Name: פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: למד מעקב בזמן אמת של תהליכים אנזימטיים באמצעות שיפור רגישות DNP ב-NMR. טכניקה זו מאפשרת קביעת קצבי תגובות אנזימטיות מבלי לשנות את המולקולות הנחקרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ד&quot;ר ג&#39;יי ג&#39;יי ואן דר קלינק על הסיוע בבחירת והרכבה של ציוד, כמו גם ד&quot;ר פ Kateb וד&quot;ר ג Bertho לדיונים מועילים. AC נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (להעניק PPOOP2_157547). אנו מכירים מימון מפריז הסורבון סיטה (NMR @ Com, Analytics DIM, Ville de Paris, מגט de la משוכלל ונדיר Medicale (FRM ING20130526708), ואת Parteneriat הוברט Curien ברנקוזי 32662QK. הצוות שלנו הוא חלק תוכניות Equipex פריז-אן-תהודה ו CACSICE.

הערה: כל ניתוח הנתונים בוצע באמצעות תוכנה מסחרית. 1. מכין את הפתרון המקטב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 מיליליטר של פירובט נתרן 1.12 M 13 שכותרתו C (Na + [CH 3 -CO- 13 COO] -, מצע) פתרון מסומם עם 33 מ&quot;מ של TEMPOL הרדיקלי (4-הידרוקסי-2,2,6,6- tetramethylpiperidin-1-oxyl, סוכן מקטב) 4 ב 2: 1 D 2 O / D 6 -ethanol עבור 13 תצפיות C. זהירות: הוראות טיפול יש לנקוט בשל אופי הדליק של -ethanol ד 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי ריכוז קיצוני הוא אופטימלי מבחינת הקיטוב מושגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את ריכוז קיצוני מעט של הפתרון בשלב 1.1 (למשל, 30 מ&quot;מ או 35 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע באופן איטרטיבי שיפור מצב מוצק (ראה שלב 3) ולמצוא את הריכוז הקיצוני שמוביל שיפור מקסימלית. </li></ol></li></ol> 2. Polarizatיוֹן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה cryostat DNP בהליך cooldown. לחצו על כפתור ה &quot;הרגעות&quot; על ממשק תוכנה cryostat (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף הליום נוזלי ב cryostat DNP בהליך מילוי. לחצו על כפתור &#39;מילוי&#39; על ממשק התוכנה cryostat (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 300 μl של פתרון מקטב אופטימיזציה משלב 1.1 במיכל מדגם מסופק עם מקטב DNP. להקפיא את מיכל המדגם עם מדגם בתוך ידי טבילה אותו בעדינות באמבט חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסל את החנקן הנוזלי שעשוי להיות נוכח בתוך המכל מדגם לאחר הליך ההקפאה (שלב 2.3) על ידי שאיבת המכל מדגם מאמבטית החנקן הנוזלית והסיבוב אותו ההפוך. הערה: שלב זה הוא חיוני כדי לקבל פירוק יסודי של המדגם (ראה שלב 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המדגם לתוך cryostat. הערה: זה StEP, מורכב המשנה בשלב הבא, חייב להתבצע במהירות (כלומר, תוך פחות מ 10-20 שניות) כדי למנוע את דוגמא ההיתוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מיכל מדגם בעל מדגם. הכנס את בעל המדגם של כנס cryostat הראשי. הכנס את מוליך גל מיקרוגל של בעל המדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את הטמפרטורה cryostat ידי שתתחיל בהליך קירור 1 K. לחצו על כפתור &#39;קירור 1K&#39; על ממשק התוכנה cryostat (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את מקור המיקרוגל ועוד מקרין את המדגם. לחצו על כפתור &#39;MW-ON&#39; על ממשק התוכנה cryostat (איור 2 ד). </li></ol> 3. מדידות מצב מוצק תמ&quot;ג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ זיהוי קונסולת NMR מן סליל ספקטרומטר ידי סיבוב נגד כיוון השעון מחבר ידי 90 ° ומשיכתו. חבר את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ זיהוי למחבר קואקסיאליים של cryostatסליל NMR. כנס מחבר הזכר של כבל מסוף תמ&quot;ג המחבר נקבה של סליל NMR cryostat, בשים לב סיכת האורינטציה; ולחץ בחוזקה וסובב את השעון מחבר ידי 90 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אות תמ&quot;ג תרמית מצב מוצק באתר cryostat באמצעות רצף הדופק לרכוש פשוטה עם פולסים להעיף זווית נמוכה un-מכויל חזר בהפרש של דקות T = 5. לאחר הגדרת מדידה, לכתוב בשורת הפקודה של התוכנה &#39;ZG&#39; ולחץ על מקש המקלדת &#39;Enter&#39;. עיין במדריך תפעול ספקטרומטר תמ&quot;ג לפרטים נוסף על מבצע ספקטרומטר והתקנת מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אות התמ&quot;ג המשופרת DNP. ניתוחים חוזרים של צעד 3.2 לאחר התחלת תהליך DNP כמתואר בסעיף 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את כבל קואקסיאלי ערוץ זיהוי קונסולת NMR מן סליל NMR cryostat ידי סיבוב נגד כיוון השעון מחבר ידי 90 ° ומשיכתו. חבר את הכבל הקואקסיאלי של Deteערוץ ction למחבר קואקסיאליים של סליל ספקטרומטר. כנס מחבר הזכר של כבל מסוף תמ&quot;ג המחבר נקבה של סליל ספקטרומטר, בשים לב סיכת האורינטציה; ולחץ בחוזקה וסובב את השעון מחבר ידי 90 °. </li></ol> 4. מטב את ההומוגניות של שדה המגנט הראשי ( &#39;shimming&#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ספקטרומטר צינור המכיל 500 μl של תערובת מיוצר בניסויים קודמים (כלומר, לאחר שלב 6.