ניתוח השוואתי של הורמון גדילה האנושית בסרום שימוש SPRi, ננו-SPRi ומבחני ELISA

המטרה הכוללת של מחקר זה היא להעריך את הפוטנציאל האבחנתי של בדיקות דימוי תהודה של פלזמונים שטחית (SPRi), ישירות ומואמצות, בזיהוי של סממנים ביולוגיים בסרום, ולהשוות זאת ישירות לערכה מסחרית של בדיקת ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביו-רפואי, כגון זיהוי של שלב מוקדם של מחלה, ואספקת אמצעים לניטור יעילות טיפולית. היתרון המרכזי של SPRi הוא שהיא מאפשרת ניטור וויזואליזציה של אינטראקציות ביו-מולקולריות בזמן אמת וללא סימון, על ידי תיעוד שינויים במקדם השבירה בסמוך לפני השטח של החיישן.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על האבחנה של רמות hGH בסרום, מאחר ש-hGH אנדוגני נקשר למספר רב של הפרעות רפואיות המשפיעות על הגדילה וההתפתחות של בני אדם. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הכנת הכימיה של פני השטח של הביוצ'יפ קשים ללמידה, וכל טעות עלולה להשפיע רבות על התוצאות. לאחר הכנת התמיסות ודגימות החלבון בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש ב-120 milliliters של תמיסת piranha מיוצבת כדי לנקות את שבב הזהב באמצעות סוניקציה ב-50 °C למשך 90 דקות.

השתמשו במים לשטיפת השבב, ובצעו סוניקציה במים למשך חמש דקות. לאחר מכן שטפו את השבב באתנול והשתמשו בזרם חנקן לייבושו. הניחו את שבב הזהב בתא UV ozone למשך 30 דקות כדי להסיר מזהמים.

בשלב הבא, הוסיפו 150 milligrams של 11-mercaptoundecanoic acid ל-20 milliliters של ethanol בתוך מבחנה בעלת מכסה פלסטיק כדי לספק תמיכה לשבב, ומוט ערבוב, כדי לערבב את התמיסה באופן הומוגני. הניחו את השבב במבחנה וסגרו אותה. לאחר מכן, חממו את המבחנה במיקרוגל בהספק של 50 watts ובטמפרטורה של 50 °C למשך חמש דקות.

שטפו את השבב באתנול, והשרו אותו באתנול למשך חמש דקות. חזרו על השטיפה באמצעות מים, והשרו למשך חמש דקות. הוסיפו 150 milligrams של 1-Ethyl-3-carbodiimide ל-20 milliliters של מים בתוך מבחנה המכילה מוט ערבוב.

העבירו את השבב אל מבחנת הבדיקה, וחממו במיקרוגל כפי שהודגם כעת. השתמשו במים כדי לשטוף את השבב, והשרו אותו במים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 150 milligrams של N-Hydroxysuccinimide ל-20 milliliters של מים במבחנה עם מוט ערבוב.

הוסיפו את השבב למבחנה, אטמו אותה עם פקק וחממו במיקרוגל. לאחר שטיפה והשריה של השבב במים כפי שבוצע קודם לכן, הוסיפו 250 micromolar של polyethylene glycol ב-20 milliliters של מים למבחנה עם מוט ערבול. הוסיפו את השבב וחממו במיקרוגל, ולאחר מכן שטפו והשרו במים כפי שבוצע קודם לכן.

הכינו תמיסת נוגדנים anti-rhGH בריכוז 15 µg/mL, ונוגדני anti-IgG כביקורת שלילית, והוסיפו 10 µL מכל תמיסה לבאר נפרדת בלוחית של 384 בארות. תכננו את תבנית ההחתמה במכשיר המיקרו-מערך (microarrayer), והחתימו את השבב בנוגדנים באמצעות פין עם קצה טפלון בקוטר 500 µm. דגרו את השבב המוחתם בטמפרטורת החדר ובלחות של 75% למשך שעתיים.

לאחר הגדרת ניסוי ה-SPRi וחסימת השבב בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכין תמיסה של rhGH בריכוזים הבאים ב-PBS, המכיל 10% serum ו-one milligram per milliliter BSA. חשוב להדגיש את סוג מולקולת החסימה שנבחרה בשלב זה, שכן המטרה היא למזער אינטראקציות לא ספציפיות.

הכינו תמיסה ביחס של שניים לאחד על ידי הוספת 1 µL של נוגדני זיהוי anti-rhGH מסומני ביוטין בריכוז של 6 µM ל-3 µL של נקודות קוונטיות בטווח האינפרא-אדום הקרוב מצופות בסטראפטאווידין בריכוז של 1 µM, בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של 0.5 mL. מזריקו 150 µL של תמיסת סרום אנושי עם תוספת של hGH ללולאת ההזרקה. עלייה חזקה באות תלווה בירידה איטית כתוצאה משטיפה של סרום שנקשר באופן לא ספציפי מהפני השטח.

לאחר שהאות מתייצב, השתמש בתמיסה של 450 millimolar sodium chloride, המתווספת לבופר ההרצה, כדי לשטוף את הפני השטח. בעזרת בופר ההרצה, דלל את תמיסת הנוגדנים לגילוי anti-rhGH והנקודות הקוונטיות לריכוז של 10 nanomolar, והזרק לתא הזרימה. ייבא את הנתונים לתוכנה לניתוח נתונים.

