אסטרטגיה כדי לאמת את התפקיד של Gating Plasmodesmal בתיווך Callose במענה חוג

המטרה הכוללת של הליך זה היא לסנן את הגנים המעורבים בשער פלסמודסמלי בתיווך קלוז במהלך תגובה טרופית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית של הצמח, כגון אילו גנים לא ידועים שולטים באיתות תא לתא על ידי פלסמודסמטה במהלך תגובה טרופית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, עובדת גם וחוזרת על עצמה.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיפול בהיפוקוטיל אטיולציה של Arabidopsis ללא כל נזק במהלך כל התהליך הוא מאתגר. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר קבענו את הכלל של GSL8, סינתאז גלוקוז בשער פלסמודזמלי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהנהלים המוזכרים באודיו לא הסבירו את השלבים הקריטיים שקשה לבצע מכיוון שהם היו זקוקים להגדרה וטיפול מיוחדים.

הכינו Murashige ו-Skoog, או מדיום MS, יום אחד לפני הניסוי. בצע חיטוי ומלא צלחות מרובעות של 125 מילימטר ב-50 מיליליטר מדיה לכל צלחת. למחרת, זרעי נקודות שעברו עיקור עם 1.1% נתרן היפוכלוריט על צלחות מיובשות למחצה.

מקצה מיקרופיפטה בגודל 1 מילימטר, מנקדים זרעים עם 200 מיקרוליטר מים. מסדרים את הזרעים בחמש שורות, במרחק של 1.8 סנטימטרים זה מזה, כאשר הזרעים נמצאים במרחק של מינימום 0.1 סנטימטרים זה מזה בשורות. תן למעט מים להתאדות לפני שמכסים ואוטמים את הצלחות בסרט כירורגי.

לאחר מכן עוטפים את הצלחות בנייר כסף ומניחים אותן בתוך קופסה. דגרו את הקופסה בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים של טיפול קר, העבירו את קופסת הזרעים ל -22 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים.

לאחר שלושה ימים נוספים, בחדר חשוך, בדוק את מצב הנביטה של הזרעים באור ירוק. בדרך כלל, שתילים אטיוליים של Col-0 בני שלושה ימים גדלים באורך של עד 1.6 סנטימטרים. תחת האור הירוק, נתח את התגובה הפוטוטרופית והגרביטרופית שהשתנתה.

בעזרת בחירה מעוקרת, בחרו שתילים בגודל דומה עם צמיחה ישרה ואנכית. הרם בעדינות את השתילים מהחלק התחתון של ההיפוקוטיל שלהם מבלי לגעת בחלקים אחרים. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השתילים שנבחרו לצלחת אגר MS טרייה.

בצלחת החדשה, כוונו את ווי השתילים באותו אופן. בחר לפחות 20 שתילים מכל רקע גנטי כדי ליצור כל שורה, וצור שכפול של כל צלחת. כל לוח מכיל שני גנוטיפים בשתי שורות.

כדי לבדוק את התגובה הפוטוטרופית, מקם את הלוחות בקופסה שחורה כך שהשתילים יהיו מכוונים אנכית. השאירו צד אחד של הקופסה פתוח לקצה הצלחות. לאחר מכן, דגרו את הקופסה בתא גידול צמחים עם אור לבן חד צדדי.

כדי לבדוק את התגובה הגרביטרופית, עטפו את הצלחות בנייר כסף והכניסו לקופסה שחורה כך שהשתילים יהיו אופקיים. במספר נקודות זמן, בדרך כלל החל מ-90 דקות ונמשכות עד 12 שעות, צלם את הלוחות בתנאי תאורה חלשים. השתמש בסורק המוגדר לאיסוף תמונות JPEG של 600 DPI.

כדי למדוד את זווית הכיפוף של השתילים, טען את התמונות שלהם בתוכנת ImageJ. השתמשו בכלי ההגדלה כדי להגדיל את התצוגה, וגללו לשתיל לניתוח. לאחר מכן השתמש בכלי הזווית כדי למדוד את הזווית שבה השתיל כפוף.

לשם כך, לחץ פעמיים באמצעות לחצן העכבר השמאלי על נקודת הכיוון המקורית של גידול ההיפוקוטיל A, וגרור את העכבר לנקודת התחלת הכיפוף B.לאחר מכן, השתמש בלחיצה שמאלית כדי לצייר את הקו הראשון. כעת, גרור את העכבר מנקודה B לקצה הכיפוף, נקודה C, והשתמש בלחיצה שמאלית כדי לצייר את הקו השני, וליצור זווית, A.זווית הכיפוף האמיתית היא זווית B, השווה ל-180 מעלות מינוס זווית A.כעת, מדוד ורשום זווית A על ידי לחיצה על M במקלדת. קובץ התוצאה ייפתח בנפרד.

חזור על השלב הקודם למדידת שאר השתילים, ומדוד את הזווית הממוצעת של שני רקעים שונים באמצעות קובץ הגיליון האלקטרוני של ערכת הנתונים. הכנת בלוקי האגרוז של HPTS הדרושים לבדיקה זו מכוסה בפרוטוקול הטקסט. התחל בהכנת דגימות הצמחים.