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע shimming ספקטרומטר תמ&quot;ג ידי שינוי הזרם הסליל שיפוע shimming מחפש את המקסימום &quot;לנעול&quot; אות של דאוטריום. בחר את סליל shimming הרלוונטי על ידי לחיצה על הכפתור המתאים על קונסולת NMR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הידית על קונסולת התמ&quot;ג כדי לקבוע את הכיוון הסיבוב המגביר את אות המנעול. המשך לסובב עד האות מגיע לשיא. בחר אחר סליל shimming וחזור על האו&quot;ם מקסוםtil מקסימום מקומי לכלל סלילי shimming נמצא. עיין במדריך תפעול ספקטרומטר תמ&quot;ג לפרטים נוספים. בסוף, להסיר את המדגם המשמש נעילה. </li></ol></li></ol> 5. פירוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס 5 מ&quot;ל של D 2 O בדוד הכנס פירוק. לחצים ולחמם את D 2 O באמצעות חוט התנגדות עד להשגת 180-200 מעלות צלזיוס ≈ T. לחץ על כפתור ה &quot;כן המחמם &#39;על ממשק תוכנת cryostat (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הליך הקיטוב מדגם (למשל, לאחר 3 T DNP), לחצים על cryostat מעט מעל הלחץ בחדר. לחצו על כפתור ה &quot;SS תפעול &#39;על ממשק התוכנה cryostat (איור 2 ד). הסר את מדריך מיקרוגל מן הכנס פירוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את כנס הפירוק (איור 3B) למטה לתוך מחזיק המדגם (איור 3 א-ג). את הכנס פירוק יש להגיע לתחתית של בעל המדגם חייב להיות דחף בחוזקה כדי ליצור חיבור leaktight עם מיכל מדגם על מנת למנוע D 2 O דולף ב cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הדק החומרה (איור 3 ג-ח) כדי להתחיל את רצף הפירוק, רצף מתוזמן מראש של פעולות שסתומי פנאומטיים. </li></ol> 6. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני פירוק במקום צינור NMR 5 מ&quot;מ, המכיל 500 מדגם μl (למשל, D 2 O עבור <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> המדידה בתמיסה שלב 7 או LDH משלב 8 למדידות הפעילות האנזימטית בשלב 9), ב isocenter של ספקטרומטר 11.74 T NMR (ראה שלב 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק לאחר פירוק (שלב 5), לערבב 500 μl של פתרון hyperpolarized עם המדגם להציב ספקטרומטר תמ&quot;ג שלב 6.1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה ידנית: לאסוף את hyperpolarizedפתרון בסוף צינור העברה ארוכה 2.5 מ בכוס זכוכית להציב קרוב מגנט ספקטרומטר התמ&quot;ג. באופן ידני להזריק 500 μl של פתרון hyperpolarized בצינור מדגם NMR באמצעות מערכת נימי בהתאמה אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה אוטומטית: לפני תהליך הפירוק, לחבר את העברת הצינור להתקן הזרקה אוטומטית בהתאמה אישית שמפריד פתרון hyperpolarized מגז הליום המשמש להעברה. המכשיר מספק אוטומטית 500 μl של פתרון hyperpolarized לתוך הצינור המדגם. </li></ol></li></ol> 7. מדידת NMR נוזלית-מדינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פירוק, למדוד את אות hyperpolarized NMR מן המדגם ב ספקטרומטר על ידי סדרה של 10 ° רצפים-לרכוש דופק זווית להעיף במרווחים על ידי 1.5 שניות לבצע את ההתקדמות של המגנטיזציה של מצע (א) לבין מוצר (B). לאחר הגדרת מדידה, לכתוב בשורת הפקודה של התוכנה &#39;ZG&#39; ולחץ על &amp; #39; מקש Enter במקלדת. עיין במדריך תפעול ספקטרומטר תמ&quot;ג לפרטים נוסף על מבצע ספקטרומטר והתקנת מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המגנטיזציה הוא רגוע לחלוטין (כלומר, לאחר T = 10 T 1), למדוד את אות תמ&quot;ג תרמית על ידי סדרה של 90 מעלות זווית להעיף הדופק לרכוש רצפים במרווחים על ידי T = 3 T 1 ≈ 3 דקות. לאחר הגדרת מדידה, לכתוב בשורת הפקודה של התוכנה &#39;ZG&#39; ולחץ על מקש המקלדת &#39;Enter&#39;. עיין במדריך תפעול ספקטרומטר תמ&quot;ג לפרטים נוסף על מבצע ספקטרומטר והתקנת מדידה. </li></ol> הכנת 8. דוגמאות אנזימים המכילים (ספציפית עבור טרנספורמציה פירובט אל לקטט) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ תגובה עם המתכון הבא: 50 מ&quot;מ מופחת dinucleotide אדנין nicotinamide (NADH), 1 מ&quot;מ חומצה אתילן-diaminetetraacetic (EDTA), 0.1 מ&quot;מ dithiothreitol (DTT) ב 0.1 M חיץ פוספט, pH =7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון LDH ארנב שריר 1 U / ml מוכן טרי חיץ תגובה עם 20 מיקרוגרם / מיליליטר אלבומין בסרום שור, BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 478 חיץ התגובה μl (שלב 8.1), 20 μl D 2 O כדי לאפשר ייצוב שדה ספקטרומטר ( &quot;נעילה&quot;) ו -2 μl פתרון LDH (שלב 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את נפח פתרון 500 μl מוכן בשלב 8.3 לתוך צינור NMR 5 מ&quot;מ ומקם את הצינור לתוך ספקטרומטר תמ&quot;ג 500 MHz. </li></ol> 9. קצב התגובה האנזימטית להשלים הליך מדידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדגם המקטב (שלב 1) ומקצינות זה (שלב 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע shimming על ספקטרומטר (שלב 4) ולהכין מדגם אנזימטי (שלב 8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפירוק (שלב 5) ואת הזריקה (שלב 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד סדרה של אותות מן המדגם hyperpolarized עם 10 מעלות רכישות פולסים זווית להעיף במרווחים על ידי 1.5 שניות (שלב 7). שלב זה מאפשר מדידת hyperpolarizedריקבון אות ואת הצטברות האות של מטבוליטים. </li></ol> התאמה 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל קשת רכשה בשלב 9.4, לזהות את פסגות המתאימים למצע (א) לבין מוצר (B) בהתאמה ולשלב אותם (לקבוע את האזור של פסגות). אינטגרלים פסגות לתת אותות כמובן המגנטיזציה זמן (M (A, B) (t), ראו משוואה 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בפתרון של המשוואה (2), לקבוע את הערך של F = (R A + K EFF מ) בכושר מעריכים פשוט של אות המצע משולב שלב 10.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת ערך F = (EFF R A + K 10.2 נקבע) בשלב, לקבוע EFF k ו- R B מ בהתקף של B M אות המוצר (t) עם הפונקציה מתקבל על ידי שילוב המשוואה (2). ראה גם סעיף נציג תוצאות (Enzymatic פעילות ומדידות מטבולית) לפרטים על דוגמנות תגובה, ראוי ולא rf התיקון. </li></ol>

