בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד אזור גנומי ספציפי תוך שימור אינטראקציות מולקולריות, לצורך זיהוי של מולקולות המקיימות אינטראקציה עם אותו אזור גנומי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות בתחומי התפקוד הגנומי, כגון שעתוק ובקרה אפיגנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת זיהוי ישיר של מולקולות המקיימות אינטראקציה עם אזור גנומי ספציפי.

את הפרוצדורה ידגים Toshitsugu Fujita, מרצה בכיר מהמעבדה שלי. בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הנדס את מולקולות קישור ה-DNA הרצויות. שלב זה כולל יצירת רצף gBlock הרצוי והחדרתו לתוך רטרו-וירוס, למשל, כדי להפיק את ה-guide RNA במתחם עם שלושה FLAG-dCas9.

לחלופין, ניתן להפיק שלושה חלבוני FLAG-TAL המזהים את רצף המטרה. לאחר מכן, הדביקו את התאים ברטרו-וירוס שהוכן, בהתאם לפרוטוקול הכתוב. אששו את הביטוי של מולקולות קשירת ה-DNA ההנדסיות והקימו את שורת התאים.

כעת, המשיכו ליצירת קשרי הצלבה של התאים באמצעות פורמאלדהיד. השעו 20 מיליון תאים שעברו טרנספקציה ב-30 milliliters של מצע תרבית רגיל והוסיפו 810 microliters של 37% formaldehyde לריכוז סופי של 1%. דגרו את התערובת למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius. לאחר חמש דקות, הפסיקו את תגובת הצלבת הקשרים על ידי הוספה של 3.1 milliliters של glycine בריכוז 1.25 molar.

השאירו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפני ההמשך. לאחר מכן, סבבו את מבחנת התאים בצנטריפוגה מקוררת במהירות של 300 G למשך חמש דקות. שפכו בזהירות את supernatant ושטפו את משקע התאים ב-30 milliliters של PBS באמצעות ערבוב וסבב בצנטריפוגה.

בצע שני שטיפות ב-PBS. במידת הצורך, ניתן לאחסן את המשקע השטוף של התאים המקובעים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אסוף את הכרומטין מהתאים.

שHהם ב-10 milliliters של lysis buffer והדגרו אותם על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן, בעזרת צנטריפוגה מקוררת, אספו את התאים והסִירו בזהירות את העילוי. כעת, שHה את משקע התאים ב-nuclear lysis buffer והדגירו אותו על קרח למשך 10 דקות.

בכל כמה דקות במהלך האינקובציה, ערבבו את התערובת קצרה במערבל וורטקס. שוב, אספו את התאים באמצעות סרכזה. כעת, שטפו את המשקע עם 10 milliliters של PBS והסירו את תמיסת השטיפה באמצעות סרכזה נוספת.

תהליך זה מפיק את פראקציית הכרומטין, ואם יש בכך צורך, ניתן להקפיא אותה בהקפאה מהירה (flash freeze) ולאחסן אותה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. המשך על ידי השעיה של משקע הכרומטין ב-800 µL של modified lysis buffer three והעבר את התוך למבחנה קטנה יותר של 1.5 mL. כעת, הפעל את גשושית הסוניקציה (sonication probe) בעוצמה של רמה 3 במצב עבודה רציף (continuous duty).

כדי לפרק את הכרומטין, בצעו מחזורים ידניים של 10 שניות סוניקציה ו-20 שניות על קרח. בכל מחזור חמישי או שישי, האריכו את שלב הקרח לשתי דקות כדי למנוע התחממות יתר של הדגימה. בצעו מחזור סוניקציה זה 10 עד 18 פעמים, תוך שמירה על קצה הפרובה מחוץ לתחתית המבחנה כדי למנוע היווצרות קצף בדגימה.

לאחר הסוניקציה, אסוף את הדגימה באמצעות סנטריפוגציה מהירה בקירור. לאחר מכן, העבר את העלייה (supernatant) המכילה את הכרומטין המקטע למבחנה חדשה והשלך את המשקע (pellet). עיין בפרוטוקול הכתוב כדי ללמוד כיצד להעריך את מידת הקיטוע.

כדי להתכונן לאימונופרסיפיטציה, ראשית צמדו את הנוגדנים ל-Dynabeads. אימונופרסיפיטציה זו מותאמת לדגימות המופקות מ-20 מיליון תאים. הוסיפו נפח של 1/5 מבאפר ליזיס 3 משונה עם Triton X-100 לכרומטין המגומם כדי להגיע לריכוז סופי של 1% Triton.

