Name: הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: חקור שינויים בכלי דם אימהיים במהלך הריון בעכברים באמצעות שיטות סטריאולוגיות ואימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של עורקי ספירלת הרחם והשלכותיהם על צמיחת העובר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת קולוצ'י על הדיונים המועילים. עבודה זו מומנה על ידי קרן וולקאם [094073/Z/10/Z], המרכז לחקר טרופובלסט וקרן הלב הבריטית.

כל הנהלים דנו בכתב יד זה הם בהתאם לתקנות משרד פנים בבריטניה ומאושרות על ידי לוח הסקירה אתית קיימברידג &#39;. 1. דגימה אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הזדווגויות מתוזמן באמצעות C57BL / 6 נקבות עכברים ישנים 8-12 שבוע עם זכרים בוגרים (עד 2 נקבות לזכרים) בשעתי אחר הצהריים. לבדוק את קיומו של תקעי נרתיק כסימן להזדווגות מוקדם בבוקר בימים הבאים. הנוכחות של תקע בgd0.5 סימני בוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על gd9.5, להרדימו נקע בצוואר רחם ולפתוח את חלל הבטן. הערה המתת חסד שעל ידי CO 2 עלולים לגרום vasodilatation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בחוט דנטלי ולקשור בעדינות את עורקי רחם (איור 1, חצים מקווקוים). לקשור את החוט סביב העורקים בקצה של כל קרן רחם, הפרוקסימלי לשחלות, כמו גם סביב צוואר הרחם. הערה: אל להיקרע כלי מכיוון שהדבר עלול לגרום לעורקים התמוטטו. </li> &lt;li&gt; לנתח את הרחם במהירות באמצעות מספריים לנתיחה, מוציא את כל הרחם distally לשלוש נקודות קשירה בקצה קרן הרחם וצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם על פיסת קלקר מוכנה כך ששני הקרניים מיושרות לאורך אותו הציר הארוך בכיוונים מנוגדים מצוואר הרחם. בעדינות למתוח אותו ולהצמיד למקום באמצעות 2-3 25 מחטי G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הקלקר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר מוכן. ראש הדף עד 50 מיליליטר עם פורמלין 10%. תקן עבור 5-6 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון פורמלין ולהחליף עם 50 1x מלוח מיליליטר פוספט (PBS) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו שתי קרנות רחם proximally לנקודת קשירה בכל קצה וproximally לצוואר הרחם במרכז, לקצץ משם כל שומן עודף סביב אתרי ההשתלה ולשטוף פעמים PBS במשך 5 דקות כדי להסיר עקבות של פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הדגימות באתנול 70% ב 4 ° C. (לתקופה של עד שבועיים) עד לעיבוד. זהירות: Ethanol הוא דליק מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת עיבוד אוטומטית באמצעות הפרמטרים שצוינו בטבלה 1. שבץ הקרניים בנפרד בפרפין, כך שהם יכולים לחתוך לאורך המישור ניצבת לציר של הרחם הארוך. הדבר מבטיח כי השטח המרבי של כל אתר השתלה יהיה חשוף לניתוח באמצע הבלוק (איור 2 א). אופציונאלי: זוהי נקודת זמן נוחה לאקראית של בלוקים אם תרצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome, לחתוך קטעים סידוריים של 7 עובי מיקרומטר מהלוקים. כתם סעיף אחד בכל מרווח 49 מיקרומטר עם hematoxylin ו eosin (H &amp; E, ראה סעיף 2.1). אחסן את החלקים שנותרו בטמפרטורת חדר למשך צביעת SMA ויישומים במורד הזרם אחרים. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> פִּתָרוֹן </td><td style="width:43px;"> זְמַן<html></td><td style="width:97px;"> טֶמפֶּרָטוּרָה </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 70% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> אתנול 100% </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21">21px; &quot;&gt; קסילן: </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> קסילן </td><td> שעה 1 </td><td> 40 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> פָּרָפִין </td><td> שעה 1 </td><td> 63 מעלות צלזיוס </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. הגדרות עבור עיבוד רקמות אוטומטי סקירה כללית של ההגדרה המשמשת לעיבוד של רקמת רחם 2. Sterהערכת eological <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> H &amp; E מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית לתוך אמבטיה קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: קסילן הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. עבודה זו חייבת להתנהל במנדף, תוך שימוש בציוד מגן אישי (PPE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון של 50% 3 hematoxylin גיל לא, מדולל במים מטוהרים, במשך 5 דקות. זהירות: Hematoxylin מזיק על ידי בליעה ומגע לעיניים. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון 1% חומצה / אלכוהול (1% חומצה הידרוכלורית 10 M באתנול 70%) למשך 10 שניותולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות בפתרון eosin למשך 30 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 70% אתנול, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבש אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת Stereological של גודל כלי שיט וסטטוס שיפוץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אתר השתלה, לקבוע אילו חלקים קרובים לנקודת midsagittal. הקובץ המצורף chorioallantoic בין השליה לעובר ופיתוח משמש כמדד טוב לנקודת midsagittal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 3 חלקים ב 49 מיקרומטר במרווחים קרובים לנקודת midsagittal לניתוח. סריקת שקופיות שנבחרו. על מנת להימנע מIncורידי luding, אשר הוכחו להיות