בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד אזור גנומי ספציפי השומר על אינטראקציות מולקולריות לזיהוי מולקולות המקיימות אינטראקציה עם האזור הגנומי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות בתחומי הפונקציות הגנומיות כגון שעתוק וויסות אפיגנטי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת זיהוי ישיר של מולקולות המקיימות אינטראקציה עם אזור גנומי ספציפי.

מי שידגים את ההליך יהיה טושיטסוגו פוג'יטה, עוזר פרופסור מהמעבדה שלי. בהתאם לפרוטוקול הטקסט, מהנדסים את המולקולות קושרות ה-DNA המעניינות. זה כרוך ביצירת רצף ה-gBlock המעניין והכנסתו לרטרו-וירוס, למשל כדי לייצר את ה-RNA המנחה המורכב עם שלושה FLAG-dCas9.

לחלופין, ניתן ליצור שלושה חלבוני FLAG-TAL המזהים את רצף המטרה. לאחר מכן, בעקבות פרוטוקול הטקסט מדביקים את התאים ברטרו-וירוס המוכן. אשר את הביטוי של מולקולות קשירת ה-DNA המהונדסות וקבע את קו התאים.

כעת, המשך על ידי קישור צולב של התאים עם פורמלדהיד. השעו 20 מיליון תאים שעברו טרנספטציה ב-30 מיליליטר של מדיום תרבית רגיל והוסיפו 810 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד לריכוז סופי של 1%דגירה על התערובת למשך חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הרגו את תגובת הקישור הצולב על ידי הוספת 3.1 מיליליטר של 1.25 גליצין מולרי.

הניחו לתאים לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני שתמשיכו. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינור התא ב -300 גרם למשך חמש דקות בצנטריפוגה מקוררת. השליכו בזהירות את הסופרנטנט ושטפו את כדור התא ב-30 מיליליטר PBS על ידי ערבוב וצנטריפוגה.

בצע שתי שטיפות PBS. במידת הצורך ניתן לאחסן את הגלולה השטופה של תאים קבועים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. בהמשך, אספו את הכרומטין מהתאים.

השעו אותם ב-10 מיליליטר של מאגר ליזה ודגרו אותם על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות צנטריפוגה מקוררת, אספו את התאים והשליכו את הסופרנטנט בזהירות. כעת, השעו את כדור התא במאגר ליזה גרעיני ודגרו אותו על קרח למשך 10 דקות.

כל כמה דקות במהלך הדגירה מערבלים לזמן קצר את התערובת. שוב, אסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה. כעת, שטפו את הגלולה עם 10 מיליליטר PBS והסירו את תמיסת הכביסה בעזרת צנטריפוגה נוספת.

זה מייצר את שבר הכרומטין, ואם תרצה, ניתן להקפיא אותו ולאחסן אותו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. המשך על ידי השעיית גלולת הכרומטין ב-800 מיקרוליטר של מאגר ליזה שונה שלוש והעביר את המתלה לצינור קטן יותר של 1.5 מיליליטר. כעת, הפעל בדיקה סוניקציה בעוצמה שלוש עם חובה מתמשכת.

כדי לפצל את הכרומטין, מחזור ידנית בין 10 שניות של סוניקציה ל-20 שניות על קרח. בכל מחזור חמישי או שישי, האריכו את שלב הקרח לשתי דקות כדי שהדגימה לא תתחמם יתר על המידה. בצע מחזור סוניקציה זה 10 עד 18 פעמים, תוך שמירה על קצה הגשושית מתחתית הצינור כדי למנוע קצף של הדגימה.

לאחר הסוניקציה, אוספים את הדגימה בעזרת צנטריפוגה מקוררת מהירה. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט המכיל את הכרומטין המפוצל לצינור חדש והשליכו את הגלולה. עיין בפרוטוקול הטקסט כיצד להעריך את הפיצול.

