Name: מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למד את שיטת COSMIC למיפוי אינטראקציות DNA-תרופות בקנה מידה גנומי. טכניקת חציבת הכרומטין מאפשרת מדידה ישירה של קשרי ליגנד-DNA ומספקת תובנות למנגנוני פעולה של מולקולות קטנות המכוונות לגנום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת אנסארי ולפרופסור פרמסוואראן רמנת'ן על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH CA133508 ו-HL099773, מלגת הפקולטה של H. I. Romnes, ופרס המחקר הרפואי של W. M. Keck ל- A.Z.A. G.S.E. נתמך על ידי מלגת פיטרסון מהמחלקה לביוכימיה ומדעים ביולוגיים מולקולריים מענק הכשרה NIH T32 GM07215. A.E. נתמך על ידי מלגת Morgridge Graduate ומלגת המרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, ו-D.B. נתמך על ידי מענק NSEC מ-NSF.

1. Crosslinking בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתחיל עם 2.5x10 ~ 7 תאי H1, או תאים בתרבית אחרים. הערה: מספר זה של תאי H1 מתאים לחמש מנות של 10 סנטימטר (confluency כ -40%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים בתקשורת E8 על מנות מצופים על משטח שתומך בתאי גזע pluripotent (ראה חומרי רשימה), ודגירתם על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2. קציר תאי אנזימים (ראו חומרי רשימה). הערה: אל תאפשר תאי H1 יעלו על 90% confluency; confluency גורם התמיינות ספונטנית של תאי H1. לספור תאים, לגדול צלחת 10 סנטימטרים נוספת של תאים, להרים את תאי אנזימים כמפורט בסעיפים 1.8-1.10, ולספור אותם עם hemocytometer. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תקשורת תרבות E8 כפי שתואר באל חן ואח. 54 </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הוספת פוליאמיד, להסיר את המדיה התרבות בילתה עם פיפטה פסטר המצורפת למלכודת ואקום. הוסף מדיה טרי עם כפיפטה erological ומנפק פיפטה (8 מ&quot;ל לכל צלחת 10 סנטימטרים). הערה: הוסף מדיה לצד השני של הצלחת כדי למנוע שיבוש התאים. מנקודה זו ואילך להגן על התאים מפני אור, כדי למנוע צילום crosslinking המוקדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף פוליאמיד עם טפטפת (8 μl של 400 מיקרומטר פוליאמיד בDMSO, 400 ריכוז סופי ננומטר) ישירות לתקשורת והתרבות של כל מנה. מערבולת הצלחת לפזר באופן שווה לפוליאמיד התקשורת. הערה: ריכוז יכול להיות מגוון, אך להבטיח כי לא רעיל סלולארי הוא ציין לטיפול שנבחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים 24 שעות 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO 2, ולהבטיח שהם מוגנים מפני אור. הערה: זמן הדגירה יכול להיות מגוון למדוד פוליאמיד מחייב על פני זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל צלחת 10 סנטימטרים עם 4 מיליליטר PBS (monobasic 1.05 מ&quot;מ פוספט אשלגן, נתרן כלורי 155.17 מ&quot;מ, 2.97 dibasic פוספט נתרן מ&quot;מ) באמצעות דיס פיפטה וטפטף סרולוגיותpenser. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מיליליטר תרבות תקשורת E8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם האורות מעומעמים, להסיר את המכסה של 5 מנות תרבות ולמקם את התאים על משטח שטוח מחוץ למכסת המנוע. מניחים מסנן זכוכית מעל 5 מנות התרבות לסנן אור עם λ &lt;300 ננומטר. הנח את מקור UV על גבי מסנן. דגימות Crosslink 30 דקות עם 365 ננומטר קרינת UV (2.4 mW / 2 סנטימטר). הערה: crosslinking זמן צריכה להיקבע באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תרבות מנות בחזרה למכסת המנוע. לשאוב את התקשורת עם פיפטה פסטר המצורפת למלכודת ואקום. לשטוף כל צלחת 10 סנטימטרים עם 4 מיליליטר PBS. לשאוב את PBS. להוסיף 3 מיליליטר אנזים לתא דיסוציאציה (ראה חומרי רשימה) לכל צלחת 10 סנטימטרים לנתק את