לאחר מכן, הוסף את התערובת לחרוזי המגנט המצומדים ל-normal mouse IgG. דגור את התגובה למשך שעה על רוטטור בקירור. לאחר מכן, משוך את החרוזים מהתמיסה למשך שלוש דקות באמצעות מעמד מגנט.

לאחר מכן, אספו את העילאי. העבירו את העילאי למבחנה המכילה חרוזי מגנט המצומדים לנוגדנים נגד FLAG. בצעו תגובת צימוד זו למשך לילה על מערבל סיבובי בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בבוקר למחרת, הצמדו מגנט לשפופרת למשך שלוש דקות כדי לאסוף את החרוזים. לאחר מכן, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת פיפט והשליכו אותו. כעת, שטפו את החרוזים.

השעה אותם במיליליטר אחד של בופר דל במלח והדגר אותם למשך חמש דקות ברוטטור בטמפרטורה של 4 °C. לאחר ההדגרה, בדל את החרוזים באמצעות מגנט והסר את הנוזל העליון. חזור על שלב שטיפה זה עם בופר דל במלח פעם נוספת.

באמצעות אותה טכניקה, בצעו שתי שטיפות נוספות באמצעות בופר בעל ריכוז מלח גבוה. המשיכו להשתמש בשיטה זו כדי לשטוף את החרוצים בבופר ליתיום כלוריד פעמיים. לבסוף, שטפו את החרוצים עם TBS-IGEPAL CA-630 פעם אחת בלבד.

לאחר שבעת שלבי השטיפה, השעה את החרו지를 ב-200 µL של חוצץ אלוציה (elution buffer) ודגור אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, משוך את החרו지를 באמצעות מגנט ואסוף את supernatant לשפופית חדשה. חזור על שלב אלוציה זה כדי להגדיל את התנובה.

לאחר מכן, טהרו כ-5% מה-DNA כדי להעריך את התוצר. התחילו בערבוב של מרבית התסננת (eluate) בתגובת שיקיעה. שקיעו את הכרומטין למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

ביום למחרת, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה והשליכו את הנוזל העליון (supernatant). שטפו את המשקע במיליליטר אחד של 70% ethanol וחזרו על הסבוב בצנטריפוגה למשך 10 דקות. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון והמיסו את המשקע ב-40 microliters של 2x sample buffer.

כעת, ערבלו את הסספנזיה במכשיר vortex למשך חמש דקות מלאות. לאחר מכן, דגרו אותה בטמפרטורה של 100 °C למשך 30 דקות כדי לגרום לדנטורציה ולביטול הקשירה הצולבת. לאחר הרתיחה, הרצו 40 µL מהדגימה על ג'ל SDS-PAGE.

בדרך כלל נעשה שימוש במדרג של 4% עד 20%. הרץ את הג'ל עד שהצבע יעבור סנטימטר אחד מתחת לבאר. לאחר מכן, צבע את הג'ל וחתום אותו לחמישה חלקים באורך של כ-2 מילימטרים.

דללו את החלבון מחתיכות הג'ל והשתמשו בו לצורך אנליזת mass spec. טיהור ה-RNA, ולאחריו אנליזת ריצוף, מפורטים בפרוטוקול הטקסט. באופן כללי, ניתן לטהר עד 10% מאזורי הגנום המטרה באמצעות enChIP.

כאן מוצגות תשואות של אנליזות המכוונות לאזור הפרומוטור של הגן IRF-1 בהשוואה לאיתור לא-ספציפי של הלוקוס Sox2. דוגמה נוספת היא מיקוד בטלומרים לעומת לוקוס gamma-satellite לא-ספציפי. שיטת enChIP SILAC זיהתה מספר חלבונים הקשורים לפרומוטור של IRF-1 באופן ספציפי לאינטרפרון גמא.

חלבונים נקשרי-טלומרים זוהו גם באמצעות enChIP בשילוב עם ספקטרומטריית מסות. לאחר מכן נעשה שימוש בריצוף RNA בשיטת enChIP כדי לזהות את ה-RNAs הקשורים לטלומרים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי השעתוק והבקרה האפיגנטית לבחון מנגנונים אלו במערכות ביולוגיות שונות.