פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ"ג

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעקוב אחר תהליכים אנזימטיים בזמן אמת על ידי קיטוב גרעיני דינמי, תהודה מגנטית גרעינית מוגברת. תהודה מגנטית במצב נוזלי המוגברת על ידי הקיטוב הגרעיני הדינמי, DNP, יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח: כיצד לקבוע, למשל, את שיעורי הטרנספורמציה האנזימטית של זוג מולקולות בתא או in vivo מבלי לשנות את זוג המולקולות הזה בשום צורה. התקנת ציוד DNP הפירוק שלנו במעבדה שלנו והגעתו לכאן של ד"ר ריקרדו בלצן, דוקטורט במעבדת Arnaud Comment בלוזאן, היא צעד גדול קדימה למחקר שלנו.

DNP מגביר משמעותית את הרגישות של ניסויים שאנו יכולים לבצע בספקטרומטר NMR של 500 מגה-הרץ. ציוד DNP זה היה הראשון שהותקן בצרפת ואני רוצה להזכיר שבהפיכת הציוד הזה לפונקציונלי, כל חברי צוות התמ"ג שלנו היו מעורבים ואני רוצה להזכיר במיוחד את גילדס ברטו, מהנדס המחקר שלנו, ואת פאטיחה קאטב, מנהלת הכנסים שלנו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת כימות ישיר בזמן אמת של המצע ונגזרותיו האנדוגניות ברזולוציית זמן של שניות.

עבור תמיסת הקיטוב, הכינו שני מיליליטר של תמיסת נתרן פירובט 1.12 טוחנת, פחמן 13 מסוממת ב-33 מילי-מולרית של רדיקל TEMPO בנפח של שניים לאחד של מים מפוזרים לאתנול דוטראט לתצפיות פחמן 13. הורד את טמפרטורת הקיטוב הגרעיני הדינמי, או DNP, באמצעות הליך הקירור על ידי לחיצה על כפתור הקירור בממשק תוכנת הקריוסטט. אסוף הליום נוזלי בקריוסטט DNP באמצעות הליך המילוי.

לחץ על כפתור המילוי בממשק התוכנה של קריוסטט. לאחר מכן הנח 300 מיקרוליטר של תמיסת הקיטוב האופטימלית במיכל הדגימה המצורף למקטב DNP. הקפיאו את מיכל הדגימה עם הדגימה בתוכו על ידי טבילתו בעדינות באמבט חנקן נוזלי.

הסר את החנקן הנוזלי שעלול להיות במיכל הדגימה לאחר הליך ההקפאה על ידי חילוץ מיכל הדגימה מאמבט החנקן הנוזלי וסיבובו הפוך. לאחר מכן, הכנס את הדגימה לתוך הקריוסטט על ידי הכנסת מיכל הדגימה למחזיק הדגימה. לאחר מכן הנח את מחזיק הדגימה בתוספת הקריוסטט הראשית לפני הכנסת מוביל הגל של המיקרוגל למחזיק הדגימה.

הורד את טמפרטורת הקריוסטט על ידי התחלת הליך קירור קלווין אחד. לחץ על כפתור הקירור של קלווין בממשק התוכנה של קריוסטט. הפעל את מקור המיקרוגל והקרין את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה של מיקרוגל בממשק תוכנת הקריוסטט.

נתק את הכבל הקואקסיאלי של תעלת זיהוי קונסולת ה-NMR מסליל הספקטרומטר על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכתו. חבר את הכבל הקואקסיאלי של תעלת הזיהוי למחבר הקואקסיאלי של סליל ה-NMR הקריוסטט. לאחר מכן הכנס את המחבר הזכרי של כבל קונסולת ה-NMR למחבר הנקבה של סליל ה-NMR של הקריוסטט, תוך שימת לב לפין הכיוון.

לחץ בחוזקה וסובב את המחבר בכיוון השעון ב-90 מעלות. מדוד את האות התרמי של NMR במצב מוצק באתר הקריוסטט באמצעות רצף פשוט של רכישת פולסים עם פולסים לא מכוילים בזווית היפוך נמוכה החוזרים על עצמם במרווח של t שווה לחמש דקות. לאחר הגדרת המדידה, כתוב zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על Enter במקלדת.

לאחר התחלת הליך הקיטוב, מדוד את אות ה-DNP המשופר NMR במצב מוצק באותו הליך ותנאים המשמשים למדידת האות התרמי. נתק את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ זיהוי קונסולת ה-NMR מסליל ה-NMR של הקריוסטט על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכתו. לאחר מכן חבר את הכבל הקואקסיאלי של תעלת הזיהוי למחבר הקואקסיאלי של סליל הספקטרומטר.

הכנס את המחבר הזכרי של כבל קונסולת ה-NMR למחבר הנקבה של סליל הספקטרומטר, תוך שימת לב לפין הכיוון. לחץ בחוזקה וסובב את המחבר בכיוון השעון ב-90 מעלות. הכינו טרי תמיסת LDH של שריר ארנב ביחידה אחת למיליליטר במאגר תגובה עם 20 מיקרוגרם למיליליטר אלבומין בסרום בקר.