התאים. דגירה 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. הערה: אל טרום חם האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את האנזים עם 3 מיליליטר תקשורת E8 לכל צלחת. העברה ניתקה תאים לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר-אחד. הערה: תאי מקום על קרח מנקודה והלאה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuge ניתק תאים 5 דקות, XG 500 ב 4 מעלות צלזיוס. לשאוב supernatant להסיר אנזים ותקשורת. הערה: השהה נקודה. תאים יכולים פלאש-קפוא בחנקן נוזלי להיות, מאוחסנים ב -80 ° C לעיבוד לאחר מכן במועד מאוחר יותר. </li></ol> 2. בידוד של הכרומטין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ COSMIC 1.2 מיליליטר (20 מ&quot;מ טריס-HCl [pH 8.1], 2 מ&quot;מ EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% Triton-X100, 0.1% SDS) ופיפטה מעלה ומטה מספר פעמים לresuspend תא גלולה עבור כל דגימה ב 1.2 מיליליטר חיץ קוסמי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 133 μl כל של 100 מ&quot;מ פלואוריד phenylmethylsulfonyl (PMSF), 100 מ&quot;מ benzamidine, ו -150 מיקרומטר pepstatin מעכבי פרוטאז טרי לריכוז סופי של 1 מ&quot;מ לPMSF וbenzamidine ו -1.5 מיקרומטר לpepstatin. פתרון פיצול של lysate התא לשני ענבר 1.7 מיליליטר צינורות microcentrifuge. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate עם sonicator 35 דקות (10 שניות על, 10 שניות את, 60% כוח) לפצל את הגנום לבין 100נ&quot;ב nd 500. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על הרמה של פתרון הכרומטין במקביל צינור microcentrifuge לרמה של מים במאגר. אשר רמה זו על ידי בדיקה ויזואלית. הערה:. ודא שה- DNA היה טעון עם 1.5% agarose ג&#39;ל 55 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל את זמן sonication באופן אמפירי. השתמש בכמות מינימאלית של קרח במאגר לצנן את הדגימות, ולהבטיח את הקרח לא מפריע בין הדגימות וקרן הכוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם XG 12,000 10 דקות. שמור את התמיסה המימית המכילה הכרומטין המסיס על ידי העברתו לצינור microcentrifuge הענבר חדש עם טפטפת. זורק את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את 110 μl (10%) של מדגם לצינור microcentrifuge חדש ולתייג אותו DNA קלט. חנות ב -80 מעלות צלזיוס. שמור את שאר מדגם הכרומטין על קרח לשימוש בשלב 3.3. </li></ol> 3. לכידה של יגנד-DNA Crosslinks <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה לוותר streptavi 60 μlדין מצופה חרוזים מגנטיים בצינור microcentrifuge. הוסף 1 מיליליטר חיץ קוסמי ולערבב בדקות nutator 5 ב RT. הנח חרוזים מגנטיים על הפרדה מגנטית לצבור 2 דקות כדי ללכוד חרוזים. הסר חיץ קוסמי עם טפטפת. הערה: אל תאפשר את החרוזים להתייבש. פנה מייד לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מדגם הכרומטין (~ 1 מיליליטר) לחרוזים (60 μl) וresuspend את החרוזים. דגירה הכרומטין עם חרוזים streptavidin מצופה מגנטיים לפחות 4 שעות במערבל מסתובב, מתנדנד על 4 מעלות צלזיוס. דגירה דגימות O / N אם תרצה בכך. </li></ol> 4. בידוד של DNA מטוהר-זיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חרוזים עם 7 מרווח דקות ב RT עם המאגרים לשטוף הבאים כדי להסיר אינטראקציות שאינן ספציפיות. השתמש במדף הפרדה מגנטי כדי ללכוד חרוזים לאחר כל שטיפה. Resuspend חרוזים לאחר כל שינוי בחיץ כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגרים לשטוף במים ללא יונים מזוקקים ומסנן (0.2 מיקרומטר) לפני השימוש. מאגרים לשטוף חנות 1 ו -2 על 4 מעלות צלזיוס ליםחודשי everal. הכן הצפת לשטוף 3 טרי בכל יום. הוספה והסרה של מאגרים לשטוף מן המדגם עם טפטפת. עבור 2 