Name: DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: למד את שיטת האלקטרופורציה להכנסת חלבונים פלואורסצנטיים לסיבי שריר עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר לוקליזציה ותפקוד חלבונים בסיבים בוגרים מבלי ליצור עכברים טרנסגניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות מעניקה NS047726, NS072027, וAR052646.

השיטות במחקר זה בוצעו בהתאם אתי עם בית הספר לאוניברסיטת נורת&#39;ווסטרן פיינברג לרפואה מוסדי טיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC) אישרו הנחיות. כל המאמצים שנעשו כדי למזער את הסבל. 1. נוהל ניסיון בElectroporation vivo של מכופף digitorum רוויס (FDB) השריר Bundle בעכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים עיצוב לביטוי בvivo באמצעות אמרגן הידוע להביע בתאי יונקים (למשל, ציטומגלווירוס, CMV) או בשרירים (לדוגמא, שריר קריאטין קינאז, MCK) 6,7. פלסמידים גדולים יותר עשויים לבטא ברמות נמוכות יותר. אמרגן CMV כבר נעשה שימוש נרחב 6,7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר פלסמידים מא coli באמצעות תנאי תשלום רעלן פנימי לפי הוראות יצרן. ממיסים את פלסמיד במאגר סטרילי, רעלן פנימי חינם TE ב2-5 פלסמיד / μl מיקרוגרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל וaliquot פלסמיד לconcentration של 20 מיקרוגרם של ה- DNA בμl 10 של רעלן פנימי סטרילי (מיקרוגרם / μl 2) TE החופשי חיץ להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. הכן aliquot אחד לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות של hyaluronidase ל1X עם פוספט סטרילי שנאגרו מלוח ללא סידן ומגנזיום (PBS - / -) נותן ריכוז סופי של 8 יחידות. Aliquot 10 μl של hyaluronidase המדולל להזרקה לתוך צינור microcentrifuge סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות isoflurane 2.5% עד מסומם ואינו מגיב לזנב או צביטת הבוהן. מניחים את החיה במצב שכיבה על כרית חימום או שולחן חימום כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את שודד של העכבר עם יישום לסירוגין של לשפשף יוד povidone ואלכוהול שלוש פעמים תוך שימוש בטכניקת הכנה שמקורם מאתר המחט ומקרינה כלפי חוץ. טכניקה זו שומרת על אתר המחט במצב ספטית, מזעור מבוא הפתוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק שודד הדרכים של העכבר דואר עם 10 μl של פתרון hyaluronidase 1x (2 מ&quot;ג / מיליליטר = 8 יחידות) בין העור והשרירים באמצעות מזרק 1 מיליליטר סטרילי. Hyaluronidase מעכל רכיבים של מטריקס להתיר כניסה יעילה יותר של פלסמיד לmyofibers. הזן בבסיס העקב ולקדם את המחט לכיוון הבהונות. לאט לאט לשחרר את הנוזל כמחט חזר בו. אתר ההזרקה מתחת לעור ירחיב ולהתחיל להפוך ורוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6 ו -1.7 ברגל הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתק את ההרדמה ומניח את העכבר בחזרה בכלוב. אפשר העכבר כדי להתאושש באופן מלא מהרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נהלי עיקור הרדמה ורגל, צעדים 1.5 ו -1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את ה- DNA פלסמיד המדולל לשודד הדרכים באותו אופן כפי שhyaluronidase. ודא שעוצמת הקול המרבית היא 20 μl או פחות. לביטוי פלסמיד הכפול להזריק 20 מיקרוגרם של כל פלסמיד עם נפח מרבי של 20 &amp;# 181; L או פחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הזרקת פלסמיד על שודד הנגדי או להשתמש ברגל הנגדית לזריקות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הרגל שהייתה בתחילה מוזרקת, להרים את העור מהשרירים והדגישו עם מלקחיים עדינים ומניח את מחט G אחד 27 דרך הכדורים של עור ליד הבהונות בעמדת בניצב לקו לרפא הבוהן של כף הרגל. קח מחט G 27 סטרילי שני ולמקם אותו בצורה אופקית דרך העור בעקב. מחטי מקום במקביל לכל פרט 1 סנטימטר אחר ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במהדק תנין, אלקטרודות מהדק למחטים המקבילות לוודא המחטים לא ליצור קשר עם אחד אחרת. השימוש בפלסטלינה יכולה להבטיח את מהדק במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר אלקטרודות לממריץ חשמלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporate השרירים על ידי הפעלת 20 פעימות, 20 אלפית שניים בזמן / כל אחד, ברץ 1, ב 100 V / סנטימטר. הבהונות עשויות עווית עם גירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך הגירוי ברגל הנגדית במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הסר מחטים. נגב את השודד עם לשפשף יוד povidone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את ההרדמה. החזר את העכבר לכלוב ההתאוששות ופעילות צג. אם ההליך בוצע כצפוי, את החיה צריכה להחזיר ניידות נורמלית בתוך 30 דקות ולהפגין אין הבדל ברמת ניידות או פעילות ממראש הזרקת התנהגות. לפיכך, לא משככי כאבים לאחר הליך נדרשים. על ההתאוששות, להחזיר את בעלי החיים לביבר. הערה: ביטוי חלבון יכול להיות assayed מוקדם ככל 48 שעות לאחר electroporation. עם זאת, על מנת לאפשר התאוששות מלאה יותר לאחר electroporation, אנחנו מעדיפים בידוד ומחקר של myofibers 7-14 ימים לאחר electroporation 10. ביטוי יכול להיות assayed כל עוד 4 שבועות לאחר electroporation. </li></ol> 2. נוהל ניסיון לבידוד של מכופף digitorum רוויס הסיבים (FDB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> collagenase הפשרה. לכל חבילה FDB להכין שתי בארות בצלחת תרבית רקמת 12 גם. באחד גם להוסיף 1 מ &#39;l הנשרים מדיה מחומם מראש השתנה Dulbecco בתוספת סרום שור אלבומין (DMEM + BSA) ובשני טוב להוסיף 1 מיליליטר של טרום חמם Ringers פתרון. בנוסף, להוסיף טרי 10 מיליליטר של תמיסת Ringers 1x למ&quot;מ 35 Sylgard צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי החיים באמצעות CO 2 או משאיפת גז הרדמה, ואחריו נקע בצוואר הרחם או בשיטה אחרת, כדי להבטיח את המוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרגליים האחוריות מעל מפרק הקרסול באמצעות סכין גילוח נקי ולצלול בפתרון Ringers 1x במ&quot;מ 35 Sylgard צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פין רגל אחת הדוק, בלעדי פונה כלפי מעלה, על צלחת Sylgard עם 30 מחטי G דרך כל 5 הטיפים בוהן ובקרסול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בקרסול, לגזור את העור כלפי מעלה בצד של כף הרגל לאורך קו השיער לכיוון הבהונות, נזהר שלא ניק השרירים מתחת לעור. חזור על פעולה בצד השני של רגל השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחזיק את העור בבסיס הקרסול עם מלקחיים עדינים, לחתוך את העור פני העקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתיחת העורדש עם מלקחיים, המספריים מצביעים לכיוון העור כדי לא ניק השריר. לגזור רקמת חיבור הבסיסית, ביעילות הסרת העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את חבילת שריר FDB לחתוך את הגיד הגדול בעקב לשחרר את הגיד מהעצם. מחזיק גיד עם מלקחיים, לנתח את צרור FDB מהגיד הלבן הגדול הסרת כל רקמת חיבור שצורפה לFDB עם מספריים בזהירות. אם נעשה כראוי החבילה תהיה בקלות להרים את של גידי הבסיס חושפים גידים לבנים בוהקים מובילים לספרות בודדת. חותך את FDB בגידים ליד הבהונות לשחרר את החבילה מהרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כל חבילת השרירים בDMEM + BSA המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה ברגל הנגדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל שרירי FDB מבודדים, להוסיף של collagenase 100 μl לכל DMEM + BSA ושרירים המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההצלחה של electroporation במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לפני העיכול. אם properl עשהy, כלפי מעלה של 90% יעילות transfection יכול להיות מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בC חממת humidified, 37 מעלות ב -10% CO 2 לכ 1 שעה. זמן הדגירה עשוי להשתנות בהתאם לדגם מחלה ורקע והרבה collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שעה 1, בזהירות להעביר את צרור FDB לפתרון Ringers רק המכיל גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate צרור FDB בהיטב עם פתרון Ringers בעזרת פיפטה 1 מיליליטר. חותך את הקצה של קצה פיפטה בסכין גילוח נקי כך שהחבילה יכולה בקלות לעבור את קצה פיפטה. בעדינות triturate השריר (~ 15 פעמים) מאפשר החבילה לעבור למעלה ולמטה במקביל לקצה. סיבים שלמים ייפלו לתוך צלצולי הפתרון. כאשר סיבים לא בקלות ליפול החבילה, למקם את השרירים גב לפתרון collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט הסיבים המבודדים על הצלחת ~ 500 μl לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לשריר כדי לעכל בבאר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.15ל2.17 עד החבילה יורדת בגודל וברוב הסיבים הם ניתקו מהחבילה (בדרך כלל בסך הכל 2-3 פעמים). ברגע שניתק את השריר עובר בקלות דרך קצה פיפטה 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו סיבים לצרף הצלחת למינימום של 15 דקות. פתרון Ringers טרי ניתן להוסיף לצלחת לדלל collagenase שייר או השתנה בהתאם לאילוצי זמן. הערה: סיבים מוכנים כעת להדמיה. </li></ol> 3. נוהל ניסיון להדמיה של נזק ממברנה מושרה לייזר באמצעות מיקרוסקופיה confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבים טען מייד לפני הדמיה עם 300 μl של 2.5 מיקרומטר FM 1-43 של צבע 4-64 FM בפתרון אצבעות. בדרך כלל, סיבי תמונה 15 דקות לשעה 2 לאחר בידוד. עם זאת, ניתן הדמיה עד להודעה סיבי בידוד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת זכוכית התחתונה במיקרוסקופ confocal מצויד בליזר UV ואובייקטיבי 60X / 63X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר סיבים. ודא הסיבים מחובר היטבלמנה על ידי הקשה על בסיס מיקרוסקופ. תכלול סיבים שניזוקו בתהליך הניתוק. סיבים פגומים עשויים להכיל שלפוחיות קרום, רמות גבוהות של ספיגת צבע FM, סלסול או לכופף בעוצמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום לניזק קרום בסיבים, מקם את sarcolemma במרכז חלון ההדמיה עם שדה ברור של גרעינים. להתמקד בsarcolemma באמצעות ערוץ הצבע FM כך שsarcolemma הוא חד ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שיער צלב ROI על sarcolemma ניצול ערוץ FM 4-64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר את נקודת פיקסל 1 בעצמה של 80% במשך 3 שניות (~ 350 x 350 ננומטר אזור ננומטר). צבע FM ייכנס לתא באתר של פציעה. כוח והזמן יכולים להיות מותאם כדי להגדיל או להקטין את האזור של עלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלם תמונות של הסיבים לפני הנזק, בעת הפגיעה, כל הודעה נזק-2 שניות, ולאחר מכן כל 10 שניות עד 5 דקות. תזמון יכול להיות מותאם בהתאם לצורך. ניתן להמיר תמונות בודדות לסרטי זמן לשגות בתמונת ג &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבים3.3 דרך 3.7 על עד 3 סיבים לכל צלחת. </li></ol>

<ol><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+differentiated+state%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the differentiated state.</a> Science. 230, 758-766 (1985).</li>
<li>Yaffe, D., Saxel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+passaging+and+differentiation+of+myogenic+cells+isolated+from+dystrophic+mouse+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle.</a> Nature. 270, 725-727 (1977).</li>
<li>Richler, C., Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+cultivation+and+differentiation+capacities+of+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines.</a> Dev Biol. 23, 1-22 (1970).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skelet muscle. 1, 34(2011).</li>