ממוקמים יותר שולי באתרי ההשתלה 16, להגביל את הניתוח על 2/4 של כל אתר השתלה (איור 2 א) המרכזי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך גודל לומן, לצייר סביב החלק הפנימי של כלי הדם ולהקליט את השטח של צורה זו. לסך גודל הכלי, לצייר סביב הקיר החיצוני של כלי השיט, כולל תאי אנדותל, pericytes ולויקוציטים ביצוע עצמי. הערה: היחס בין סך גודל כלי ללומן הוא מדד למצב שיפוץ של ספינה. ככלי סליל באמצעות המטוס שהסעיף היה לחתוך לאורך, ייתכנו חתכים מרובים של אותו העורק בשקופית אחת. הימנע מדידה אותו העורק מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המדידות מ 5 כלים בכל אתר השתלה עם לומן הגדול ועגול. למדוד כל אתר השתלה בשלושה עותקים (שלושה חלקים במרווחים 49 מיקרומטר זה מזה). הממוצע של 15 represe מדידות אלהNTS הקוטר הממוצע של כלי הגדולים ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מייצוג יתר של כלי גדול יותר בכמה דוגמאות, למדוד אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. </li></ol></li></ol> 3. הערכה איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinization וRehydration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי Deparaffinize ידי טבילת שקופיות רכובים במעמד שקופית חסינה חומה לאמבטית קסילן 100% במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילות קסילן הנקי לעוד 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות 100% אתנול, 95% אתנול ו -70% ומים מטוהרים במשך 5 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטיגן אחזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ נתרן ציטרט 10 מ&quot;מ במים מטוהרים ולהתאים לpH 6 באמצעות 10 חומצה הידרוכלורית M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מיכל חסין חום שיכול להכיל 600 מיליליטר עם חיץ ציטראט 400 מיליליטר נתרן ומקום בסיר לחץ מקומי המכיל ואט מספיקאה לצלול מחצית מהמכל. באופן רופף לצרף את המכסה של סיר הלחץ והחום עד רתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתלה מקום שקופיות למאגר נתרן ציטרט והדוק לתקן את המכסה של סיר הלחץ. ברגע שלחץ, לאפשר לרתיחה במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהַפִיג לַחַץ סיר הלחץ ולהסיר את המכל הפנימי. לאפשר שקופיות להתקרר במאגר נתרן ציטרט במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק באמבט המכיל מים מטוהרים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקיף את החלקים באמצעות עט מחסום הידרופובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי השריית בPBS במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת אנדוגני Peroxidase והלא ספציפי מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם מי חמצן 3% בדילול מלא במים מטוהרים בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות: מי חמצן הוא גירוי מאוד לעיניים, עור ועל בליעה. ללבוש PPE המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון מי חמצן עודף ולשטוף SLIdes פעמיים על ידי השריית בטריס שנאגרו מלוח (TBS) עבור 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי דגירה עם אימונוגלובולינים עכבר חסימה מגיב מאת העכבר על ערכת עכבר הוכן בהתאם להוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS עבור 2 דקות כל אחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunodetection של אקטין שריר חלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן diluent (הניתן בערכה) ודגירה עם קטעים של 5 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1: שריר אקטין חלק 100 עכבר אנטי-אנושי (DAKO M0851) בפתרון diluent הנוגדן. לדלל את שליטת אלוטיפ עכבר IgG2a בפתרון diluent נוגדן, להבטיח כי ריכוז אימונוגלובולינים הסופי הוא שווה ערך בשני הפתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את סעיפי פתרון diluent הנוגדן וכיסוי עודפים עם פתרונות בקרה או בדילול נוגדן או אלוטיפ. דגירה בתא humidified למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות פעמיים ב TBS ל2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל נוגדנים משני אנטי עכבר biotinylated דגירה סעיפים במשך 10 דקות בטמפרטורת חדר, או על פי הוראות יצרנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות אחת לעם כפות וPBS למשך 2 דקות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) על פי הוראות יצרן. לכסות חלקים עם פתרון DAB ודגירה של עד 4 דק &#39;, הבטחה לעקוב אחר חלקים, כדי למנוע התפתחות צבע עודפת. זהירות: DAB הוא דליק ומסרטן חשד שהוא רעיל באמצעות מגע ושאיפה. ללבוש PPE המתאים בעת טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות במים מטוהרים, כאשר מגיעה לעצמה רצויה של צביעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם 50% גיל מס &#39;3 hematoxylin במשך 20 שניות ולשטוף בשוקת צביעה תחת זרם מים ברז עד המים פועל ברורים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייבשות והרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך מנדף, ברצף לטבול שקופיות באמבטיות המכילות ETH 70%anol, 95% אתנול ו 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את השקופיות באמבטיה המכילה קסילן במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips באמצעות הרכבה בינונית מבוסס קסילן. ייבשו אופקי וביסודיות במנדף לפני לדמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ </li></ol></li></ol>

