DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד סיבי מיו מה-flexo digitorum brevis של עכברים, כך שהסרקולמה עלולה להיפגע לאחר מכן באמצעות פציעה בלייזר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור את תפקוד החלבון ולוקליזציה בסיבי מיו בוגרים ללא צורך ביצירת עכברים טרנסגניים. ניתן להתאים שיטה זו לבדיקת חומרים פרמצבטיים ושיטות אחרות לפציעה של תאים.

התחל בהפשרת תמיסת הקולגנאז. לאחר מכן, הכינו שתי בארות מצלחת 12 בארות. כדי שכל סיב יהיה מבודד באחד, הוסף היטב מיליליטר של חימום מוקדם, DMEM בתוספת BSA טען היטב את השני עם מיליליטר של צלצול x x חם מראש.

הכינו גם צלחת סיגרים בגודל 35 מילימטר עם 10 מיליליטר צלצולים טריים. לאחר הסרת כפות הרגליים מהחיה המועברת, סיכה סוליה הדוקה של רגל אחת כלפי מעלה על צלחת הסיגר עם 30 מחטים מד דרך כל אחד מחמשת קצות האצבעות. ובקרסול, הכינו כל כף רגל באופן הבא.

ראשית, חותכים את העור. התחל מהקרסול וחתוך לאורך קו השיער עד לאצבעות הרגליים. היזהר לא לחתוך את השרירים מתחת לעור.

לאחר מכן, אחזו בעור בבסיס הקרסול וחתכו לרוחב העקב. לאחר מכן הרם את דש העור באמצעות מלקחיים, וכוון את המספריים לכיוון העור, לא לשריר, וחתוך בזהירות את רקמת החיבור כדי להסיר את העור. כעת כדי להסיר את שריר ה-FDB, התחל בחיתוך הגיד הגדול בעקב כדי לשחרר אותו מהעצם.

לאחר מכן נתחו את צרור ה-FDB מהגיד הלבן הגדול. הסר בזהירות את רקמת החיבור המחוברת בתהליך זה. לאחר השלמתו, הרם את הצרור מהגידים הבסיסיים כדי לחשוף גידים לבנים בהירים המובילים לאצבעות.

הצרור צריך להתרומם בקלות. לאחר מכן שחרר את הצרור מכף הרגל על ידי חיתוך הגיד הלבן ליד אצבעות הרגליים. העבירו את צרור השרירים לבאר של DMEM בתוספת BSA, וחזרו על התהליך על הרגל השנייה לפני שתמשיכו.

כעת ניתן לבדוק את הצלחת האלקטרופורציה, המכוסה בפרוטוקול הטקסט. בצע בדיקת אבחון זו במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. אם יצליח, יעילות הטרנספקציה יכולה להיות עד 90%לאחר בידוד כל חבילות ה-FDB, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת קולגנאז לכל אחת.

ובכן דגרו את הצלחת בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 10% פחמן דו חמצני למשך כשעה. זה ישתנה בין מודלים של מחלות ותלוי גם ביעילות האנזימים. לאחר השלמת הדגירה, העבירו בזהירות את צרורות ה-FDB לתמיסת הצלצול.

לאחר מכן בארות טרטר את הצרורות באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד עם קדח מורחב, עשה זאת בעדינות כ -15 פעמים במהלך האיטרציה, שים לב שהסיבים השלמים נופלים לתמיסה. אם זה לא קורה, יש להאריך את הדגירה בקולגנאז. תשומת לב נכונה לעיכול.

זמן וכוח הטיטרציה הם קריטיים בהליך זה. עיכול יתר, פיצול סיבים ונזק לסרקו ליאל יכולים להתרחש מה שמוביל להכנת שריר לא אופטימלית. כעת אוספים את הסיבים המבודדים בתמיסה ומעבירים עד חצי מיליליטר תמיסה לצלחת התרבות.

המשיכו לתת לשרירים להתעכל עוד 15 דקות. לאחר מכן חזור על הקצב ואסוף שוב את הסיבים המבודדים במידת הצורך. המתן עוד 15 דקות וחזור על התהליך בפעם השלישית.

לאחר שהסיבים הורשו להיצמד לתבשיל למשך 15 דקות לפחות, יש לדלל את שאריות הקולגנאז בצלצולים טריים או לשנות את התמיסה לחלוטין. הסיבים מוכנים כעת להדמיית פלסמיד. קידוד DNA לחלבון מתויג פלואורסצנטי הועבר לצרור השרירים FDB.

מקדם ה-CMV מתאים היטב למטרה זו. ניתן היה לראות פלואורסצנטיות בכמה סיבי מיו מבודדים, שבעה ימים לאחר האלקטרופורציה. לאחר מכן שריר ה-FDB עוכל וסיבי מיו בודדו בתהליך זה.

נזק לסיבי המיו יכול להתרחש כפי שמצוין על ידי החץ הלבן. החצים השחורים מראים את הבלבל בקרום הסרקולמה. סיבים כאלה הוסרו מהניסוי.

סיבי מיו לא פגועים צולמו באמצעות DIC fm. צבע מספר 4 64 היה נוכח פלואורסצנטי מינימלי FM 4 64 בקרום השריר לפני הפציעה. צפייה בסיבי ה-FM העמוסים במיקרוסקופיה קונפוקלית חשפה פרטים רבים יותר.

המיופייבר המרוכז נטול גרעינים. גרעינים כאלה יכולים להשפיע על ניתוח צבע FM ויש להימנע מהם כדי לגרום נזק לממברנה. הנח את שיער ה-ROI על סרקומה חיובית FM D התחל את פרוטוקול אבלציה של הממברנה לאחר שליטה.

ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשעתיים. ובזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שזמן העיכול מושפע מפעילות הקולגנאז, הרקע הגנטי וסוג מודל המחלה.