<ol><li>Overhauser, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+Nuclei+in+Metals%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev%22%5BJournal%5D)">Polarization of Nuclei in Metals.</a> Phys. Rev. 92 (2), 411-415 (1953).</li>
<li>Abragam, A., Goldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+dynamic+nuclear+polarisation%5BTitle%5D)+AND+%22Rep.+Prog.+Phys%22%5BJournal%5D)">Principles of dynamic nuclear polarisation.</a> Rep. Prog. Phys. 41 (3), 395(1978).</li>
<li>Wolber, J., Ellner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+highly+polarized+nuclear+spins+in+solution+using+dynamic+nuclear+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Inst.+Met.+Phys.+Res.+Sec.+A%22%5BJournal%5D)">Generating highly polarized nuclear spins in solution using dynamic nuclear polarization.</a> Nuc. Inst. Met. Phys. Res. Sec. A. 526 (1-2), 173-181 (2004).</li>
<li>Cheng, T., Capozzi, A., Takado, Y., Balzan, R., Comment, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+35%25+liquid-state+13C+polarization+obtained+via+dissolution+dynamic+nuclear+polarization+at+7+T+and+1+K+using+ubiquitous+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Over 35% liquid-state 13C polarization obtained via dissolution dynamic nuclear polarization at 7 T and 1 K using ubiquitous nitroxyl radicals.</a> PCCP. 15 (48), 20819-20822 (2013).</li>
<li>Ardenkjaer-Larsen, J. H., Fridlund, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+signal-to-noise+ratio+of+%3E+10%2C000+times+in+liquid-state+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR.</a> PNAS. 100 (18), 10158-10163 (2003).</li>
<li>Day, S. E., Kettunen, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+tumor+response+to+treatment+using+hyperpolarized+13C+magnetic+resonance+imaging+and+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detecting tumor response to treatment using hyperpolarized 13C magnetic resonance imaging and spectroscopy.</a> Nat. Med. 13 (11), 1382-1387 (2007).</li>
<li>Keshari, K. R., Wilson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%5B2-13C%5D-Fructose%3A+A+Hemiketal+DNP+Substrate+for+In+Vivo+Metabolic+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized [2-13C]-Fructose: A Hemiketal DNP Substrate for In Vivo Metabolic Imaging.</a> JACS. 131 (48), 17591-17596 (2009).</li>
<li>Zeng, H., Lee, Y., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Rate+Determination+by+Dynamic+Nuclear+Polarization+Enhanced+NMR+of+a+Diels%E2%88%92Alder+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22An.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative Rate Determination by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced NMR of a Diels−Alder Reaction.</a> An. Chem. 82 (21), 8897-8902 (2010).</li>
<li>Harrison, C., Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+kinetic+models+for+analysis+of+pyruvate-to-lactate+exchange+by+hyperpolarized+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Comparison of kinetic models for analysis of pyruvate-to-lactate exchange by hyperpolarized 13C NMR.</a> NMR in Biom. 25 (11), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Allouche-Arnon, H., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+visualization+of+betaine+aldehyde+synthesis+and+oxidation+using+hyperpolarized+magnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro visualization of betaine aldehyde synthesis and oxidation using hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy.</a> Chem. Comm. 49 (63), 7076-7078 (2013).</li>
<li>Lerche, M. H., Meier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dynamic+nuclear+polarization-NMR+on+blood+plasma+for+assays+of+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biom%22%5BJournal%5D)">Quantitative dynamic nuclear polarization-NMR on blood plasma for assays of drug metabolism.</a> NMR in Biom. 24 (1), 96-103 (2011).</li>
<li>Nelson, S. J., Kurhanewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Imaging+of+Patients+with+Prostate+Cancer+Using+Hyperpolarized+%5B1-13C%5DPyruvate%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Trans.+Med%22%5BJournal%5D)">Metabolic Imaging of Patients with Prostate Cancer Using Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate.</a> Sci. Trans. Med. 5 (198), 198ra108(2013).</li>
<li>Kurhanewicz, J., Vigneron, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Cancer+Metabolism+by+Imaging+Hyperpolarized+Nuclei%3A+Prospects+for+Translation+to+Clinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Analysis of Cancer Metabolism by Imaging Hyperpolarized Nuclei: Prospects for Translation to Clinical Research.</a> Neoplasia. 13 (2), 81-97 (2011).</li>
<li>Comment, A., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Magnetic+Resonance+as+a+Sensitive+Detector+of+Metabolic+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Magnetic Resonance as a Sensitive Detector of Metabolic Function.</a> Biochem. 53 (47), 7333-7357 (2014).</li>
<li>Carravetta, M., Johannessen, O. G., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+T-1+limit%3A+Singlet+nuclear+spin+states+in+low+magnetic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PRL%22%5BJournal%5D)">Beyond the T-1 limit: Singlet nuclear spin states in low magnetic fields.</a> PRL. 92 (15), 153003(2004).</li>
<li>Carravetta, M., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+long-lived+nuclear+spin+states+in+solution+nuclear+magnetic+resonance.+I.+Singlet+states+in+low+magnetic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Theory of long-lived nuclear spin states in solution nuclear magnetic resonance. I. Singlet states in low magnetic field.</a> J. Chem. Phys. 122 (21), 214505(2005).</li>
<li>Vasos, P. R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+states+to+sustain+hyperpolarized+magnetization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Long-lived states to sustain hyperpolarized magnetization.</a> PNAS. 106 (44), 18469-18473 (2009).</li>
<li>Claytor, K., Theis, T., Feng, Y., Warren, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+long-lived+13C2+state+lifetimes+at+natural+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22JMR%22%5BJournal%5D)">Measuring long-lived 13C2 state lifetimes at natural abundance.</a> JMR. 239, 81-86 (2014).</li>
<li>Pileio, G., Carravetta, M., Hughes, E., Levitt, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-lived+nuclear+singlet+state+of+N-15-nitrous+oxide+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">The long-lived nuclear singlet state of N-15-nitrous oxide in solution.</a> JACS. 130 (38), 12582-12583 (2008).</li>
<li>Stevanato, G., Hill-Cousins, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nuclear+Singlet+Lifetime+of+More+than+One+Hour+in+Room-Temperature+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Ange.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Nuclear Singlet Lifetime of More than One Hour in Room-Temperature Solution.</a> Ange. Chem. Int. Ed. 54 (12), 3740-3743 (2015).</li>
<li>Ghosh, R. K., Kadlecek, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+the+Persistent+Singlet+State+of+N%282%29O+in+Blood+and+Other+Solvents-Potential+as+a+Magnetic+Tracer%5BTitle%5D)+AND+%22MRM%22%5BJournal%5D)">Measurements of the Persistent Singlet State of N(2)O in Blood and Other Solvents-Potential as a Magnetic Tracer.</a> MRM. 66 (4), 1177-1180 (2011).</li>
<li>Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+hyperpolarized+13C1-pyruvate+transport+and+metabolism+in+living+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells.</a> PNAS. 106 (43), 18131-18136 (2009).</li>
<li>Comment, A., van den Brandt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+a+DNP+prepolarizer+coupled+to+a+rodent+MRI+scanner%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+B%22%5BJournal%5D)">Design and performance of a DNP prepolarizer coupled to a rodent MRI scanner.</a> Conc. Mag. Res. B. 31 (4), 255-269 (2007).</li>
<li>Balzan, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Molecular+Magnetic+Resonance+Imaging+and+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+using+Hyperpolarized+Nuclei%22">Methods for Molecular Magnetic Resonance Imaging and Magnetic Resonance Spectroscopy using Hyperpolarized Nuclei</a>. 5966, EPFL - EDPY. Available from:
 <a target="_blank" href="http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf">http://infoscience.epfl.ch/record/190351/files/EPFL_TH5966.pdf</a> 1-140 (2013).</li>
<li>Bornet, A., Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+Dissolution+Dynamic+Nuclear+Polarization+by+Cross+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JPC+Letters%22%5BJournal%5D)">Boosting Dissolution Dynamic Nuclear Polarization by Cross Polarization.</a> JPC Letters. 4 (1), 111-114 (2013).</li>
<li>Bowen, S., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+sample+injection+for+hyperpolarized+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PCCP%22%5BJournal%5D)">Rapid sample injection for hyperpolarized NMR spectroscopy.</a> PCCP. 12 (22), 5766-5770 (2010).</li>
<li>Cavadini, S., Vasos, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Singlet+states+open+the+way+to+longer+time-scales+in+the+measurement+of+diffusion+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Conc.+Mag.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Singlet states open the way to longer time-scales in the measurement of diffusion by NMR spectroscopy.</a> Conc. Mag. Res. A. 32 (1), 68-78 (2008).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+States+in+Multiple-Spin+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-lived States in Multiple-Spin Systems.</a> Chem. Phys. Chem. 10 (13), 2217-2220 (2009).</li>
<li>Ahuja, P., Sarkar, R., Jannin, S., Vasos, P. R., Bodenhausen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+hyperpolarisation+preserved+in+long-lived+states%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Proton hyperpolarisation preserved in long-lived states.</a> Chem. Comm. 46 (43), 8192-8194 (2010).</li>
<li>Sarkar, R., Comment, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+of+15N-Choline+Metabolites+Enhanced+by+Dynamic+Nuclear+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Proton NMR of 15N-Choline Metabolites Enhanced by Dynamic Nuclear Polarization.</a> JACS. 131 (44), 16014-16015 (2009).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי הם לא היו מתחרים אינטרסים כלכליים