ו -4, להוסיף 1 ו -3 (5 מ&quot;מ), בהתאמה, בשוטף. בנוסף ניתן לכבס דגימות פעמיים עם חיץ קוסמי (פעם אחת 12 שעות, פעם 4 שעות) לפני שוטף המפורטים להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם הצפת לשטוף 1 (10 מ&quot;מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA, 3% SDS). שטפי פעם עם הצפת לשטוף 2 (10 מ&quot;מ טריס-Cl [pH 8.0], 250 מ&quot;מ LiCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP40, 1% deoxycholate נתרן). לשטוף פעמיים עם הצפת לשטוף 3 (4 M אוריאה, 10 מ&quot;מ טריס-Cl [pH 7.5], 1 mM EDTA, 0.1% NP-40). לשטוף פעמיים עם טריס EDTA (TE) חיץ (10 מ&quot;מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 mM EDTA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend חרוזים במאגר TE 200 μl עם טפטפת. מדגם זה של ה- DNA שנתפס נקרא DNA מטוהר זיקה (AP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים את ה- DNA הקלט וAP עם 10x היפוך מאגר Crosslink (100 מ&quot;מ טריס-Cl [pH 8.0], 1 M KOH, 4 מ&quot;מEDTA) ל1x ריכוז סופי. 56,57 30 דקות לדגור על 90 מעלות צלזיוס. הערה: גם 254 ננומטר קרינת UV ניתן להשתמש כדי להפוך את crosslink psoralen, 58 אבל יכולים להיווצר הדימרים פירימידין cyclobutyl מקרינה באורך גל זה ומפריע לעיבוד במורד הזרם של ה- DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לAP DNA, במקום צינור microcentrifuge המכיל את המדגם על הפרדה מגנטית לצבור 2 דקות ב RT והנוזלי (DNA) בידוד עם טפטפת. העבר AP DNA (שכבר שוחרר מהחרוזים) לצינור microcentrifuge הענבר חדש. הערה: ה- DNA AP הרצוי בנוזל, כבר לא מחובר לחרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל קלט וDNA AP עם HCl המרוכז לpH 7 על ידי הוספה כ 1 μl 6 N HCl לכל 100 מדגם μl עם טפטפת. לאשר את הדגימות נוטרלו על ידי הוספה ~ 0.5 μl על נייר pH עם טפטפת אזהרה:. HCl מרוכז הוא חומצת מאכל חזקה. ידית פי המוסד שלך217; הנחיות של לציוד מגן האישי המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף RNase (100 מ&quot;ג / מיליליטר) 0.2 מיקרוגרם / μl ריכוז סופי לשני קלט וAP DNA. דגירה השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. להוסיף proteinase K (20 מ&quot;ג / מיליליטר) 0.2 מיקרוגרם / μl ריכוז סופי לשני קלט וAP DNA, להוסיף. דגירה שעה 1 על 55 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- DNA עם ערכת ניקוי עמודת ה- DNA (ראה רשימת חומרים). 55 Elute DNA ב -58 H הכיתה DNA μl 2 O. דגימות קלט החנות וAP ב -20 או -80 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח AP DNA על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים (qPCR) עם פריימרים מוקד ספציפי, ו / או על ידי רצף של הדור הבא. לqPCR, להשתמש 2 μl DNA AP למוקד עם הפרמטרים הבאים: מחזור 1 של 95 מעלות צלזיוס 10 דקות ו -40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס 20 שניות, 54 מעלות צלזיוס או 56 ° C 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס 40 שניות. הערה: טמפרטורת חישול צריכה להיות שונה בהתאם לטמפרטורת ההתכה של זוגות פריימר משמשים. בחר טמפרטורות חישולמחדש שממזער את מחזור quantitation ללא הגברה ספציפי. הערה: לניתוח על ידי רצף של הדור הבא, לשאוף לפחות 10 מיליון ממופים קורא. מספר הממופה קורא יכול להיות מוגבר על ידי הגדלת כמות ה- DNA AP ועל ידי שילוב של פחות דגימות בריצה רצף. עוד קוראים לשפר את הרגישות. חבילות סטנדרטיים לניתוח שבב seq (למשל, הומרו, 59 MACS, 60 וSPP 61) לעבוד עם נתונים קוסמי ואילך. כמו בשיטות אחרות המסתמכות על רצף של הדור הבא, כוללים רצף הגנום ושבב seq, אזורים חוזרים ליצור בהירויות ביישור והרכבה ובכך להישאר אתגר טכני. </li></ol>