<li>DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transfection+of+mammalian+skeletal+muscles+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation.</a> J Vis Exp: JoVE. , (2009).</li>
<li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).</li>
<li>Kerr, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+stabilizes+stress-induced+Ca2%2B+signaling+in+the+transverse+tubule+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).</li>
<li>Anderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micropeptide+encoded+by+a+putative+long+noncoding+RNA+regulates+muscle+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance.</a> Cell. 160, 595-606 (2015).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).</li>
<li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca%282%2B%29-regulated+exocytosis+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+blebbing+as+an+assessment+of+functional+rescue+of+dysferlin-deficient+human+myotubes+via+nonsense+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+physiol%22%5BJournal%5D)">Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression.</a> J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).</li>
<li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li>
<li>Marg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcolemmal+repair+is+a+slow+process+and+includes+EHD2%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2.</a> Traffic. 13, 1286-1294 (2012).</li>
<li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li>
<li>Defour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+regulates+cell+membrane+repair+by+facilitating+injury-triggered+acid+sphingomyelinase+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion.</a> Cell Death Dis. 5, e1306(2014).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים.

השימוש בelectroporation ללמוד חלבונים מתויגים fluorescently in vivo הוא אידיאלי לחקר שרירים בהיעדר המודלים שורת התאים המתאימים שנאמנות לשכפל את כל מבנה התא של שריר. פרוטוקול זה מתאר את הניצול של electroporation ומיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה כדי לספק הדמיה מפורטת של לוקליזציה החלבון וטרנסלוקציה לאחר פציעת לייזר. שיטה זו ניתן להתאים ללמוד תהליכים תאיים אחרים, כוללים ארגון מחדש שלד תא, סחר, והיתוך. ...

myofibers בודדת תאים גדולים, מאורגנים מאוד syncytial. ישנם כמה מודלים תא-תרבות לשריר; עם זאת, יש לי דגמים אלה כמגבלה העיקרית שלהם שהם אינם מבחינים באופן מלא בmyofibers הבוגר. לדוגמא, שורות תאי C2C12 וL6 נגזרות מעכברים וחולדות, בהתאמה 1-4. בתנאים של רעב סרום, התאים &quot;כמו היצמדות למנגנון-&quot; מונונוקלארים להפסיק הפצה, לעבור נסיגת מחזור תא, ולהיכנס לתכנית myogenic להרכיב תאי multinucleated עם sarcomeres, מכונה myotubes. עם תנאי תרבות ממושכים, myotubes עשוי להפגין תכונות התכווצות ו&quot; פרפור &quot;בתרבות. גם עכשיו הוקמו שורות תאים אנושיות 5. בנוסף לשורות תאים הונצחו אלה, יכול להיות מבודד myoblasts mononuclear משרירים ובתנאים דומים של רעב הסרום יהווה myotubes. שורות תאים אלה ותרבויות והיצמדות למנגנון עיקריות הן מאוד להשתמשפול כי הם יכולים להיות transfected עם פלסמידים או transduced עם וירוסים ומשמשים ללמוד תהליכים ביולוגיים של תא בסיסי. עם זאת, תאים אלה, גם כאשר נגרמו ליצירת myotubes, חסרים רבים מהמאפיינים הבולטים של ארגון שריר בוגר. באופן ספציפי, myotubes הם הרבה יותר קטן מאשר myofibers הבוגר הבודד וחסר צורה הנורמלית של myofibers. ביקורתי, myotubes