את הנקודות קריטיות של ניסוי פירוק DNP התמ&quot;ג הם: (i) רמת הקיטוב מושגת עבור המצע, אשר קובע את ריכוז המוצר הנמוך ביותר הדרושה עבור ניסויים כמו גם מספר רכישות אות שניתן לבצע וכן (ii) את תקופות חיים המגנטיזציה, לעומת משך ההעברה בין הקיטוב ואת אתרי איתור לשיעור שינוי מצע. מערכת ההזרקה של התקנת DNP הפירוק המתוארים כאן מאפשרת העברת מדגם קטן כמו 3-4 שניות. למרות ההעברה לא הייתה מהירה כמו השיטה המוצעת על ידי ס בואן ו ג Hilty, 26 פסדי קיטוב עבור פירובט הוגבלו בשל ההרפיה האורך...

<table><tbody><tr><td>DNP מקטב</td><td>Vanderklink s.a.r.l (שוויץ)</td><td></td><td>קריוסטט וציוד אלקטרוני לקיטוב מדגם</td></tr><tr><td>רכיבי מערכת ואקום</td><td>ואקום אדוארדס (צרפת)</td><td>מגוון</td><td> - מערך שאיבה טורבו-מולקולרי - מערך שאיבת ממברנה - מערכת שאיבת שורשים בקיבולת גבוהה - אביזרי ואקום ורכיבים </td></tr><tr><td>DNP 3.35T מגנט</td><td>ברוקר (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר NMR 500 מגה-הרץ</td><td>ברוקר (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.0</td><td>OriginLab (ארה"ב)</td><td></td><td>תוכנת ניתוח נתונים</td></tr><tr><td><חזק>כימיקלים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט-1-13C, 99 אטום % 13C</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>אתנול-D6, נטול מים, 99.5 אטום % D</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-הידרוקסי-טמפו 97%</td> <td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד מחוזר (NADH)</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתילן-דיאמין-חומצה טראצטית (EDTA)</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול (DTT)</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אנזים LDH ב&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td>אלבומין סרום <td>בקר L-2500</td><td></td></tr><tr><td>, BSA</td><td>סיגמא אולדריץ' (צרפת)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פירוק דינמי גרעיני קיטוב instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