א.ז.א. היא הבעלים הבלעדיים של Vista Motif, LLC ו-WINStep Forward.

אחד האתגרים העיקריים עם ChIP קונבנציונלי הוא זיהוי נוגדנים מתאימים. ChIP תלוי במידה רבה באיכות הנוגדן, ורוב הנוגדנים המסחריים אינם קבילים ל-ChIP. למעשה, קונסורציום האנציקלופדיה של יסודות ה-DNA (ENCODE) מצא שרק 20% מהנוגדנים המסחריים מתאימים לבדיקות ChIP. 50 עם COSMIC, הנוגדנים מוחלפים בסטרפטווידין. מכיוון שפוליאמידים מתפקדים עם ביוטין, סטרפטווידין משמש במקום נוגדן כדי ללכוד קישורים צולבים של פוליאמיד-DNA. האינטראקציה בין ביוטין לסטרפטווידין היא אחת החזקות ביותר הידועות בטבע וחזקה פי אלף עד מיליון מהאינטראקציה ...

המידע להפוך כל תא בגוף האדם מקודד בדנ&quot;א. השימוש סלקטיבי במידע שמסדיר את גורלו של תא. גורמי שעתוק (TFS) הם חלבונים שנקשרים לרצפי DNA ספציפיים להביע משנה מסוים של גנים בגנום, והתקלה של TFS צמודה לתחילתה של מגוון רחב של מחלות, כולל פגמים התפתחותיים, סרטן, סוכרת ו . 1,2 אנחנו כבר מתעניינים בפיתוח מולקולות שיכולות באופן סלקטיבי להיקשר לגנום ולווסת רשתות רגולציה גן. Polyamides מורכבת מ-methylpyrrole N ו- N -methylimidazole הם מעוצבים באופן רציונלי מולקולות שיכולים למקד את ה- DNA עם ספציפיות וזיקות שגורמים יריבים טבעיים שעתוק. 3-6 מולקולות אלה נקשרים לרצפים ספציפיים בחריץ הקטן של ה- DNA. 4,5,7 -11 Polyamides להיות מועסק לשני להדחיק ולהפעיל את הביטוי של ז הספציפיEnes. 4,12-19 יש להם גם תכונות אנטי 12,13,25-30 20-24 ואנטי סרטניות מעניינות. תכונה מושכת אחד מפוליאמידים היא היכולת שלהם כדי לגשת לרצפי DNA המפוגלים 31,32 ועוטפים את חלבוני היסטון 9,10,33. כדי למדוד את ספציפיות מחייבות המקיפה של מולקולות ה- DNA מחייבת, המעבדה שלנו יצרה מזהה אתרו מקור השיטה (CSI). 34-39 ההתרחשות הצפויה של אתרי קישור המבוסס על במבחנה ספציפיות (genomescapes) יכול להיות מוצג בגנום, כי במבחנה עוצמות מחייבות הן ביחס ישר לקבועי עמותה (K). 34,35,37 genomescapes אלה מספק תובנה תפוסת פוליאמיד פני הגנום, אבל פוליאמיד מדידה מחייב בתאים חיים כבר אתגר. ה- DNA ארוז היטב בגרעין, שעלול להשפיע על הנגישות של אתרי קישור.ccessibility של רצפי DNA chromatinized אלה למפוליאמידים נשאר בגדר תעלומה. לאחרונה, שיטות רבות ללמוד אינטראקציות בין מולקולות קטנות וחומצות גרעין צמחו. 40-48 הלכידה הכימית הזיקה ורצפי DNA מקבילים מסיבי (Chem-seq) הוא טכניקה אחת כזו. Chem-seq משתמש פורמלדהיד לcrosslink מולקולות קטנות ליעד הגנומי של ריבית ונגזרת biotinylated של מולקולה קטנה של עניין כדי ללכוד את האינטראקציה יגנד-היעד. 48,49 crosslinking פורמלדהיד מוביל לאינטראקציות עקיפות שיכול לייצר תוצאות חיוביות שגויות. 50 פיתחנו שיטה חדשה, crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי), 51 עם photocrosslinker לחסל פסגות אלה מה שנקרא &quot;פנטום&quot;. 50 כדי להתחיל, עיצבנו ומסונתז נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. מולקולות אלה הכילו Pol ה- DNA מחייבתyamide, photocrosslinker (psoralen), וידית זיקה (ביוטין, איור 1). עם מפוליאמידים trifunctional, אנחנו יכולים קוולנטית ללכוד אינטראקציות פוליאמיד-DNA עם קרינת UV 365 ננומטר, אורך גל שאינו לגרום נזק לדנ&quot;א או לגרום crosslinking-לא-psoralen מבוססת. 51 הבא, אנו מפצלים את הגנום ולטהר את ה- DNA שנתפס תחת מחמיר, חצי תנאי -denaturing להקטין DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. לפיכך, אנו רואים COSMIC כשיטה הקשורים לכימיה-seq, אבל עם קריאת נתונים ישירים יותר של ה- DNA מיקוד. חשוב לציין, החלש (K 10 3 -10 4 M -1) זיקה של psoralen לDNA לא במובחן, פוליאמיד השפעה סגוליות. 51,52 ניתן לנתח קטעי DNA המועשר או על ידי תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים 51 (קוסמי qPCR) או על ידי רצף 53 (COSMIC-seq) של הדור הבא. נתונים אלה מאפשרים עיצוב של ligands משוחד, מודרך הגנום שביןלפעול עם הלוקוסים הגנומי הרצויים שלהם ולמזער את ההשפעות חוץ-היעד. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53510/53510fig1.jpg"/> איור 1. מפוליאמידים ביו ותכנית קוסמית. () מפוליאמידים מכבנה 1 - 2 יעד רצף ה- DNA 5&#39;-WACGTW-3 &quot;. מפוליאמידים יניארי 3 - 4 יעד 5&#39;-AAGAAGAAG-3 &quot;. טבעות של N-methylimidazole מודגשות לבהירות. חוגים פתוחים ומילאו לייצג -methylpyrrole N ו-methylimidazole N, בהתאמה. הכיכר מייצגת 3-chlorothiophene, ויהלומים מייצגים β-אלאנין. Psoralen וביוטין מסומנים על ידי P ו- B, בהתאמה. תכנית קוסמית (B). תאי מטופלים עם נגזרי trifunctional של מפוליאמידים. לאחר crosslinking עם קרינת UV 365 ננומטר, תאים LDNA ysed והגנומי הוא טעון. חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה מתווספים ללכוד adducts פוליאמיד-DNA. ה- DNA משתחרר ויכול להיות מנותחת על ידי PCR כמותית (QPCR) או על ידי רצף של הדור הבא (NGS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53510/53510fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>פניל מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בנזמידין</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פפסטאטין</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>Life Technologies</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>ניסינו יצרנים אחרים של עמודות DNA בהצלחה.</td></tr><tr><td>ערכת הכנה לדוגמא של TruSeq ChIP</td><td>Illumina</td><td>IP-202-1012</td><td>ניתן להשתמש בערכה זו להכנת DNA קוסמי לריצוף הדור הבא</td></tr><tr><td>מטריג'ל מטריצת קרום מרתף</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>356231 משמש לציפוי צלחות על מנת לגדל H1 ESCs</td></tr><tr><td>נייר pH</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה ענבר</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</tr><tr><td></td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן פיירקס</td><td>כל מקור</td><td></td><td>כלי אפייה של פיירקס מתאימים</td></tr><tr><td>qPCR מאסטר לערבב</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl (6 N)</td> <td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית רקמות בגודל 10 ס"מ</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נואטור</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנטי מתלה הפרדה</td><td>כל מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV</td><td>CalSun</td><td>B001BH0A1A</td><td>ניתן להשתמש במקורות UV אחרים, אך יש לבצע אופטימיזציה אמפירית של זמן הקישור המוצלב</td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>S4000 עם צופר 431C1</td><td>ניתן להשתמש בסוניקטורים אחרים, אך יש לייעל את תנאי הסוניקציה באופן אמפירי</td></tr><tr><td>לח CO2 חממת כל</td><td>מקור</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ארון בטיחות ביולוגי עם יציאת ואקום</td><td>בכל מקור</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מיפוי הגנום של תרופות-dna בתאי אינטראקציות עם cosmic (crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

