פירוק דינמי גרעיני קיטוב Instrumentation מדידות קצב התגובה האנזימטית בזמן אמת על ידי התמ"ג

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לעקוב אחר תהליכים אנזימטיים בזמן אמת באמצעות תהודה מגנטית גרעינית המועצמת על ידי קיטוב גרעיני דינמי. תהודה מגנטית במצב נוזלי המועצמת על ידי קיטוב גרעיני דינמי, DNP, יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח: כיצד לקבוע, למשל, את קצבי הטרנספורמציה האנזימטית של זוג מולקולות בתא או in vivo מבלי להצטרך לשנות זוג מולקולות זה בשום דרך. התקנת ציוד ה-DNP dissolution במעבדה שלנו והגעתו של ד"ר Riccardo Balzan, בעל תואר PhD מהמעבדה של Arnaud Comment בלוזאן, מהווים צעד משמעותי קדימה עבור המחקר שלנו.

DNP מגבירה באופן משמעותי את הרגישות של הניסויים שניתן לבצע בספקטרומטרי ה-NMR של 500 megahertz שלנו. ציוד DNP זה היה הראשון שהותקן בצרפת, ואני מבקש לציין כי כל חברי צוות ה-NMR שלנו היו מעורבים בהפעלת הציוד, ובפרט ברצוני להזכיר את Gildas Bertho, מהנדס המחקר שלנו, ואת Fatiha Kateb, ה-maitre de conferences שלנו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות ישיר ובזמן אמת של התסבסב ונגזרותיו האנדוגניות ברזולוציית זמן של שניות.

עבור תמיסת הפולריזציה, הכין שני מיליליטר של תמיסת סודיום פירובט בריכוז 1.12 מולרי, המסומנת בפחמן 13 ומסוממת ב-33 מילימול של רדיקל TEMPO, ביחס נפחי של שניים לאחד של מים דויטריים לאתנול דויטרי עבור תצפיות פחמן 13. הורד את טמפרטורת הקריוסטט של הפולריזציה הגרעינית הדינמית, או DNP, באמצעות הליך הקירור על ידי לחיצה על כפתור ה-cooldown בממשק התוכנה של הקריוסטט. אסוף הליום נוזלי לקריוסטט ה-DNP באמצעות הליך המילוי.

לחצו על כפתור המילוי בממשק התוכנה של הקריוסטט. לאחר מכן, העבירו 300 µL של תמיסת הקיטוב האופטימלית למכל הדגימה שסופק עם מקטב ה-DNP. הקפיאו את מכל הדגימה עם הדגימה בתוכו על ידי טבילה עדינה באמבט חנקן נוזלי.

יש להסיר את החנקן הנוזלי שעשוי להישאר במכל הדגימה לאחר הליך ההקפאה, על ידי הוצאת מכל הדגימה מאמבט החנקן הנוזלי והפיכתו על ראשו. לאחר מכן, הכנס את הדגימה לקריוסטט על ידי הכנסת מכל הדגימה למחזיק הדגימות. לאחר מכן, מקם את מחזיק הדגימות בתוך התושבת הראשית של הקריוסטט, לפני הכנסת מוליך הגלים של המיקרוגל אל מחזיק הדגימות.

הפחית את טמפרטורת הקריוסטט על ידי הפעלת הליך קירור של קלווין אחד. לחץ על כפתור קירור קלווין אחד בממשק התוכנה של הקריוסטט. הפעל את מקור המיקרוגלים והקרן את הדגימה על ידי לחיצה על כפתור הפעלת מיקרוגלים בממשק התוכנה של הקריוסטט.

נתק את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ הגילוי של קונסולת ה-NMR מסליל הספקטרומטר על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכה שלו. חבר את הכבל הקואקסיאלי של ערוץ הגילוי למחבר הקואקסיאלי של סליל ה-NMR של הקריוסטט. לאחר מכן, הכנס את המחבר הזכר של כבל קונסולת ה-NMR למחבר הנקבה של סליל ה-NMR של הקריוסטט, תוך שימת לב לפין ההכוון.

לחץ בחוזקה וסובב את המחבר עם כיוון השעון ב-90 מעלות. מדוד את אות ה-NMR התרמי במצב מוצק באתר הקריוסטט באמצעות רצף pulse-acquire פשוט עם פולסים שאינם מכויילים ובזווית flip נמוכה, החוזרים במרווח של t השווה לחמש דקות. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על enter במקלדת.

לאחר הפעלת הליך הקיטוב, מדוד את אות ה-NMR המועצם באמצעות DNP במצב מוצק, תוך שימוש באותו הליך ובאותם תנאים ששימשו למדידת האות התרמי. נתק את כבל הקואקסיאל של ערוץ הגילוי של קונסולת ה-NMR מסליל ה-NMR של הקריוסטט על ידי סיבוב המחבר נגד כיוון השעון ב-90 מעלות ומשיכתו. לאחר מכן, חבר את כבל הקואקסיאל של ערוץ הגילוי למחבר הקואקסיאלי של סליל הספקטרומטר.

הכנס את המחבר הזכרי של כבל קונסולת ה-NMR אל המחבר הנקבי של סליל הספקטרומטר, תוך שימת לב לפין ההכוון. לחץ בחוזקה וסובב את המחבר עם כיוון השעון ב-90 מעלות. הכן תמיסת LDH משריר ארנב טרייה בריכוז של יחידה אחת למילילטר בבופר תגובה עם 20 micrograms per milliliter של bovine serum albumin.

