דוגמנות השלבים המוקדמים של סרטן השחלות הפצה בתרבות Organotypic של אדם חלל הבטן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק, המורכב מתאי מזותל אנושיים ראשוניים ופיברובלסטים בשכבות עם מטריצה חוץ-תאית, ככלי לחקירת הדבקה, פלישה והתפשטות של תאי סרטן השחלות.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור מודל אורגנוטיפי המחקה את המיקרו-סביבה הצפק כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של סרטן השחלות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סרטן השחלות, כגון כיצד אינטראקציות בין תאים סרטניים למיקרו-סביבה תורמות לפתוגנזה של מחלה, וכיצד ניתן לבדוק מעכבים פוטנציאליים של אינטראקציות אלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאים אנושיים ראשוניים בפועל היוצרים את משטחי קו המזותל של חלל הפרל משמשים בתרבית המשותפת של תאי סרטן השחלות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סרטן השחלות, ניתן ליישם אותה גם לחקר סוגי סרטן אחרים המתפשטים בכל חלל הצפק, כגון סרטן הקיבה, הלבלב והמעי הגס. עם רכישת דגימת אומנטום אנושית כירורגית, טבלו מיד את הדגימה ב-PBS בטמפרטורת החדר. תוך שעתיים מהטבילה, העבירו את האומנטום לצינור חרוטי של 50 מיליליטר המכיל 20 מיליליטר PBS טרי, העבירו את שטיפת ה-PBS הנותרת המכילה את תאי המזותל האנושיים העיקריים או HPMC ותאי דם אדומים לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר וסובבו את התאים.

לאחר מכן שפכו את תכולת הצינור לתבנית תרבית סטרילית בגודל 10 סנטימטר והשתמשו בשני אזמלים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות של חמישה מילימטר מעוקב. כדי לבודד את תאי המזותל האנושיים העיקריים או HPMC, העבירו את חתיכות האומנטום לצינור חרוטי של 50 מיליליטר והמתינו דקה אחת. כדי שהחתיכות המוצקות יצופו למעלה, ה-HPMC יתיישב בתחתית הצינור עם כדוריות הדם האדומות.

השתמש בפיפטה כדי להעביר את שטיפת ה-PBS המכילה תאי מזותל ותאי דם אדומים לתוך הצינור המכיל את התאים הגלולים וסובב את התאים. לאחר מכן הוסף 20 מיליליטר של PBS טרי לאומנטום ואסוף את ה-PBS המכיל HPMC ו-RB C3 פעמים נוספות רק מודגם לתאי הכדורים המקוריים. לאחר צלחת הסיבוב הסופית, התאים בבקבוק של 75 סנטימטר מרובע ב -15 מיליליטר של מדיום גידול מלא.

כדי לבודד HPMC נוסף מדגימת האומנטום, יש לנער את הרקמה המוצקה שנותרה ב-20 מיליליטר PBS ב-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, הניחו לדגימה לנוח דקה אחת כדי לאפשר לרקמה המוצקה לעלות לראש הצינור. לאחר מכן אסוף את ה-HPMC וה-RBC מתחתית הצינור כפי שהודגם זה עתה.

כעת, סובבו את התאים מהשטיפה המשנית הזו וצלחו אותם בבקבוק נפרד של 75 סנטימטרים רבועים ב-15 מיליליטר של מצע גידול מלא. כדי לבודד את כל ה-HPMC שנותר, יש לנער את הרקמה למשך 10 דקות נוספות הפעם בתערובת של PBS ו-10 מיליליטר של טריפסין EDTA ולצלוח את ה-HPMC וה-RBC הללו בבקבוק של 75 סנטימטר רבוע ואז לדגור על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בסביבה לחה, להזין את התאים המצופים ב-15 מיליליטר טרי, מדיום גידול מלא בימים השלישי והחמישי מבלי להסיר את המדיום המושקע. ניתן לזהות את ה-HPMC על ידי צורתם הקובייתית והביטוי שלהם של ציטוקרטין שמונה ומנטון.