הגנום הוא היעד של חלק מchemotherapeutics היעיל ביותר, אבל רוב התרופות האלה חסרות ייחוד רצף ה- DNA, מה שמוביל לרעילות ורבות תופעות לוואי שליליות הגבלת מינון. מיקוד הגנום עם מולקולות קטנות רצף ספציפי עשויה לאפשר מולקולות עם מדד טיפולי מוגבר ופחות השפעות חוץ-היעד. -methylpyrrole N / מפוליאמידים -methylimidazole N הם מולקולות שיכולים להיות מתוכנן בצורה רציונלית למקד רצפי DNA ספציפיים בדייקנות מופלאה. ושלא כמו גורמי שעתוק הטבעיים ביותר, מפוליאמידים יכולים להיקשר ל- DNA מפוגל וchromatinized ללא הפסד בזיקה. הסגוליות הרצף של מפוליאמידים נחקר בהרחבה במבחנה עם זיהוי אתרו מקור (CSI) ועם גישות ביוכימיות וbiophysical מסורתיות, אבל המחקר של פוליאמיד מחייב מטרות הגנומי בתאים נותר חמקמק. כאן אנו מדווחים על שיטה, crosslinking של מולקולות קטנות לאיזולההכרומטין te (קוסמי), המזהה אתרי פוליאמיד מחייב על פני הגנום. COSMIC דומה לimmunoprecipitation הכרומטין (שבב), אך שונה בשתי דרכים חשובות: (1) photocrosslinker מועסק כדי לאפשר לכידה סלקטיבית, באופן זמני בשליטה של ​​אירועים מחייבים פוליאמיד, ו- (2) ידית זיקת ביוטין משמשת כדי לטהר פוליאמיד conjugates -DNA בתנאי denaturing-למחצה כדי להקטין את ה- DNA שהוא אינן מחויב קוולנטית. קוסמי הוא אסטרטגיה כללית שניתן להשתמש בי כדי לחשוף את האירועים מחייבים הגנום של מפוליאמידים ותרופות כימותרפיות מיקוד הגנום אחרים.