המגבלה העיקרית של חקירות מבוססות NMR היא רגישות נמוכה. זו מבקש לזמני רכישה ארוכים, ובכך למנוע מדידות NMR בזמן האמת של טרנספורמציות מטבולית. Hyperpolarization באמצעות פירוק DNP עוקף חלק הרגישות מנפיק הודות המגנטיזציה הגרעיני מחוץ לשיווי משקל הגדול הנובע מהעברת קיטוב אלקטרון אל גרעין ספין. אות התמ&quot;ג הגבוהה המתקבלות ניתן להשתמש כדי לפקח על תגובות כימיות בזמן אמת. החסרון של hyperpolarized NMR מתגורר בחלון הזמן הקצר העומד לרשותם לרכישת אות, שהיא בדרך כלל בסדר גודל של קבוע זמן רגיעת אורך הספין הגרעיני, T 1, או, במקרים חיוביים, על הסדר קבוע הרפית הזמן הקשורים את סינגלט של גרעינים מצמידים, T LLS. ספיגת הסלולר של מולקולות אנדוגני קצב חילוף חומרים יכולה לספק מידע חיוני על התפתחות גידולים ותגובת תרופה. נומחקרים תמ&quot;ג הקודם merous hyperpolarized הוכיחו את הרלוונטיות של פירובט כמו מצע מטבולית לניטור הפעילות האנזימטית in vivo. מחקר זה מספק תיאור מפורט של הגדרת הניסוי ושיטות נדרש לחקר תגובות אנזימטיות, בפרט ההמרה פירובט אל לקטט שיעור בנוכחותו של לקטט דהידרוגנאז (LDH), על ידי התמ&quot;ג hyperpolarized.

רווחי אות תמ&quot;ג באמצעות DNP פירוק השפעת DNP מורכבת בהעברת הקיטוב הגבוה של ספיני אלקטרונים מזווגים, בדרך כלל ממולקולות רדיקליות יציבות, כדי גרעיני NMR-פעילים, תחת קרינת מיקרוגל של מדגם. רדיקלים חופשיים בדרך כלל בשימוש הם TAM (OXO63) ו TEMPOL. 4 נהלים קיטוב באמצעות TEMPOL יכול להיות מותאם על ידי &#39;חוצה-הקיטוב&#39;. 25 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rt...

שיפור הרגישות המסופק על ידי קיטוב גרעיני דינמי של פירוק (DNP) מאפשר מעקב אחר תהליכים מטבוליים בזמן אמת על ידי NMR ו-MRI. נדונים המאפיינים והביצועים של מערך DNP ייעודי לפירוק המיועד לחקר תגובות אנזימטיות.