<ol><li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li>
<li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy%3A+facts+and+controversies%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li>
<li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li>
<li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li>
<li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification%2C+decidual+integrity%2C+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li>
<li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li>
<li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li>
<li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li>
<li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li>
<li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth%3A+in+medio+stat+virtus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li>
<li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li>
<li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li>
<li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation%3A+maternal+care+before+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li>
<li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li>
<li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model%3A+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li>
<li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li>
<li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships%3A+Moving+from+Humans+to+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Med%22%5BJournal%5D)">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המובא כאן נועד לספק שיטה לשחזור הקשורים ליישום שינויים בכלי הדם הנדרשים להריון מוצלח. קריטי להצלחה של הערכה זו היא האיכות של חלקי רקמות. שניהם קביעה מדויקת של גיל הריון אתרי השתלה וכן באופן מהימן ligating עורקי הרחם הם צעדים חיוניים. שינויים בפרמטרים כגון זמן של קיבעון, פרוטוקול עיבוד רקמות, וכו &#39;עשויים להשפיע גם על התוצאה. להערכה stereological משוחדת, חשוב למדוד את אותו המספר של כלי שיט בכל אתר השתלה. מומלץ למדוד 5 כלי לאתר השתלה וכל אתר השתלה בשלושה עותקים. הממוצע של 15 מדידות אלה מייצג את הגודל הממוצע של 5 כלי הגדולים ביותר. בהמשך לנתונים מRag2 alymphoid - / - IL2rg - / - עכברים שמוצגים כאן, מצאנו prot זהocol שימושי עבור מספר הדגמים של תפקוד מערכת חיסון אימהי לקוי, כולל אחד מתאי NK עכבות 14. פגמים בשיפוץ עורקים גם הוכחו במודלים של פלישת trophoblast לקוי 18 והטכניקות המתוארות כאן עשויות להיות מועילות כדי להעריך את כלי הדם במקרים אלה. אנו מותאמים ומאומתים פרוטוקול זה לחקירת שיפוץ כלי דם decidual באמצע ההריון בעכבר, אבל זה גם מתקבל על הדעת להתאים פרוטוקול זה לעבוד במערכות אחרות מודל (למשל חולדות) או אפילו באיברים אחרים. בעוד אנו מוצאים כי שיפוץ NK-תלוי ניתן להעריך חסונה בgd9.5, זה יכול להיות מתוקן לנקודות זמן אחרות כגון gd12.5, כאשר כלי הדם האימהיים הוא שופץ לחלוטין. בנקודה זו בזמן, פלישת trophoblast endovascular היא עמוקה יותר 16 ונקודת זמן זו עשויה להיות מתאימה יותר לחקירות של התפקיד trophoblast לשינויים בכלי הדם. אם קריאות כמותית נוספות רצויים,חוקרים יכולים גם להגדיל את מספר הסעיפים המוכתמים עבור SMA ולהעריך את אחוז כלי שופצו באופן חלקי בכל אתר השתלה. הגבלה של פרוטוקול זה היא תיאורי הטבע של בדיקות היסטולוגית. מבחני פונקציונליים, לעומת זאת, הם רק הופכים לאט זמינים (כגון אולטרסאונד דופלר 19). טכניקות אלה דורשות מומחיות טכנית והוצאות גבוהות בהרבה לרכישה ותחזוקה של ציוד, אבל יש את היתרון של מתן אורך קריאת נתוני vivo להשפעת השינויים שניתן לצפות בהיסטולוגיה. חסרון אפשרי של כל בדיקות stereological הוא הסובייקטיביות של החוקרים. לשם כך, באמצעות שני בוחנים עצמאיים שלנתח את כל הדגימות באופן עצמאי יכול לעזור כדי למנוע בעיה זו. בעוד הפרוטוקול המתואר כאן נותן תובנה כמה דם יכול להגיע לממשק fetomaternal, זה עשוי להיות יתרון לשלב את זה עם complגישת ementary של בחינת הסכום הכולל של דם בכל זמן נתון בכלי הדם דרך הפלסטיק מטילה 16. כוחו של פרוטוקול זה הוא שהוא משלב שתי גישות עצמאיות. שינוי בכלי דם הוא ראשון להעריך כמותית ידי stereology והתוצאה מכן תוקף איכותי באמצעות אימונוהיסטוכימיה. האמינות של התוצאות ניתן לחזק עוד יותר על ידי באופן אקראי, הדגימות. הדגימות מוכנות לפרוטוקול זה יכול לשמש בקלות גם לחקור פרמטרים אחרים של הריון כגון decidualisation, פיתוח כולל הלימפה mesometrial של הריון (MLAp) או immunodetection של תאים של עניין, כדי להעריך את הפנוטיפ הריון בקפדנות בmidgestation. שיפוץ עורקים הוא שלב קריטי להריונות לא מסובכים בנשים וכישלון של שינויים אלה בבסיס התסמונות הגדולות יילוד (GOS), כלומר רעלת הריון, הגבלה בגדילת העובר ולידת עובר מת. אנו מציגים כאן טכניקות כדי להעריך פנוטיפ הריון במודלים של עכברים המחקים כמה מאפיינים של הפתופיזיולוגיה של GOS בזהירות.

