנרגיה. עם זאת, ההבדלים הללו לא היו מובהקים סטטיסטית בכל הנוגע לחלבון.
עם זאת, חלב שנאסף מהסכרים בדיאטה עתירת חלבון היה בעל ריכוז החלבון הגבוה ביותר. אם כי שוב, ההבדל הזה לא היה מובהק סטטיסטית. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה מנקודת ההרדמה הראשונית של הסכר אם היא נעשית כהלכה.
כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור לעקוב באופן רציף אחר הסכר כדי להבטיח שלא ייגרם דיכוי נשימה בזמן הרדמה לאחר הליך זה. ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כמו קביעת הרכב האוליגוסכרידים של החלב. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את האיסוף הידני של חלב מחולדה מניקה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה פשוטה לאיסוף ידני של חלב מחולדות מניקות, המאפשרת ניתוח מעבדתי של הרכב החלב. הפרוטוקול תוכנן לביצוע על ידי חוקר בודד ללא ציוד ואקום או שאיבה ייעודי, והוא כולל טכניקה להערכת תכולת השומן בחלב באמצעות שיטת ה-creamatocrit. גישות אלו מקלות על מחקרים הבוחנים כיצד גורמים אימהיים משפיעים על הרכב החלב, ובעקבות זאת, על התפתחות הצאצאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מחקר בריאות אם וילד
- ביוכימיה תזונתית
- פיזיולוגיה של בעלי חיים
רקע
- חלב הוא מקור התזונה העיקרי של יונקים רךבני, והוא מכיל רכיבי תזונה חיוניים ותרכובים ביו-אקטיביים.
- מודלים של חולדות נמצאים בשימוש נרחב לחקר הפיזיולוגיה האימהית והשפעותיה על הצאצאים.
- ניתוח הרכב החלב מסייע להבהיר את הקשרים בין בריאות האם לבין התפתחות הצאצאים.
- שיטות קיימות לאיסוף חלב דורשות לעיתים קרובות ציוד ייעודי או מספר אנשי צוות.
מטרת המחקר
- לתאר שיטה ידנית פשוטה לאיסוף חלב מחולדות מגיעות.
- לספק פרוטוקול שאינו דורש ציוד מיוחד וניתן לביצוע על ידי חוקר אחד.
- להדגים את השימוש בשיטת הקרימטוקריט (creamatocrit) להערכת תכולת השומן בחלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפרדת האם מהצאצאים לפני החליבה.
- השראה ושמירה על הרדמה באמצעות isoflurane וחמצן.
- מתן oxytocin לעידוד השחרור של החלב.
- סחיבה ידנית של חלב מהפטמות ואיסוף לתוך צינורות נימיים.
- העברת החלב לצינורות מיקרו-צנטריפוגה לצורך אחסון או ניתוח.
- מדידת קרמטוקריט: צנטריפוגציה של חלב בצינורות המטוקריט להפרדת השמנת וחישוב תכולת השומן.
תוצאות עיקריות
- שיטת האיסוף הידנית מניבה כמות חלב מספקת לאנליזות המשך וניתן להשלימה בתוך פחות משעה.
- דגימות חלב מאמהות בתזונות שונות (חלבון גבוה, סיבים פרה-ביוטיים גבוהים, ביקורת) הראו וריאציות ברמת הקרמטוקריט, בריכוז השומן ובתוכן החלבון, אם כי ההבדלים לא היו מובהקים סטטיסטית.
- הפרוטוקול מאפשר ניהול בטוח של ההרדמה והפעלת מינימום סטרס על בעל החיים כאשר הוא מנוטר כראוי.
- השיטה ניתנת להתאמה לאנליזות נוספות, כגון ספקטרומטריית מסות לאפיון אוליגוסכרידים.
מסקנות
- טכניקה זו לאיסוף חלב ידני היא יעילה, הדירה ונגישה עבור רוב המעבדות.
- היא מאפשרת מחקרים מפורטים על האופן שבו התזונה והפיזיולוגיה של האם משפיעות על הרכב החלב ועל בריאות הצאצאים.
- גישה זו תומכת במגוון של ניתוחים ביוכימיים המשכיים להעמקת המחקר בתחום בריאות האם והילד.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
כימות מהימן של תכולת השומן בחלב במודלים פרה-קליניים של חולדות מאפשר מחקרים מכניסטיים על השפעת התזונה האימהית והתערבויות מטבוליות על התפתחות הצאצאים. איסוף ידני באמצעות קפילריה ואנליזה של creamatocrit מספקים זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה להערכת הקשרים מטבוליים בין האם לצאצא במחקר תרגומי. גישה זו תומכת בגילוי מוקדם ובתיקוף יעדים עבור תוכניות לבריאות האם והילד בצינורות הפיתוח של חברות ביו-פרמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות הנוגעות לתזונה ומטבוליזם אימהים במודלים פרה-קליניים מבוקרים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של יעדי התערבות אימהיים על ידי קישור הרכב החלב לתוצאות בצאצאים.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אספקת מדדים כמותיים של תכולת השומן בחלב.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של תכולת שומן לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מכין דגימות חלב שעברו תיקוף עבור ניתוחים ביוכימיים ואומיקה (omics) בהמשך.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של התערבויות תזונתיות או פרמקולוגיות במודלים אימהיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ממירה נתוני הרכב חלב פרה-קליניים עם סממנים ביולוגיים תרגומיים של בריאות האם והיילוד.
- תומך ברצף מהשלב של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות להתערבות אימהית.
- מספק הפחתת סיכונים מנגנונית עבור מחקרים מטבוליים של אם-צאצא.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי המוקדם והשלב הפרה-קליני, ותומכת בבדיקת השערות, תיקוף מטרות ומחקר תרגומי בבריאות האם והילד.
- ביולוגיה של הגילוי: תוצרי creamatocrit כמותיים מבהירים את ההשפעה של התערבויות אימהיות על הרכב החלב.
- סינון: איסוף וניתוח סטנדרטיים מאפשרים השוואה הדירה בין קבוצות ניסוי.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות ישירות של תכולת השומן לצורך ניתוח סטטיסטי וקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מסייעת להבאת ממצאים פרה-קליניים בהלימה עם נקודות סוף קליניות של בריאות האם והילד.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה ניתנת להתאמה למחקרי התערבות אימהיות מגוונים ולפלטפורמות אנליטיות המשכיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון הניבוי במחקרי מטבוליזם של אם-צאצא ותיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מאפשר הפעלה על ידי חוקר יחיד, סטנדרטיזציה והדירות ללא צורך בציוד מיוחד.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות go/no-go מותאמות סיכון עבור תוכניות התערבות אימהיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר וניתנת להרחבה לצורך תיעדוף נכסי בריאות אם-ילד.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול במכרסמים, הרדמה ואיסוף דגימות.
- נדרשת גישה לתשתית מעבדה בסיסית, כולל סנטריפוגה וכלי מדידה קפילריים.
- סטנדרטיזציה של ההרדמה ותזמון האיסוף היא קריטית להשגת הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאימה למודלים שונים של התערבות אימהית, והשיטה תואמת לניתוחים ביוכימיים המשכיים.
- ניטור קפדני של רווחת בעלי החיים ועומק ההרדמה חיוני לאורך הפרוצדורה.