כדי להסביר את פיצול הגנום לא אחיד ומשתנים אחרים, את ה- DNA המטוהר תמיד צריך להיות מנורמל נגד התייחסות של ה- DNA קלט. ניתן להשתמש בפריימרים ספציפיים למוקד של עניין. זה מועיל גם לנתח מוקד שבו המולקולה אינה צפויה לאגד, כביקורת שלילית. אנו רואים עלייה&gt; פי 100 בתפוסת פוליאמיד על הקרנה עם 365 ננומטר אור (איור 2). DNA המועשר יכול גם להיות מנותח על ידי רצף של הדור הבא. DNA מוכן לסידור באותו אופן כמו ה...

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את פרופילי קישור ברחבי הגנום של פוליאמידים ומולקולות קטנות אחרות המטרגות DNA בתאים. שיטה זו יכולה לסייע בקידום התחום של כימיה של תרופות המבצעות קישור ל-DNA, על ידי שימוש בגנום כדי להנחות את התכנון של מולקולות המטרגות DNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאינטראקציות ישירות בין ליגנדים ל-DNA נמדדות כדי לספק תובנה לגבי מנגנון הפעולה של ליגנדים הפועלים על הגנום.חלק מהסוכנים הטיפוליים המצליחים ביותר הם מולקולות קטנות הנקשרות ל-DNA ומפריעות לתהליכים גנומיים. למרות ששיטה זו פותחה כדי לחקור פוליאמידים, ניתן ליישמה גם על מחלקות אחרות של מולקולות המכוונות ל-DNA. התאים עבור ניסוי זה גודלים במצע E8 בצלחות של 10 cm, עם ציפוי פני השטח התומך בתאי גזע פלוריפוטנטיים, בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה עם לחות של 5% carbon dioxide.לפני הוספת הפוליאמיד, הסירו את מצע התרבית המשומש והוסיפו 8ml של מצע טרי לכל צלחת בקוטר 10 cm. מרגע זה והלאה, הגנו על התאים מאור כדי למנוע קשירה צולבת פוטו-כימית מוקדמת. באמצעות פיפטה, הוסיפו את הפוליאמיד ישירות למצע התרבית של כל צלחת.סובבו את הצלחת כדי לפזר את הפוליאמיד באופן אחיד בתוך המצע. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית של 5% carbon dioxide למשך 24 שעות, והבטיחו שהם מוגנים מאור. למחרת, שטפו כל צלחת של 10 cm בעזרת 4 ml של PBS באמצעות פיפט סרולוגית ומתקן פיפטינג.שאבו את ה-PBS והוסיפו 3 ml של מצע גידול E8. כאשר האורות מעומעמים, הניחו את התאים על משטח שטוח מחוץ למCסך (hood) והסירו את המכסים מחמש צלחות הגידול. הניחו מסנן זכוכית מעל חמש צלחות הגידול כדי לסנן אור עם lambda קטנה מ-300 nanometers.הניחו את מקור ה-UV מעל המסנן. בצעו קשירה צולבת (Cross-link) לדגימות למשך 30 דקות באמצעות קרינת UVA של 365 ננומטר. לאחר הקרינה ב-UVA, העבירו את צלחות התרבית בחזרה למנדף.שאבו את המצע באמצעות פיפטת פסטור המחוברת למלכודת ואקום ושטפו כל צלחת של 10 cm ב-4 ml של PBS. שאבו את ה-PBS והוסיפו 3 ml של אנזים לפירוק תאים לכל צלחת של 10 cm. דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.עצרו את פעולת האנזים באמצעות 3 ml של E8 Media לכל צלחה. העבירו את התאים המופרדים לשפופרת קונית אחת בנפח 15 ml. החלו להניח את התאים על קרח משלב זה ואילך.סבבו במערך צנטריפוגה את התאים שפורקו ב-500 x g ובטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) כדי להסיר את האנזים ואת המצע. כדי להתחיל את ההליך לבידוד כרומטין, הכינו את באפר ה-cosmic עם מעכבי פרוטאז טריים.הוסיפו למסגר (buffer) cosmic הבסיסי 12.1 מיקרוליטרים של כל אחד ממעכבי הפרוטאז הבאים: PMSF בריכוז 100 מילימולר, בנזמידין בריכוז 100 מילימולר ופפסטטין בריכוז 150 מיקרומולר, כשהם טריים. הוסיפו 1.2 מ"ל של מסגר cosmic למשקע התאים ושאבו בעזרת פיפט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להחזירם לסuspended. לאחר מכן, חלקו את תמיסת התאים לשתי פרועות מיקרו-צנטריפוגה בצבע ענבר בנפח 1.7 מ"ל.בצע סוניקציה באמצעות סוניקטור כדי לפרק את הגנום לגדלים שבין 100 ל-500 זוגות בסיסים. שמור על גובה תמיסת הכרומטין בפרוטובנצנטריפוגה במקביל לגובה המים במכלי השמורה. ודא את הגובה באמצעות בדיקה ויזואלית.זמן הסוניקציה עובד באופן אמפירי; בצעו סוניקציה בעוצמה של 60%, בשיטת 10 שניות פעילות ו-10 שניות מנוחה, למשך 35 דקות. השתמשו בכמות מינימלית של קרח במכל כדי לקרר את הדגימות, וודאו שהקרח אינו מהווה הפרעה בין הדגימות לבין ראש הסוניקטור (cup horn). עם סיום הסוניקציה, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-12 000 g למשך 10 דקות.