חילופי חומרים מזינים, גזים וחומרי פסולת במהלך הריון eutherian מתווך על ידי השליה. במערכת הרבייה הנשית, עורקי הרחם הם הצינורות העיקריים של דם אל הרחם. לאחר השתלה, סניף אלה לתוך כלי מיוחד הנקרא עורקי ספירלה שסליל דרך basalis decidua ליחידת fetoplacental. קוטר ואלסטיות של עורקי ספירלה אלה, אשר מוקפים בלויקוציטים, בתאים מסוימים רוצח טבעי רחם (אונק), להכתיב נפח ומהירות של דם זמין ל1,2 השליה. שינויים המודינמית נכונים כתוצאה משיפוץ של עורקי הספירלה הם קריטיים להצלחת הריון. בעוד המנגנונים שונים בפירוט בין אדם והריון עכברי, התוצאה הסופית של תהליך שיפוץ בשני המינים הוא כלי דם מורחבים, גבוה מוליכות שמאבדים את שכבת שריר החלק שלה. בעכברים, אונק תא הנגזר אינטרפרון (IFγ N-) הוא הכרחי כדי לגרום לשינויים אלה בסביבות אמצע ההריון-3-5. עכברים שחסרים או תאים או רכיבים של מסלול איתות IFN-γ NK לא מצליחים לעבור שינויים אלה וזה קשור ל6,7 גדילת העובר מופחת, והדגיש את החשיבות של אספקת דם הולמת ליחידת fetoplacental. במהלך ההריון אנושי מוקדם, פלישת ביניים וendovascular של trophoblast extravillous והאינטראקציה שלהם עם תאים אונק חשובות לגרימת שינויים בכלי הדם וקידום 8-10 גדילת העובר. תאים אונק יכולים לתזמר פלישת trophoblast אדם באמצעות כמוקינים 11 וציטוקינים כגון מקרופאג granulocyte - גורם המושבה גירוי (GM-CSF) 12. פלישת trophoblast רדודה קשורה לסיבוכי שיפוץ עורקים והריון מופחתים כגון רעלת הריון 9. פרוטוקול זה מבוסס על עבודתו החלוצית של אנה Croy שתאר חשובתפקידה של מערכת החיסון וIFN-γ במיוחד נגזר NK לשיפוץ מוצלח של כלי דם באמצעות ניסויי אימונוהיסטוכימיה והעברה אלגנטית 5,13. כאן אנו מתארים את דרך מהירה וחסכונית כדי להעריך את מצב שיפוץ של עורקי ספירלה. למרות שהמעבדה שלנו מעריכה באופן שגרתי הזה באמצע ההריון (יום הריון (ה &#39;) 9.5) 14, תהליך שיפוץ מתקיים בין gd8.5 ו12.5 15. כניסתו של סורקי שקופיות אוטומטיים יש להקל באופן משמעותי את ההערכה של אזורי כלי ולומן מסעיפים ומצאנו את זה כדי להיות גישה לשחזור יותר מאשר מדידת קטרי כלי. התוספת של זיהוי immunohistochemical של SMA מאפשרת לאימות ישירה של התוצאות שהתקבלו מהערכת stereological. כמו בכל טכניקות stereological, מומלץ לבצע ההערכה כניסוי מסונוור לפחות שני בוחנים. לשם כך, ניתן הציג צעד אקראי כאשר סדרתי לחתוךטינג הדגימות כך שהחוקרים להעריך את השקופיות לא יודעים שמקבוצת ניסוי הדגימות לבוא. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק כלי אמין כדי להעריך בזהירות את שיפוץ של עורקים סליליים בעכברים עם גנוטיפים אימהיים ואבהיים מוגדרים, בהקשר של מודלים עכבר לסיבוכים הקשורים להריון. התוצאות מדגישות את התלות בתאים אונק של תהליך זה, שהוא חיוני לצמיחה תקינה של העובר.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 עכברים (בני 8-12 שבועות)</td><td>חוט</td> דנטלי צ'ארלס ריבר <td></td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן</td><td></td><td></td><td>משמש להחזקת רקמות במקום</td></tr><tr><td>מספריים לדיסקציה ישרה</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr> 25 <tr><td></td> גרם מחטים BD&nbsp;<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>300600</td><td>משמש להחזקת רקמות במקום</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלין, חוצץ ניטרלי, 10%</td> <td>סיגמא</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח</td><td>סיגמא</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>32221-2.5 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>סיגמא</td><td>327204-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>מעבד רקמות אוטומטי</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>מתלה שקופיות</td><td>צנצנת קופלין Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr> תמיסת המטוקסילין <tr><td>מים</td><td></td><td></td><td></td>מטוהרים</tr><tr><td>, זימים מס' 3</td><td>סיגמא</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y פתרון</td><td>סיגמא</td><td>HT110116-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>קולט אדים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיה הרכבה מבוססת קסילן</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>סורק שקופיות</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת סורק שקופיות</td><td>Hamamatsu</td><td>NDP viewer</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט tribasic דיהידראט</td><td>סיגמא</td><td>32320</td><td>הכינו תמיסה של 10 מ"מ והתאימו את ה-pH ל-6</td></tr><tr><td>סיר</td><td></td><td></td> לחץ <td>המשמש לאחזור אנטיגן</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> חימום <td>המשמשת לאחזור אנטיגן</td></tr><tr><td>עט מחסום הידרופובי</td><td>וקטור</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Tris חוצץ</td><td>מלח סיגמא</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ערכת עכבר על עכבר</td><td>וקטור</td><td>BMK-2202</td><td>מפחית משמעותית את הרקע</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי שריר חלק</td><td>אקטין DAKO</td><td>M0851</td><td>מגיב צולב עם</td></tr><tr><td>עכבר בקרת איזוטיפ IgG2a</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>תא לח</td><td>סיגמא</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 3,3'-דיאמינובנזידין</td><td>סיגמא</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