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ&quot;ג

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעקוב אחר תהליכים אנזימטיים בזמן אמת באמצעות תהודה מגנטית גרעינית המועצמת על ידי קיטוב גרעיני דינמי. תהודה מגנטית במצב נוזלי המועצמת על ידי קיטוב גרעיני דינמי, DNP, יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח: כיצד לקבוע, למשל, את קצבי הטרנספורמציה האנזימטית של זוג מולקולות בתא או in vivo מבלי להצטרך לשנות זוג מולקולות זה בשום דרך. התקנת ציוד ה-DNP dissolution במעבדה שלנו והגעתו של ד"ר Riccardo Balzan, בעל תואר PhD מהמעבדה של Arnaud Comment בלוזאן, מהווים צעד משמעותי קדימה עבור המחקר שלנו.DNP מגבירה באופן משמעותי את הרגישות של הניסויים שניתן לבצע בספקטרומטרי ה-NMR של 500 megahertz שלנו. ציוד DNP זה היה הראשון שהותקן בצרפת, ואני מבקש לציין כי כל חברי צוות ה-NMR שלנו היו מעורבים בהפעלת הציוד, ובפרט ברצוני להזכיר את Gildas Bertho, מהנדס המחקר שלנו, ואת Fatiha Kateb, ה-maitre de conferences שלנו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות ישיר ובזמן אמת של התסבסב ונגזרותיו האנדוגניות ברזולוציית זמן של שניות.עבור תמיסת הפולריזציה, הכין שני מיליליטר של תמיסת סודיום פירובט בריכוז 1.12 מולרי, המסומנת בפחמן 13 ומסוממת ב-33 מילימול של רדיקל TEMPO, ביחס נפחי של שניים לאחד של מים דויטריים לאתנול דויטרי עבור תצפיות פחמן 13. הורד את טמפרטורת הקריוסטט של הפולריזציה הגרעינית הדינמית, או DNP, באמצעות הליך הקירור על ידי לחיצה על כפתור ה-cooldown בממשק התוכנה של הקריוסטט. אסוף הליום נוזלי לקריוסטט ה-DNP באמצעות הליך המילוי.לחצו על כפתור המילוי בממשק התוכנה של הקריוסטט. לאחר מכן, העבירו 300 µL של תמיסת הקיטוב האופטימלית למכל הדגימה שסופק עם מקטב ה-DNP. הקפיאו את מכל הדגימה עם הדגימה בתוכו על ידי טבילה עדינה באמבט חנקן נוזלי.יש להסיר את החנקן הנוזלי שעשוי להישאר במכל הדגימה לאחר הליך ההקפאה, על ידי הוצאת מכל הדגימה מאמבט החנקן הנוזלי והפיכתו על ראשו. לאחר מכן, הכנס את הדגימה לקריוסטט על ידי הכנסת מכל הדגימה למחזיק הדגימות. לאחר מכן, מקם את מחזיק הדגימות בתוך התושבת הראשית של הקריוסטט, לפני הכנסת מוליך הגלים של המיקרוגל אל מחזיק הדגימות.הפחית את טמפרטורת הקריוסטט על ידי הפעלת הליך קירור של קלווין אחד. לחץ על כפתור קירור קלווין אחד בממשק התוכנה של הקריוסטט. הפעל את מקור המיקרוגלים והקרן את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור הפעלת מיקרוגלים בממשק התוכנה של הקריוסטט.נתק את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ הגילוי של קונסולת ה-NMR מסליל הספקטרומטר על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכה שלו. חבר את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ הגילוי למחבר הקואקסיאלי של סליל ה-NMR של הקריוסטט. לאחר מכן, הכנס את המחבר הזכר של כבל קונסולת ה-NMR למחבר הנקבה של סליל ה-NMR של הקריוסטט, תוך שימת לב לפין ההכוון.לחץ בחוזקה וסובב את המחבר עם כיוון השעון ב-90 מעלות. מדוד את אות ה-NMR התרמי במצב מוצק באתר הקריוסטט באמצעות רצף pulse-acquire פשוט עם פולסים שאינם מכויילים ובזווית flip נמוכה, החוזרים במרווח של t השווה לחמש דקות. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על enter במקלדת.לאחר הפעלת הליך הקיטוב, מדוד את אות ה-NMR המועצם באמצעות DNP במצב מוצק, תוך שימוש באותו הליך ובאותם תנאים ששימשו למדידת האות התרמי. נתק את כבל הקואקסיאל של ערוץ הגילוי של קונסולת ה-NMR מסליל ה-NMR של הקריוסטט על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכתו. לאחר מכן, חבר את כבל הקואקסיאל של ערוץ הגילוי למחבר הקואקסיאלי של סליל הספקטרומטר.