בשלב הבא, ערבב 478 microliters של תמיסת באפר לתגובה, 2 microliters של תמיסת LDH ו-20 microliters של מים דויטריים כדי לאפשר ייצוב של שדה הספקטרומטר, או נעילה. לאחר מכן, העבר את נפח התמיסה של 500 microliters לשפורת NMR של 5 millimeter. חבר את שפורת ההעברה למכשיר הזרקה אוטומטי בהתאמה אישית, המפריד בין התמיסה ההיפר-פולריזית לבין גז ההליום המשמש להעברה.

המכשיר מעביר באופן אוטומטי 500 µL של תמיסה היפר-פולריזית לתוך מבחנת הדגימה. לפני ההמסה, מקמו את מבחנת ה-NMR בקוטר 5 מילימטר המכילה 500 µL של דגימה במרכז השדה (isocenter) של ספקטרומטר ה-NMR בעוצמה של 11.74 tesla. הכניסו 5 mL של מים דויטריים למבשל של מתאם ההמסה.

הגבר את הלחץ וחמם את המים הדאוטריים באמצעות תיל ההתנגדות עד להגעה לטמפרטורה של כ-180 עד 200 מעלות צלזיוס, על ידי לחיצה על כפתור prepare heater בממשק התוכנה של הקריוסטט. לחץ על כפתור SS Operations בממשק התוכנה של הקריוסטט. לאחר מכן, הסר את מוליך המיקרוגל מתוך התושבת להמסה.

החליקו את תושבת ההמסה למטה אל תוך מחזיק הדגימה. תושבת ההמסה חייבת להגיע לתחתית מחזיק הדגימה ויש לדחוף אותה בחוזקה כדי ליצור חיבור אטום עם מיכל הדגימה, ובכך למנוע דליפה של מים דויטריים אל הקריוסטט. לחצו על טריגר החומרה כדי להתחיל את רצף ההמסה, שהוא רצף זמנים שנקבע מראש של פעולות שסתומי פנאומטיקה.

מיד לאחר ההמסה, התקן ההזרקה מערבב 500 µL של תמיסה היפר-פולריזית עם הדגימה הממוקמת בספקטרומטר ה-NMR. לאחר ההמסה, מדוד את אות ה-NMR ההיפר-פולריזי מהדגימה בספקטרומטר באמצעות סדרה של רצפי פעימות-רכישה (pulse-acquire) בזווית הflipping של 10 מעלות, במרווחים של 1.5 שניות, כדי לעקוב אחר התקדמות המגנטיזציה של התסבסט והמוצר. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על enter.

לאחר שהמגנטיזציה רגעה לחלוטין, מדוד את אות ה-NMR התרמי באמצעות סדרה של רצפי פולס-רכישה (pulse-acquire) בזווית הפיכה של 90 מעלות, במרווחים של כ-שלוש דקות, מה שמתאימה לכ-3T1. לאחר הגדרת המדידה, הקלד zg בשורת הפקודה של התוכנה ולחץ על מקש ה-enter. כאן, מהלך הזמן של ספקטרומים שהתקבלו מפולסים חוזרים בזווית הפיכה של 10 מעלות מראה את הרגישות והרזולוציה הזמנית של הטכניקה.

לאחר זיהוי השיאים של תסבסב הפירובט ותוצר הלַקְטָט, מתבצעת כמותית של המטבוליטים באמצעות אינטגרציה של האות. הפעילות האנזימטית נקבעת מתוך מהלך הזמן של אות התוצר על ידי התאמה למודל לינארי. כדי לתקף את המדידה, אותו ערך מוערך באמצעות קצב התגובה הראשוני, מהיחס בין אותות התוצר לתסבסב.

ברגע שהשיטה נלמדת היטב, ניתן לבצע מדידה מלאה של פעילות אנזימטית תוך כשעתיים, במידה והיא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה לגבי האופן שבו מייצרים סובסטרט בעל קוטביות גבוהה עבור NMR, מזריקים אותו לתמיסה המכילה אנזים, ועוקבים אחר הפעילות האנזימטית באמצעות NMR מועצם ב-DNP. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין בקפידה את התמיסה האנזימטית עם אנזים וסובסטרטים משלימים טריים, ולהימנע מכל בועת אוויר בתוך מבחנת הדגימה.

עם פיתוח תהודה מגנטית המועצמת ב-DNP במצב נוזלי, חוקרים יכולים כעת לחקור ספיגה של מצעים ואת התמירתו האנזימטית בתוך סוגים שונים של תאים על ידי מדידת קצב היווצרות המוצר. זכרו כי עבודה עם ציוד קריוגני ושדות מגנטיים חזקים עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע מדידות אלו, כגון לבישת מיגון אישי מפני חומרים קריוגניים ווידוא היעדרם של חפצים מגנטיים.

בניגוד ל-NMR קלאסי, NMR המבוסס על DNP בהמסה מוגבל לחלון זמן ניסויי של דקות לכל היותר, תלוי במצע ובמצב הנוכחי של הדברים. הגבלה זו מהווה מכשול למעבר מעבר לספקטרוסקופיית ממד אחד. NMR של DNP בהמסה דורש פיתוח כדי להביאו לרמת הגמישות של NMR רב-ממדי קלאסי.