השליה מתווכת את חילופי הגורמים כמו גזים וחומרים מזינים בין האם לעובר ויש לה דרישות ספציפיות לאספקת דם ממחזור הדם האימהי. כלי הדם של הרחם האימהי צריכים להסתגל לדרישה זמנית זו ולהצלחת תהליך שיפוץ העורקים הזה יש השלכות על גדילת העובר. תאים של מערכת החיסון האימהית, במיוחד תאי הרג טבעיים (NK), ממלאים תפקיד קריטי בתהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה להערכת מידת העיצוב מחדש של עורקי הספירלה האימהיים במהלך הריון עכבר. קטעי רקמה מוכתמים בהמטוקסילין ואאוזין נסרקים וגודל הכלים מנותחים. כשיטת אימות משלימה, אנו מציגים גם הערכה איכותית להצלחת תהליך העיצוב מחדש על ידי זיהוי אימונוהיסטוכימי של אקטין שריר חלק (SMA), שבדרך כלל נעלם מתוך כלי הדם העורקיים באמצע ההריון. יחד, שיטות אלו מאפשרות לקבוע פרמטר חשוב של פנוטיפ ההריון. ניתן לשלב תוצאות אלה עם נקודות קצה אחרות של הריון עכברים כדי לספק תובנה לגבי המנגנונים העומדים בבסיס סיבוכים הקשורים להריון.