כדי להתכונן למשקעים החיסוניים, תחילה צמד את הנוגדנים ל-Dynabeads. משקעים חיסוניים אלה מוגדלים לדגימות שמקורן ב-20 מיליון תאים. הוסף נפח של 1/5 של מאגר ליזה שונה שלוש עם טריטון X-100 לכרומטין המפוצל כדי לקבל ריכוז סופי של 1% טריטון.

לאחר מכן, הוסף את התערובת לחרוזים המגנטיים המצומדים ל-IgG רגיל של העכבר. דגרו את התגובה למשך שעה על מסובב עם קירור. מאוחר יותר, משוך את החרוזים מהתמיסה למשך שלוש דקות על מעמד מגנט.

לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט. העבירו את הסופרנטנט לשפופרת של חרוזים מגנטיים מצומדים לנוגדנים נגד FLAG. הפעל את תגובת ההצמדה הזו למשך הלילה על מסובב בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת בבוקר, מרחו מגנט על הצינור למשך שלוש דקות כדי לאסוף את החרוזים. לאחר מכן, הוציאו את הסופרנטנט והשליכו אותו. עכשיו, שטפו את החרוזים.

השעו אותם במיליליטר אחד של מאגר דל מלח ודגרו אותם במשך חמש דקות על מסובב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, בודדו את מגנטיזציה של החרוזים והשליכו את הסופרנטנט. חזור על שלב הכביסה הזה עם חוצץ דל מלח פעם נוספת.

באותה טכניקה, בצע שתי שטיפות נוספות באמצעות מאגר מלח גבוה. המשך להשתמש בשיטה כדי לשטוף את החרוזים במאגר ליתיום כלוריד פעמיים. לבסוף, שטפו את החרוזים עם TBS-IGEPAL CA-630 רק פעם אחת.

לאחר שבעת שלבי הכביסה, השעו את החרוזים ב-200 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, משכו את החרוזים על ידי מגנטיזציה ואספו את הסופרנטנט לתוך צינור חדש. חזור על שלב פליטה זה כדי להגדיל את התשואות.

לאחר מכן, טהר כ-5% מה-DNA כדי להעריך את התפוקה. התחל בערבוב עיקר הפליטה לתגובת משקעים. זרז את הכרומטין למשך הלילה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס.

למחרת, צנטריפוגה את הדגימה והשליכו את הסופרנטנט. שוטפים את הגלולה במיליליטר של 70% אתנול וחוזרים על הצנטריפוגה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והשעו את הגלולה ב-40 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2.

כעת, מערבב את המתלים למשך חמש דקות שלמות. לאחר מכן, דגרו אותו בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לפרק ולהפוך את הקישור הצולב. לאחר הרתיחה, העבירו 40 מיקרוליטר מהדגימה על ג'ל SDS-PAGE.

בדרך כלל משתמשים בשיפוע של ארבעה עד 20%. הפעל את הג'ל עד שהצבע עובר סנטימטר אחד מתחת לבאר. לאחר מכן, מכתימים את הג'ל וחותכים אותו לחמש חתיכות באורך של כ -2 מילימטרים.

מדללים את החלבון מחתיכות הג'ל ומשתמשים בו לניתוח מפרט מסה. טיהור ה-RNA, ואחריו ניתוח ריצוף, מכוסים בפרוטוקול הטקסט. בסך הכל, ניתן לטהר עד 10% מהאזורים הגנומיים של היעד באמצעות enChIP.

ניתן לראות כאן תפוקות של ניתוחים המכוונים לאזור המקדם של הגן IRF-1 בהשוואה למיקום Sox2 הלא ספציפי. דוגמה נוספת היא התמקדות בטלומרים לעומת לוקוס גמא-לווייני לא ספציפי. enChIP SILAC זיהה מספר חלבונים הקשורים למקדם IRF-1 באופן ספציפי לאינטרפרון גמא.

חלבונים קושרי טלומיר זוהו גם על ידי enChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן נעשה שימוש בריצוף RNA של enChIP לזיהוי ה-RNA הקשורים לטלומרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי השעתוק והבקרה האפיגנטית לחקור מנגנונים כאלה במערכות ביולוגיות שונות.