לאחר מכן, שרטטו את אות ה-SPRi כפונקציה של הזמן, וקבעו את ההפרש בין נקודות הנוגדן anti-rhGH לבין נקודות הנוגדן ששימשו כביקורת שלילית לאחר שטיפת המלח בריכוז גבוה. לביצוע ELISA, לאחר הכנת הריאגנטים, הבארות המצופות בנוגדנים והסטנדרטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הכינו דגימות של הורמון rhGH בסרום אנושי בריכוז של 10% בריכוזים הבאים. הוסיפו 50 microliters מכל סטנדרט, ביקורת ודגימה לכל באר בשלוש חזרות.

לאחר מכן, אטמו את הבארות והדגירו בטמפרטורה של 4 °C עם ניעור עדין למשך הלילה. למחרת, הוציאו את הפלטה מהניעור והמתינו עד שתגיע לטמפרטורת החדר. חממו את ה-anti-rhGH HRP, בופר הקונג'וגציה, בופר השטיפה, הכרומוגן tetramethylbenzidine (או TMB) ואת ריאגנט העצירה לטמפרטורת החדר.

להכנת ריאגנטים לעבודה, השתמשו בבופר קונג'וגציה כדי לבצע דילול של 40x עבור anti-rhGH HRP. השתמשו במים מזוקקים כדי לדלל את בופר השטיפה פי 200. הוסיפו 50 µL של קונג'וגט anti-rhGH HRP לכל באער.

יש לאטום את הבארות ולהדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי ניעור עדין. יש לשפוך את התמיסה מהבארות, להפוך את הפלטה ולהקיש עליה כדי לייבשה על נייר סופג. יש להוסיף 200 microliters של בופר שטיפה לכל בארה, ולאחר מכן לשפוך את התמיסה ולהקיש לייבוש פעם נוספת.

חזור על השטיפה שלוש פעמים. חשוב להקיש על פלטת ה-96 בארות כדי להסיר חומרים נלווים, שכן הסתמכות על הפ pipette אינה יעילה. לאחר מכן, הוסף 100 µL של כרומוגן לכל בארה, בטווח של 15 דקות לאחר שלב השטיפה.

דגרו בטמפרטורת החדר בחשיפה מוגבלת לאור למשך 30 דקות תוך כדי ניעור עדין. התמיסות חסרות הצבע יהפכו לכחולות. הוסיפו 100 µL של תמיסת עצירה לכל באער.

התמיסות ישנו את צבען מכחול לצהוב. השתמשו בקורא לוחיות באורך גל של 450 nanometers כדי למדוד באופן מיידי את הבליעה של כל באר. לבסוף, שרטטו את עקומת הסטנדרט עבור הסטנדרטים שסופקו, ולאחר מכן שרטטו את הצפיפות האופטית של rhGH בדגימות של 10% serum, אל מול הריכוז של כל דגימה.

בסרטון זה, ביצועיהם של SPRi ו-nano-SPRi הושוו ל-ELISA לצורך זיהוי של rhGH. איור זה מייצג את עקומת הטיטרציה של rhGH שהוסף לסרום אנושי בריכוז 10%, והיא plotted מול ה-OD שהתקבל באורך גל של 450 ננומטר. נצפתה תגובה ליניארית טובה, וגבול הגילוי נקבע כ-one nanogram per milliliter.

כאן, גילוי של rhGH הוערך באמצעות SPRi. כל נקודה בעקומת מדרג הריכוזים מייצגת את ערך הממוצע של הפרש הרפלקטיביות שחושב משלוש עקומות קינטיקה של SPRi עבור כל ריכוז. גבול הגילוי, או LoD, נקבע כ-3.61 nanograms per milliliter.

כדי להגביר את הרגישות של החיישן הביולוגי מסוג SPRi, הוחדרו למשטח החיישן מחזקים ננומטריים באופן רצפי. בניסוי זה, המחזקים הננומטריים הגבירו את תגובת החיישן הביולוגי בעד 7.9%, אך עם שינוי מינימלי באות של הביקורת. הישימות של חיישן ה-nano-SPRi נבחנה על ידי מדידת טווח ריכוזים של rhGH מ-30,000 ועד 0.25 picograms per milliliter.

ה-LoD חושב כ-9.2 picograms per milliliter, ומקדם השונות היה 20%. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שעה אחת לזיהוי ישיר, ושעתיים עבור nano-SPRi, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לאפטמיזציה של התנאים לכל שלב, ולאחר מכן, ניתן לשחזר את התוצאות בקלות בזמן קצר יותר. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון multi-tuff ו-maspeck analysis ישירות על השבב לאחר ניסוי SPRi, וזאת כדי לספק תובנות נוספות על המולקולה שנלכדה.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו אמורה לסלול את הדרך עבור חוקרים בתחום האבחון הרפואי לבחון זיהוי סימולטני של מספר סמנים ביולוגיים, הקשורים לסרטן ולהפרעות נוירולוגיות ומvסביביות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ההקמה של בדיקות SPRi, nano-SPRi ו-ELISA לזיהוי רמות hGH בסרום אנושי. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והגנה על העיניים בעת ביצוע הליך זה.