שמרו את התמיסה המימית המכילה כרומטין מסיס על ידי העברתה לנבובת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בצבע ענבר. השליכו את המשקע. העבירו 110 µL או 10% מהדגימה לנבובת מיקרו-צנטריפוגה חדשה.סמנו זאת כ-DNA קלט ואחסנו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. שמרו את שאר דגימת הכרומטין על קרח לשימוש בשלבים הבאים של פרוטוקול זה. כדי ללכוד קישורי גומלה (cross-links) בין ליגנד ל-DNA, הוסיפו את שארית דגימת הכרומטין לחרוזי המגנט המצופים בסטרפטאווידין והשביו את התערובת לסספנסיון.הדגרירו את הכרומטין עם החרוזיים למשך ארבע שעות לפחות במערבל נדנדה מסתובב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יש להכין את בופר השטיפה הנדרש במים מזוקקים ודה-יוניים, ולסנן אותו באמצעות מסנן של 0.2 מיקרומטר לפני השימוש. ניתן לאחסן את בופרים 1 ו-2 בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים, אך יש להכין את בופר 3 טרי מדי יום.עם השלמת דגירה של הכרומטין עם חרוזי המגנט המצופים בסטראפטורידין, שטפו את הדגימה במשך שבע דקות בעזרת תמיסת שטיפה 1. הניחו את הדגימה במעמד להפרדה מגנטית כדי ללכוד את החרוזים והסִירו את תמיסת שטיפה 1. הוסיפו תמיסת שטיפה 2 ושטפו למשך 7 דקות נוספות.לאחר מכן, שטפו פעמיים עם wash buffer 3 למשך שבע דקות לכל שטיפה. לבסוף, שטפו פעמיים עם TE Buffer. לאחר השטיפה האחרונה עם TE Buffer, השעו שוב את החרו지를 ב-200 microliters של TE Buffer.דגימה זו של DNA שנלכד נקראת DNA מטוהר בזיקה (affinity purified) או AP DNA. לאחר מכן, הוסיפו ל-DNA הקלט (input DNA) ול-AP DNA בופר להסרת קשרי צלב (cross-link reversal buffer) בריכוז 10x עד לריכוז סופי של 1x. דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס.הניחו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה המכילה את ה-AP DNA על מעמד הפרדה מגנטית למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן העבירו את הנוזל המכיל את ה-AP DNA למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בצבע ענבר. לאחר נטרול ה-Input וה-AP DNA, הוסיפו RNase A לשתי דגימות ה-DNA עד לריכוז סופי של 0.2 µg/µL. דגרו למשך שעה אחת ב-37 °C.לאחר שעה, הוסיפו Proteinase K הן ל-Input DNA והן ל-AP DNA עד לריכוז סופי של 0.2 µg/µL. דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 55 °C. לאחר מכן, טהרו את ה-Input וה-AP DNA באמצעות ערכה לניקוי DNA בעזרת עמודה (DNA column clean up kit) ובצעו אלוציה במים בדרגת DNA.יש לאחסן את ה-DNA בטמפרטורה של 20 או 80 מעלות צלזיוס עד למועד הניתוח. יש לנרמל תמיד את ה-DNA שנקה בשיטת Affinity אל מול רפרנס של Input DNA. תוצאות מייצגות מ-qPCR עם פריימרים ספציפיים לאתר מראות עלייה של יותר מ-100 שניות בתפוסת הפוליאמיד לאחר הקרה באור באורך גל של 365 ננומטר.ניתן לנתח DNA מועשר גם באמצעות ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing). לאחר הריצוף, רכיבי DNA גולמיים מיושרים לגנום ומוכנות מסלולי צפיפות (density tracks). דוגמה זו מציגה את מסלול הצפיפות עבור Linear Polyamide 4 שתוכנן לטרגט חזרות AAG.ניתוח של התפלגויות פוליאמידים בתאים גילה כי אתרי קישור מקובצים המקיפים טווח רחב של זיקות חוזים באופן הטוב ביותר את התפוסה בתאים. אלגוריתם פותח כדי לדרג את הגנום כולו עבור קישור באמצעות נתוני זיהוי אתרים קוגנטיים in vitro. תרשימי כינור אלו מציגים ציונים חזויים עבור קישור של Polyamide 2 ו-Polyamide 4 לאורך הגנום כולו.מוצגים גם גנום-סקייפים (genomescapes) מייצגים עבור פוליאמיד 4. שיטת דירוג זו חשפה כי לוקוסים בעלי רצפים מרובים בעלי זיקה נמוכה ובינונית מראים תפוסת פוליאמיד דומה ללוקוסים בעלי רצפים בודדים בעלי זיקה גבוהה. לאחר השליטה בשיטה, ניתן להשלים את הטכניקה ביומיים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגן על הדגימות מאור עד לטיהור ה-DNA. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון RT-PCR ו-RNase C כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת הקישור על ביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו משתמשים ב-cosmic למיפוי פרופילי קישור של פוליאמידים ברחבי הגנום.