לאחר מכן מערבבים 478 מיקרוליטר של מאגר תגובה, 2 מיקרוליטר של תמיסת LDH ו-20 מיקרוליטר של מים מפוזרים כדי לאפשר ייצוב שדה ספקטרומטר, או נעילה. לאחר מכן הנח את נפח התמיסה של 500 מיקרוליטר לתוך צינור NMR של 5 מילימטר. חבר את צינור ההעברה למכשיר הזרקה אוטומטי בהתאמה אישית המפריד בין התמיסה ההיפר-פולרית לגז ההליום המשמש להעברה.

המכשיר מספק אוטומטית 500 מיקרוליטר של תמיסה היפרפולרית לתוך צינור הדגימה. לפני הפירוק, הנח את צינור ה-NMR של חמישה מילימטר המכיל 500 מיקרוליטר של דגימה באיזוסנטר של ספקטרומטר NMR של 11.74 טסלה. הכנס 5 מיליליטר מים מפוזרים לדוד הכנסת הפירוק.

לחץ וחמם את המים המפוזרים באמצעות חוט ההתנגדות עד להגעה לטמפרטורה של כ-180 עד 200 מעלות צלזיוס על ידי לחיצה על כפתור הכנת החימום בממשק תוכנת הקריוסטט. לחץ על כפתור פעולות SS בממשק התוכנה של קריוסטט. לאחר מכן הסר את מוביל המיקרוגל מתוספת הפירוק.

החלק את תוספת הפירוק כלפי מטה לתוך מחזיק הדגימה. תוספת הפירוק צריכה להגיע לתחתית מחזיק הדגימה ויש לדחוף אותה בחוזקה כדי ליצור חיבור אטום לדליפה עם מיכל הדגימה כדי למנוע דליפת מים מפוזרים לתוך הקריוסטט. לחץ על הדק החומרה כדי להתחיל את רצף הפירוק, רצף מתוזמן מראש של פעולות שסתומים פנאומטיים.

מיד לאחר הפירוק, מכשיר ההזרקה מערבב 500 מיקרוליטר של תמיסה היפר-פולרית עם הדגימה המונחת בספקטרומטר ה-NMR. לאחר הפירוק, מדוד את האות ההיפר-פולרי של ה-NMR מהדגימה בספקטרומטר בסדרה של 10 מעלות, רצפי רכישת דופק בזווית היפוך במרווח של 1.5 שניות כדי לעקוב אחר התקדמות המגנטיזציה של המצע והמוצר. לאחר הגדרת המדידה, כתוב zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על Enter.

לאחר שהמגנטיזציה רגועה לחלוטין, מדוד את האות התרמי של NMR על ידי סדרה של רצפי רכישת דופק בזווית היפוך של 90 מעלות במרווח של כשלוש דקות, המקבילים לכ-3T1. לאחר הגדרת המדידה, כתוב zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על מקש Enter. כאן מהלך הזמן של הספקטרום המתקבל מפולסים חוזרים ונשנים של זווית היפוך של 10 מעלות מראה את הרגישות ורזולוציית הזמן של הטכניקה.

לאחר זיהוי שיא של מצע הפירובט ותוצר הלקטט, הכימות מתבצע באמצעות שילוב אותות של המטבוליטים. הפעילות האנזימטית נקבעת ממסלול הזמן של אות המוצר על ידי התאמה למודל ליניארי. כדי לאמת את המדידה, אותה כמות מוערכת על ידי קצב התגובה הראשוני, מהיחס בין האותות של המוצר והמצע.

לאחר השליטה, ניתן לבצע מדידה מלאה של פעילות אנזימטית תוך כשעתיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין כיצד לייצר מצע מקוטב מאוד עבור NMR, להזריק אותו לתמיסה המכילה אנזים, ולעקוב אחר פעילות אנזימטית באמצעות תמ"ג משופר DNP. כאשר מנסים הליך זה, חשוב להכין בזהירות את התמיסה האנזימטית עם אנזים טרי ומצעים חדשים, ולהימנע מבועת אוויר בצינור הדגימה.

עם התפתחות התהודה המגנטית המשופרת של DNP במצב נוזלי, חוקרים יכולים כעת לחקור את ספיגת המצע ואת הטרנספורמציה האנזימטית שלו בתוך סוגים שונים של תאים על ידי מדידת קצב היווצרות המוצר. אל תשכח שעבודה עם ציוד קריוגני ושדות מגנטיים גבוהים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת מגנים אישיים מפני קריוגנים ואימות היעדר חפצים מגנטיים בעת ביצוע מדידות אלו.

בניגוד לתמ"ג קלאסי, תמ"ג מבוסס DNP לפירוק מוגבל לחלון זמן ניסיוני של דקות לכל היותר, תלוי במצע ובמצב החיים הנוכחי. זה עומד בדרכו של מעבר לספקטרוסקופיה D אחת. פירוק DNP NMR זקוק לפיתוח כדי להביא אותו לרמת הרבגוניות של NMR רב-ממדי קלאסי.