Rag2 - / - IL2rg - / - עכברים חסרים כל ימפוציטים הבוגרים, כוללים תאי NK 17, ועורקי הרחם שלהם לא מצליחים לעבור את השינויים בכלי הדם ראו בעכברי C57BL / 6 wildtype congenic (WT) סביב אמצע הריון-5,14. כתוצאה מזה Rag2 המופחת שיפוץ - / - IL2rg - / - עכברים מראים אזורים קטנים יותר באופן משמעותי luminal פני השטח, מעידים על כלי הכוללים קטנים יותר שניתן דמיינו על חלקים מוכתמים-E H &amp; ולכמת stereologically (איור 2). יתר על כן, עובי הדופן יחסית (כלי ליחס לומן) הוא גבוה יותר בעורקי הספירלה בעכברים אלה, המצביע על אספקה ​​מופחתת של דם ומהירות גבוהה יותר בדם. הערכה כמותית זו אושרה באמצעות זיהוי immunohistochemical של SMA. זה אופייני לעכברי WT לאבד את רוב SMA בתקשורת וכלי הדםשל עורקי הספירלה באמצע ההריון. אם תהליך מונחה תא NK זה אינו מתקיים, SMA נשאר בתקשורת של כלי השיט וניתן להבחין בקלות immunohistochemically טבעות סביב כלי הדם (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> איור 1: רחם העכבר בgd9.5, סקירה סכמטית ציור המראה את מיקומם היחסי של קרנות רחם, צוואר רחם (הכחול) ועורקים ראשיים רחם (אדום).. הצביע הם הציר של קרן הרחם (חיצים) ונקודות קשירה (חיצים מקווקווים) הארוך. החלקים לאימונוהיסטוכימיה נחתכים לאורך מישור הנוף. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> איור 2:. הערכת Stereological של שיפוץ עורקים באמצע ההריון () דוגמא assessment הלומינל ואזורי כלי מוחלט על סעיפי H &amp; E מוכתמות מנקבות WT ב2/4 המרכזי של basalis decidua (מוגדרת על ידי שחור האנכית קווים מקווקווים) בgd9.5. בכלי בהגדלה גבוהה יותר, האדום קו מקווקו תוחם אזור כלי כולל, קו מקווקו צהוב תוחם אזור לומן. בר = 500 מיקרומטר (משמאל), 50 מיקרומטר (מימין). הציר של הרחם הארוך הוא קו אופקי בכיוון זה. כימות (ב) לאזורי luminal (פנל משמאל) ויחס של שטח luminal לאזור ספינה כולל (פנל מימין) מWT (C57BL / 6) וRag2 - / - Il2rg - / - עכברים (על C57BL / 6 רקע). כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של 15 מדידות (5 מדידות לכל סעיף, 3 חלקים לאתר השתלה). ברים מייצגים ממוצעים של n = 11-13 אתרי השתלה מ4 הריונות לכל קבוצה; p-ערך ממבחן מאן-וויטני שני זנב, מזווג. WT: wildtype. <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 53,534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; איור 3:. גילוי immunohistochemical של אקטין שריר חלק בbasalis decidua מכתים הנציג SMA על WT (למעלה) וRag2 - / - IL2rg - / - עכברים (על רקע C57BL / 6, תחתונה) בgd9.5. בר = 100 מיקרומטר. WT: wildtype.

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להערכת שינויים בכלי הדם האימהיים במהלך ההריון בעכברים. באמצעות שיטות סטריאולוגיות, שיפוץ העורקים הספירליים העשרוניים מוערך כמותית והתוצאות מאושרות איכותית באמצעות אימונוהיסטוכימיה.