כדי לבודד את הפיברובלסטים הרגילים של האומנטום, יש לטפל ברקמת האומנטום הטחונה שנותרה עם 10 מיליליטר של תמיסה טרייה שהוכנה 10 x קולגנאז מסוג שלוש מדוללת במדיום נטול סרום למשך שש שעות עם טלטול בסוף תקופת הדגירה, הרקמה המעוכלת תהפוך אטומה עם התמיסה המכילה מעט פסולת סיבית, צנטריפוגה את תרחיף הפיברובלסטים הרגיל של אומנטום, ואז תרבות. התאים ב -13 מיליליטר של מדיום גידול מלא. לאחר 24 שעות, החלף את המדיום הישן ב -15 מיליליטר של מדיום גידול מלא טרי.

ניתן לזהות את הפיברובלסטים הרגילים של אומנטום על ידי צורתם המוארכת השטוחה, ביטוי הווימנטין שלהם והיעדר ביטוי ציטוקרטין. כדי לשחרר את הפיברובלסטים הרגילים של אומנטום מהתרבית, יש לשטוף את בקבוק התרבות עם 10 מיליליטר PBS, ואחריו שלושה מיליליטר טריפסין למשך לא יותר מחמש דקות. כאשר התאים מתנתקים, יש לנטרל את הטריפסין בנפח של לפחות פי שלושה ממצע הגידול המלא, ולהעביר את התאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.

סובב את התאים והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מצע גידול מלא. לאחר מכן ספרו את התאים ודללו אותם לשניים עד ארבעה פעמים 10 לפיברובלסטים השלישיים לכל 100 מיקרוליטר של צמיחה מלאה, ריכוז בינוני. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיקרוגרם לכל 100 מיקרוליטר קולגן זנב חולדה, אחד לתאים וצלחו 100 מיקרוליטר תאים לבאר לצלחת תחתונה שחורה שקופה של 96 בארות.

לאחר מכן העבירו את הצלחת לאינקובטור תרבית תאים למשך ארבע שעות לפחות או עד שהתאים נדבקים למשטח הצלחת, בזמן שהפיברובלסטים הרגילים של המומנטום מתייצבים. נתק את ה-HPMC מצלוחיות התרבות שלהם ודלל את התאים הללו לאחת עד פעמיים 10 ל-HPMC הרביעי לכל 50 מיקרוליטר של מצע גידול מלא. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של HPMC לבאר לפיברובלסטים הרגילים של האומנטום המצורפים, והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים למשך 18 שעות לפחות לפני הניסוי.

השתמש בזרע למחרת, התרביות התלת-ממדיות ORGANOTYPIC עם GFP המבטא תאי סרטן שחלות מתרבית קונפלואנט של 80 עד 90% בדילול המתאים לבדיקה הרצויה במורד הזרם, פפטיד RGD ונוגדנים חוסמים כנגד אלפא חמש, בטא אחת ואלפא חמש. בטא שלוש. אינטגרינים מעכבים את ההידבקות של תאי סרטן השחלות לתרבית האורגנוטיפית בעוד שפפטיד RAD ונוגדני בקרה ובטא ארבע אינטגרין אינם מעכבים.

פפטיד RRG D ונוגדנים חוסמים כנגד אלפא חמש ובטא אחד אינטגרין מעכבים גם את התפשטות תאי סרטן השחלות בתרבית האורגנוטיפית, בעוד שפפטיד RAD ונוגדני אינטגרין בקרה אלפא חמש, בטא שלוש ובטא ארבע לא. יתר על כן, פפטיד RGD ונוגדנים חוסמים כנגד אלפא חמש ובטא אחד אינטגרין מעכבים פלישת תרבית אורגנוטיפית תלת מימדית של תאי סרטן השחלות. בעוד שנוגדני אלפא חמש בטא שלוש אינטגרין משפרים את התהליך הזה כצפוי מנתוני בדיקת ההיצמדות וההתפשטות, גם הפפטיד והבקרה של RAD ונוגדני בטא ארבע אינטגרין לא הראו השפעה על פלישת תאי סרטן.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שבע עד 12 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש תמיד בארון בטיחות ביולוגי ובציוד המגן המתאים, כולל חלוק מעבדה וכפפות לאחר הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות הידבקות, פלישה והתפשטות כדי לענות על שאלות נוספות לגבי אינטראקציות של תאים סרטניים עם המיקרו-סביבה לאחר התפתחותה.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום סרטן השחלות לחקור כיצד המיקרו-סביבה משפיעה על אינטראקציות של תאי סרטן עם תאי חלל הצפק האנושיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאים ראשוניים מהמומנטום האנושי וכיצד לבנות תרבית אורגנוטיפית של רירית הפרל.