genome-wide-mapping-drug-dna-interactions-cells-with-cosmic

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטת Hi-C מאפשר זיהוי משוחדת, גנום רחב של אינטראקציות הכרומטין (1). Hi-C זוגות קשירת סמיכות וסדר מקבילי מאסיבי. הנתונים וכתוצאה מכך ניתן ללמוד אדריכלות גנומית בקני מידה מרובות: התוצאות הראשוניות זיהו תכונות כגון בשטחים כרומוזום, הפרדה של הכרומטין פתוח, סגור, מבנה הכרומטין בקנה מידה megabase.

Hi-C: שיטה לחקר ארכיטקטורה תלת ממדי של הגנום.

המלכודת קשורה כרומוזום (ACT) assay היא שיטה חדשנית לזיהוי משוחדת ארוכי טווח אינטראקציות-DNA. אפיון האינטראקציות DNA ארוך טווח תאפשר לנו לקבוע את הקשר של האדריכלות גרעינית ביטוי גנים בפיזיולוגיה הן נורמליות במדינות חולה.

כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

אנו מתארים זאת assay על ידי צימוד זיהוי methyltransferase אדנין DNA (DamID) לרצף תפוקה גבוה (DamID-seq). שיטה משופרת זה מספקת רזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר, ומאפשרת ניתוח נתונים DamID-seq בשיתוף עם נתונים רצף אחרים תפוקה גבוהה כגון שבב seq, RNA-seq, וכו '...

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות השלכות פונקציונליות של משתנים שאינם קידוד המזוהים על ידי לימודי הגנום הרחב (GWAS) באמצעות אינטראקציות תלת ממדיות של כרומטין.

מיפוי מחלת אלצהיימר משתנים גנים היעד שלהם באמצעות ניתוח חישובית של תצורת כרומטין

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

כאן מוצג פרוטוקול למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי ברזולוציית נוקלאוזומים בשיטת לכידת קונפורמציה כרומוזומים רחבת גנום Micro-C-XL.

מיפוי אינטראקציות גנום תלת-ממדי של יונקים עם Micro-C-XL

אנו מציגים שיטה מהירה ויעילה לאיתור פריצת אתרים שבירים נפוצים באמצעות γH2A.X כרומטין אימונו-משקעים (ChIP). גישה זו מפחיתה משמעותית הן את הזמן והן את העבודה הקשורים למבחני γH2A.X ChIP מסורתיים תוך שמירה על יכולת שחזור ואמינות גבוהה של התוצאות.

לכידת שברי אתרים שבירים נפוצים על ידי γH2A מקורי. X ChIP

למד את שיטת COSMIC למיפוי אינטראקציות DNA-תרופות בקנה מידה גנומי. טכניקת חציבת הכרומטין מאפשרת מדידה ישירה של קשרי ליגנד-DNA ומספקת תובנות למנגנוני פעולה של מולקולות קטנות המכוונות לגנום.

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

גלה סרטונים נוספים