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את השינויים הווסקולריים האימהיים הדרושים לצמיחה תקינה של העובר והשיליה במהלך ההריון בעכבר. לפיכך, שיטה זו שימושית לאפיון מדויק של ההסתגלות הווסקולרית האימהית המתרחשת במהלך ההריון, ולהסתגלות זו עשויות להיות השלכות משמעותיות על צמיחת העובר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת קריאה סטריאולוגית חסונה וניתנת לשחזור, אשר ניתן לתקף על ידי הדמיה של שאריות actin של שריר חלק וסקולרי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן אוריינטציית ההכנה הנכונה של רקמת הרחם, המשתנה באופן משמעותי במהלך ההריון, היא המפתח להצלחת הפרוצדורה. ביום הריון 9.5, השחיל בזהירות חוט דנטלי תחת קרן רחמית אחת של עכבר C 57 black six בהריון (time mated) קרוב לשחלה, וקשור את החוט בעדינות אך בחוזקה כדי לבצע ליגציה לעורק הרחמי. חזור על הליגציה תחת הקרן השנייה ומסביב לצוואר הרחם כדי למנוע את קריסת העורקים.לאחר מכן, כרת במהירות את הרחם כולו, דיסטלית לשלוש נקודות הקישור בקצות הקרניים ובצוואר הרחם. מקם את הרחם על פיסת פוליסטירן, כאשר שתי קרני הרחם מיושרות לאורך אותו ציר אורך, בכיוונים מנוגדים מצוואר הרחם. לאחר מכן, מתח בעדינות את הרקמה באמצעות שתי עד 3 מחטים בכיול 25 gauge כדי להקבעה במקומה.טבלו את הפוליסטירן בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters וקבעו את רקמת הרחם עם עד 50 milliliters של 10% formalin בטמפרטורת החדר. רקמת הרחם עדינה מאוד ויש לטפל בה בזהירות לפני הקיבוע כדי למנוע נזק או קרעים. לאחר חמש עד שש שעות, החליפו את ה-formalin ב-50 milliliters של PBS לשטיפה של חמש דקות.לאחר מכן, בצעו דיסקציה של קרני הרחם בקרבת נקודות הקישור בשני הקצוות ובקרבת נקודת הקישור של צוואר הרחם במרכז. הסִירו עודפי שומן מאתרי ההשתלה. לאחר מכן, שטפו את הרחם פעמיים נוספות ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם כדי להסיר שאריות אחרונות של פורמלין, ואשמרו את הרקמה ב-70% ethanol בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס באמצעות מערכת עיבוד אוטומטית, כאשר הפרמטרים מוגדרים כפי שצוין בטבלה.טמנו את הקרניים באופן פרטני בפרפין כך שניתן יהיה לחתוך אותן לאורך מישור בניצב לציר האורכי של הרחם. חיוני לטמן את כל הדגימות באותה אוריינטציה, שכן הדבר יבטיח פרופיל חתך רוחבי זהה בכל אתרי ההשתרשות בעת החיתוך. לאחר השגת חתכים סדרתיים בעובי שבעה מיקרון באמצעות מיקרוטום, צבעו חתך אחד בכל 49 מיקרון ב-hematin and eoin, ואחסנו את החתכים בטמפרטורת החדר לצורך ניתוחים המשכיים.כדי להעריך את גודל כלי הדם ואת מצב השכתוב של הרקמה בכל אתר השתלה, יש לבחור שלושה חתכים במרווחים של 49 micron הקרובים לנקודה הסגיטלית המרכזית. לאחר סריקת השקופיות שנבחרו, הגבילו את הניתוחים לשני הרבעים המרכזיים של כל אתר השתלה כדי למנוע הכללה של ורידים. כדי להעריך את גודל הלומן, בחרו אזור עניין (region of interest) מסביב לחלקה הפנימי של כלי הדם ורשמו את שטח האזור כדי לקבל את הגודל הכולל של כלי הדם.סמנו אזור עניין (ROI) סביב הדופן החיצונית של כלי הדם, כולל התאים האנדותליאליים, הטפילים והלוקוציטים האינטרא-מורליים. לבסוף, תוך הקפדה על הימנעות ממדידה חוזרת של אותו עורק, רשמו מדידות בשלוש חזרות מחמשת כלי הדם בכל אתר השתלה בעלי הלומן הגדול והעגול ביותר, כתוצאה מהרימודלינג המופחת המוצג בעכברי Immunodeficient Rag two IL two receptor gamma chain knockout. בעלי חיים אלה מראים גם שטחי פנים לומנליים קטנים משמעותית, המעידים על כלי דם קטנים יותר באופן כללי, שניתן להדמיאם באמצעות צביעת h and e כפי שמוצג כאן עבור עכברי wild type וכפי שסוכמו באופן סטראולוגי.יתר על כן, היחס היחסי בין דופן הכלי למאוב (lumen) גבוה יותר בעורקי הספירלה של עכברים אלו, מה שמרמז על אספקת דם מופחתת ומהירות דם גבוהה יותר בעכברים עם חסר חיסוני. ההערכה הכמותית של ניסוי מייצג זה אוששה באמצעות זיהוי אימונוהיסטוכימי של smooth muscle actin, שרובו אובד מהמדיה הווסקולרית של עורקי ספירלה מסוג wild type עד אמצע ההיריון. עם זאת, אם תהליך זה, המונע על ידי תאי NK, אינו מתרחש, ה-smooth muscle actin נשאר במדיה של כלי הדם, וניתן לזהות זאת כטבעות של צביעה חומה סביב כלי הדם. לאחר שהחתכים הושלמו במלואם, ניתן להשלים באופן סביר את המדידות והתיקוף באמצעות אימונוהיסטוכימיה בתוך מספר ימים, וזאת כדי להפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים.ניתן לשלב פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות, כגון ציטומטריה של זרימה, כדי לחקור אוכלוסיות של לוקוציטים אימהיים או תפקוד חיסוני. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן הערכת ההסתגלויות הווסקולריות האימהיות המתרחשות במהלך רוב תקופת ההיריון.