הכנס את המחבר הזכרי של כבל קונסולת ה-NMR אל המחבר הנקבי של סליל הספקטרומטר, תוך שימת לב לפין ההכוון. לחץ בחוזקה וסובב את המחבר עם כיוון השעון ב-90 מעלות. הכן תמיסת LDH משריר ארנב טרייה בריכוז של יחידה אחת למילילטר בבופר תגובה עם 20 micrograms per milliliter של bovine serum albumin.בשלב הבא, ערבב 478 microliters של תמיסת באפר לתגובה, 2 microliters של תמיסת LDH ו-20 microliters של מים דויטריים כדי לאפשר ייצוב של שדה הספקטרומטר, או נעילה. לאחר מכן, העבר את נפח התמיסה של 500 microliters לשפורת NMR של 5 millimeter. חבר את שפורת ההעברה למכשיר הזרקה אוטומטי בהתאמה אישית, המפריד בין התמיסה ההיפר-פולריזית לבין גז ההליום המשמש להעברה.המכשיר מעביר באופן אוטומטי 500 µL של תמיסה היפר-פולריזית לתוך מבחנת הדגימה. לפני ההמסה, מקמו את מבחנת ה-NMR בקוטר 5 מילימטר המכילה 500 µL של דגימה במרכז השדה (isocenter) של ספקטרומטר ה-NMR בעוצמה של 11.74 tesla. הכניסו 5 mL של מים דויטריים למבשל של מתאם ההמסה.הגבר את הלחץ וחמם את המים הדאוטריים באמצעות תיל ההתנגדות עד להגעה לטמפרטורה של כ-180 עד 200 מעלות צלזיוס, על ידי לחיצה על כפתור prepare heater בממשק התוכנה של הקריוסטט. לחץ על כפתור SS Operations בממשק התוכנה של הקריוסטט. לאחר מכן, הסר את מוליך המיקרוגל מתוך התושבת להמסה.החליקו את תושבת ההמסה למטה אל תוך מחזיק הדגימה. תושבת ההמסה חייבת להגיע לתחתית מחזיק הדגימה ויש לדחוף אותה בחוזקה כדי ליצור חיבור אטום עם מיכל הדגימה, ובכך למנוע דליפה של מים דויטריים אל הקריוסטט. לחצו על טריגר החומרה כדי להתחיל את רצף ההמסה, שהוא רצף זמנים שנקבע מראש של פעולות שסתומי פנאומטיקה.מיד לאחר ההמסה, התקן ההזרקה מערבב 500 µL של תמיסה היפר-פולריזית עם הדגימה הממוקמת בספקטרומטר ה-NMR. לאחר ההמסה, מדוד את אות ה-NMR ההיפר-פולריזי מהדגימה בספקטרומטר באמצעות סדרה של רצפי פעימות-רכישה (pulse-acquire) בזווית הflipping של 10 מעלות, במרווחים של 1.5 שניות, כדי לעקוב אחר התקדמות המגנטיזציה של התסבסט והמוצר. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על enter.לאחר שהמגנטיזציה רגעה לחלוטין, מדוד את אות ה-NMR התרמי באמצעות סדרה של רצפי פולס-רכישה (pulse-acquire) בזווית הפיכה של 90 מעלות, במרווחים של כ-שלוש דקות, מה שמתאימה לכ-3T1. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על מקש ה-enter. כאן, מהלך הזמן של ספקטרומים שהתקבלו מפולסים חוזרים בזווית הפיכה של 10 מעלות מראה את הרגישות והרזולוציה הזמנית של הטכניקה.לאחר זיהוי השיאים של תסבסב הפירובט ותוצר הלַקְטָט, מתבצעת כמותית של המטבוליטים באמצעות אינטגרציה של האות. הפעילות האנזימטית נקבעת מתוך מהלך הזמן של אות התוצר על ידי התאמה למודל לינארי. כדי לתקף את המדידה, אותו ערך מוערך באמצעות קצב התגובה הראשוני, מהיחס בין אותות התוצר לתסבסב.ברגע שהשיטה נלמדת היטב, ניתן לבצע מדידה מלאה של פעילות אנזימטית תוך כשעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה לגבי האופן שבו מייצרים סובסטרט בעל קוטביות גבוהה עבור NMR, מזריקים אותו לתמיסה המכילה אנזים, ועוקבים אחר הפעילות האנזימטית באמצעות NMR מועצם ב-DNP. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין בקפידה את התמיסה האנזימטית עם אנזים וסובסטרטים משלימים טריים, ולהימנע מכל בועת אוויר בתוך מבחנת הדגימה.עם פיתוח תהודה מגנטית המועצמת ב-DNP במצב נוזלי, חוקרים יכולים כעת לחקור ספיגה של מצעים ואת התמירתו האנזימטית בתוך סוגים שונים של תאים על ידי מדידת קצב היווצרות המוצר. זכרו כי עבודה עם ציוד קריוגני ושדות מגנטיים חזקים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע מדידות אלו, כגון לבישת מיגון אישי מפני חומרים קריוגניים ווידוא היעדרם של חפצים מגנטיים.בניגוד ל-NMR קלאסי, NMR המבוסס על DNP בהמסה מוגבל לחלון זמן ניסויי של דקות לכל היותר, תלוי במצע ובמצב הנוכחי של הדברים. הגבלה זו מהווה מכשול למעבר מעבר לספקטרוסקופיית ממד אחד. NMR של DNP בהמסה דורש פיתוח כדי להביאו לרמת הגמישות של NMR רב-ממדי קלאסי.