בדוגמה זו מנותחים מוטנטים עם מגבלת אי הכללה של גודל פלסמודסמטה שונה. ראשית, צור פלטפורמה לבדיקה. הנח שקופית כיסוי מיקרוסקופ על צלחת בינונית חדשה של MS.

לאחר מכן, מצלחות MS עם שתילים אטיולטים בני שלושה ימים, השתמש במספריים כירורגיים חדים כדי להוציא בזהירות את השתילים מבסיס הקרס, ולהעביר אותם לזכוכית הכיסוי. העבירו לפחות חמישה שתילים לכל רקע גנטי. כוונו את השתילים כך שיישארו רק 0.5 סנטימטרים של היפוקוטיל ממצב הכריתה על שקופית הכיסוי ושאר ההיפוקוטיל נוגע במדיום.

לאחר מכן, הניחו גוש אגרוז HPTS על גבי השתילים שנכרתו כך שהאזור שנכרת יהיה במגע עם בלוק ה-HPTS. ודא שהמגע נוצר. הניחו לבלוק לשבת על ההיפוקוטיל במשך חמש דקות.

לאחר מכן, העבירו את ההיפוקוטילים לצלחת פטרי בגודל 10 מילימטר המכילה מים מזוקקים כפולים, ושטפו אותם בניעור במשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו את השתילים השטופים לשקופית. מקם כל מוטאנט ליד פקד כדי לבצע השוואות ישירות.

מכסים את ההיפוקוטיל ב -100 עד 150 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ומורחים שקופית כיסוי. כעת, נתח את השקופית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לצורך בדיקה זו, השתמש בצבע שהוכן טרי בן פחות מיומיים ונשמר בחושך.

כדי לעכב סינתזת דה נובו קלוז, הוסף לצבע 1.5 מילי-מולר של 2-Deoxy-D-גלוקוז. התחל בדיקה זו על ידי בחירת שתילים אטיולטים בני שלושה ימים לצביעת קלוזה, עם או בלי תגובה טרופית. חותכים את השתילים מאזור הקרס שלהם בעזרת מספריים כירורגיים דקים.

לאחר מכן, בעזרת קצה קיסם, העבירו את השתילים בצלחת פטרי קטנה המכילה שני מיליליטר של מאגר מכתים. דגרו את השתילים במאגר הצביעה בחושך למשך שעתיים עם ניעור מתמשך ב -30 סל"ד. לאחר הצביעה יש לשטוף את השתילים במים מזוקקים כפולים למשך שתי דקות כדי להסיר את מאגר הצביעה העודף.

לאחר הכביסה, בחר לפחות חמישה שתילים מכל רקע לניתוח קונפוקלי. מדוד את עוצמת אות הקאלוזה עם תוכנת ImageJ. פתח את קובץ המיקרוסקופיה הקונפוקלית שכבר נשמר בפורמט JPEG בתוכנת ההדמיה.

לאחר מכן, באמצעות כלי הבחירה המלבני, גרור את הסמן מעל התמונה ובחר את האזור לבדיקה. לאחר מכן, מדוד ורשום את הערכים המספריים עבור עוצמת האות על ידי לחיצה על M.התוצאה file ייפתח בנפרד. בקובץ התוצאות, המונח Mean"מציין את עוצמת האות של האזור שנבחר, ולא את הממוצע של מספר אזורים.

בזה אחר זה, נתח את האות בצורה זו עבור כל שתיל. חזור על השלב לעיל למדידת שאר השתילים, ומדוד את הזווית הממוצעת של שני רקעים שונים באמצעות קובץ הגיליון האלקטרוני של ערכת הנתונים. באמצעות הפרוטוקולים המתוארים, נותחו קווי RNAi הניתנים להשראת דקסמתזון של AtGSL8.

שתילי DsGSL8 היו פגומים בבירור בפוטוטרופיזם ובגרביטרופיזם. הם לא הפגינו שום התכופפות תחת השפעת אף אחד מהכוחות. שינויים בתנועה הסימפלזמית הראו שתנועת הצבע של HPTSA הייתה נרחבת יותר באופן משמעותי ב-dsGSL8 RNAi מאשר בשני הבקרות.

קלוז הוא אחד הרגולטורים העיקריים של מגבלת אי הכללת גודל פלסמודסמטה, ו-AtGSL8 הוא סינתאז פלסמודסמטה קלוז ידוע. אז, בוצע צביעה כחולה של קלוז אנילין. בביקורת, קלוז הצטבר לאחר שש שעות, כפי שמסומן על ידי חיצים צהובים.

עם זאת, לאחר שש שעות, למוטאנטים היו רמות פלסמודסמטה קלוז נמוכות באופן מתמשך. היעדר זה של סינתזת קלוז היה פחות מדיד כבר שלוש שעות לאחר הפוטוטרופיזם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע סינון מהיר של גנים בווריאנט השולט בשער פלסמודסמלי עקב תגובה טרופית באמצעות אפנון יבלות בלבד.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשש שעות לאחר נביטת שתילי Arabidopsis של שלושה ימים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להימנע מפגיעה בשתילים בזמן העברתם. כמו כן, חשוב ליצור מגע נכון בין האגר להיפוקוטיל במהלך בדיקת ההעמסה.

לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לביולוגיה התפתחותית לחקור גנים, גנים חדשים, הממלאים תפקיד בשליטה על מוליכות סימפלזמית במהלך טרופי