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנחנו מדגימים את מודל רומן עורקי קשירה בשריר spinotrapezius עכברי, לרבות הליך צעד אחר צעד ותיאור של מכשור הנדרש. אנו מתארים את הניתוח ומדידות תוצאה רלוונטיות הנוגעות לשיפוץ כלי דם והרחבת כלי דם ברשת פונקציונלית באמצעות מיקרוסקופ intravital וconfocal.

דגם Spinotrapezius Murine כדי להעריך את ההשפעה של קשירת arteriolar על תפקוד כלי דם וRemodeling

כתב יד זה מתאר את התועלת של שבוצעה על חולדות נקבות לעצב ניסיוניות לחקירה הרבייה, הגינקולוגית. הסבר צעד אחר צעד כיצד לבצע הערכה ultrasonographic מוצג.

בדיקת אולטרה סאונד בחקירות הרבייה ניסויים על חולדות

עכברים נמצאים בשימוש נרחב ללמוד ביולוגיה הריונית. עם זאת, סיום ההריון נדרשת עבור מחקרים כאלה אשר מונע חקירות האורך, מחייבת השימוש במספר גדול של בעלי חיים. לכן, אנו מתארים שיטה לא פולשנית של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה לגילוי מוקדם ומעקב אחר האירועים שלאחר ההשתלה העכבר בהריון.

שימוש הרומן של בדיקת אולטרה סאונד בתדירות גבוהה תלת מימדי אפיון בתחילת ההריון העכבר

זילוח תוך רחמי קלה הופק על ידי היצרות עורק עם מפוליויניל מתכת העוטפת את העורקים הרחם ואת השחלות אצל חולדות עובריים ביום 17. הליך זה מיוצר זילוח טרום לידתי, פיגור גדילה תוך רחמי.

מודל עכברוש של זילוח תוך רחמי קלה עם היצרות Microcoil

אולטראסאונד בתדירות גבוהה הדמיה של העכבר עוברית השתפרה דימות ברזולוציה, יכול לספק אפיון פולשני מדויק של התפתחות הלב, פגמים מבניים. פרוטוקול המתוארים במסמך זה מיועדת לביצוע בזמן אמת עוברי עכברים אקוקרדיוגרפיה ויוו.

הדמיה באמצעות מערכת סאונד בתדירות גבוהה (30 / 45MHZ) וכלי דם עוברי העכבר

אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יכול לעזור לייעל ניסויים הדורשים עכברים מתוזמן בהריון על ידי קביעת מצב ההריון, גיל ההיריון, ואובדן הריון. מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי להמחיש שיטות להערכת הריונות העכבר, כמו גם מלכודות פוטנציאליות (חפצי תמונה) שעשויים לחקות הריון.

העכבר שלי בהריון? הערכת אולטראסאונד בתדר גבוה

מאמר זה מתאר בדיקת כתמי לציטין מבוססת וניתן לשחזור עבור כל ההכנות לרשתית ההר ואת הפרוטוקולים הנדרשים למדידה כמותית של פרמטרים וסקולריים משתנים לעתים קרובות ברטינופתיות שגשוג ולא מתרבות.

כימות של פרמטרי כלי דם ברשתיות הר שלמות של עכברים עם רטינופתיות שאינן מתרבות ושגשוגות

ביסוס הריון הוא תהליך דינמי הכולל הצלבה מורכבת של עוברים ורחם. התרומות המדויקות של סביבת הרחם האימהית לתהליכים אלה נותרו תחום מחקר פעיל. כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לסייע בעיצוב מודלים של בעלי חיים in vivo כדי לענות על שאלות מחקר אלה.

שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית

פרוטוקול זה מתאר הליך לגרימת פגיעה ברחם במודל עכבר, ואחריו ניתוחים במורד הזרם במהלך הריון עוקב.

מודל עכבר של פגיעה כירורגית ברחם ותוצאות הריון לאחר מכן

שינויים בזרימת הדם בשחלות בתקופה שלפני הביוץ חיוניים לביוץ. אולטרסאונד דופלר שימש בבני אדם ובבעלי חיים גדולים כדי להעריך המודינמיקה של השחלות וזלוף. מוצג פרוטוקול ליישום אולטרסאונד דופלר להערכת המודינמיקה של השחלות במהלך השלבים הקדם-ביוציים והפרי-ביוץ בעכברים.

אולטרסאונד דופלר להדמיה חיה וכימות של תפקוד כלי הדם בשחלות בעכברים

חקור שינויים בכלי דם אימהיים במהלך הריון בעכברים באמצעות שיטות סטריאולוגיות ואימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של עורקי ספירלת הרחם והשלכותיהם על צמיחת העובר.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

גלה סרטונים נוספים