dissolution-dynamic-nuclear-polarization-instrumentation-for-real

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

פנטום דינמי רב-תאים משמש לדמות ביולוגיה מעניינת למחקרים מטבוליים באמצעות סוכני תהודה מגנטים היפר-פולריזציה.

שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

תהודה מגנטית אלקטרונית חדשה (EPR) שיטה, מהירה סריקה EPR (RS-EPR), מודגם הדמיה מרחבית רפאים 2D אשר עדיפה על גל מתמשך המסורתית (CW) טכניקה ופותח מקומות חדשים בתחום ההדמיה vivo. תוצאות הם הפגינו ב 250 MHz, אבל הטכניקה ישימה בתדירות כלשהי.

ראפיד סריקת אלקטרונים פאראמגנטיים תהודה פותחת אפיקים חדשים עבור פרמטרים חשובים מבחינת פיזיולוגית ההדמיה<em&gt; In vivo</em

קיטוב גרעיני דינמי עם פירוק הדגימה שלאחר מכן איפשר מחקרים בזמן אמת של חילוף חומרים במערכות ביולוגיות. היפרפולריזציה [1-13C] פירובט שימשה לחקר פעילות לקטט דהידרוגנאז בקו תאי קרצינומה של הערמונית במבחנה.

Hyperpolarized 13 ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית מטבולית C והדמיה

אנו מתארים כאן שיטה לזיהוי זרחונים מרובים של חלבון לא מסודר באופן מהותי על ידי ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית (NMR), תוך שימוש בחלבון טאו כמקרה מבחן. טאו רקומביננטי מועשר איזוטופית ושונה במבחנה על ידי קינאז לפני איסוף הנתונים וניתוחם.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

פרוטוקול להכנת 13ג,15דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התלות בשדה המגנטי של זמן ההרפיה של רשת הסחרור של 13C-תרכובות מועשר, היפרקוטביות באמצעות פולריזציה גרעינית דינמית, תוך שימוש במהירות מהירה על אופניים בשדה. באופן ספציפי, הדגמנו את זה עם הפירובט [1-13ג], אבל הפרוטוקול יכול להיות מורחב לשני מצעים היפרקוטב אחרים.

מדידת רשת ספין-סריג הרפיה השדה המגנטי של היפרקוטב [1-13ג] פיבט

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

פרוטוקול זה משלב מערכת ביו-ריאקטור שנבנתה בהתאמה אישית עם ספקטרוסקופיה של ¹³C NMR היפרפולרית כדי למדוד מטבוליזם פירובט בזמן אמת בתאים חיים, ולשפר את יכולת השחזור והדיוק הקינטי עבור מחקרים מטבוליים ויישומי סינון תרופות.

זיהוי מטבולי בזמן אמת בתאים חיים באמצעות תמ"ג היפרפולרי 13C

למד מעקב בזמן אמת של תהליכים אנזימטיים באמצעות שיפור רגישות DNP ב-NMR. טכניקה זו מאפשרת קביעת קצבי תגובות אנזימטיות מבלי לשנות את המולקולות הנחקרות.

פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ"ג

גלה סרטונים נוספים