חסר הרוחבי tubules (טי), הרשת הקרומית הנדרשת לשחרור Ca 2 + יעיל לאורך myoplasm. שיטה חלופית ולהיצמדות למנגנון ראשונית או שורות תאי myogenic כרוכה באמצעות myofibers הבוגר. Transgenesis יכול להיות מועסק על מנת להקים ביטוי של חלבונים מתויגים, אך שיטה זו היא זמן רב ויקרה. Electroporation vivo של שריר עכבר התפתחה שיטה מועדפת למהירות ואמינות 6-10. שיטות לelectroporation in vivo והבידוד יעיל של חה myofibersיש כבר מותאם לשריר brevis digitorum המכופף עכבר (FDB) 6. ניתן להשלים בקלות השיטות והם פולשנית לגרום בביטוי vivo מפלסמידים. גישה זו בשילוב עם שיטות עכשיו הדמיה ברזולוציה גבוהה הכוללים הדמיה לאחר שיבוש לייזר של 6,7 sarcolemma. השילוב של צבעים וביטוי של חלבונים שכותרתו fluorescently ניאון ניתן להשתמש כדי לפקח על תהליכים ביולוגיים תא בmyofibers הבוגר.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td>דיסקציה מדיה דילול: 50 מ"ל +100 גרם BSA</td></tr><tr><td>קולגנאז, סוג II</td><td>Life Technologies</td><td>17101-015</td><td>עיכול סיבים דילול: 160 מ"ג / 4 מ"ל DMEM (מלאי 40 מ"ג/מ"ל aliquot)</td></tr> <tr><td>פלקון 12 בארות</td><td>כלים פישר סיינטיפיק</td><td>877229</td> תמיסת <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>צלצולי עיכול סיביםדילול עיכול והדמיה של סיבים : 146 מ"מ NaCl 5 mM&nbsp; &nbsp; KCl 2 מ'M&nbsp; &nbsp; CaCl2 1 מ'M&nbsp; &nbsp; MCl2 10 מ"מ HEPES pH7.4 ב-H2O</td></tr><tr><td>1 מ"ל פיפטות</td><td>Axygen</td><td>T-1000-C-R</td><td>סכיני גילוח לעיכול</td></tr><tr><td></td><td>Personna</td><td>94-120-71</td><td>עיכול</td></tr><tr><td>Precision Glide 30 G מחט</td><td>BD Biosciences</td><td>305128</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>1x PBS (-/-)</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Dissection</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-366-794</td> מלקחיים <td>לדיסקציה</td></tr><tr><td></td><td>FST מאת Dumont</td><td>#5/45</td> מלקחיים <td>לדיסקציה</td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-4913</td> מספריים <td>לדיסקציה</td></tr><tr><td></td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>500260</td><td>דיסקציה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>דיסקציה מדיה דילול: 100 מ"ג/50 מ"ל DMEM</td></tr><tr><td>Falcon 60 מ"מ כלים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08772B</td><td>דיסקציה- משמש להחזקת</td></tr> ממריץ <tr><td>אלקטרופורציה</td><td>של חימר</td><td></td><td></td></tr> סילגארד<tr><td>&nbsp;</td><td>דשא</td><td>s88x</td><td>מהדקי אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>רדיו</td><td>שאק</td><td>270-356</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>טריאדין</td><td>אפליקרה</td><td>82-220</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>דיוק גלישה 27 גרם מחט</td><td>BD Biosciences</td><td>305136</td><td>סימולטור אלקטרופורציה</td></tr><tr><td></td><td>דשא</td><td>SIU-V</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>גזה</td><td>Covidien</td><td>2146</td><td>אלקטרופורציה</td></tr><tr><td>דילול Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>הזרקה : הוסף 160 ul PBS (1x) ל-40 ומיקרו; l 5x</td></tr><tr><td>מלאי 1 סמ"ק U-100 מזרק אינסולין (28G1/2)&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>329420</td><td>הזרקת</td></tr><tr><td>צינורות אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-682-550</td><td>הזרקה</td></tr><tr><td>35 מ"מ תחתית זכוכית צלחת</td><td>מיקרווול MaTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Life Technologies</td><td>T-13320</td><td>מיקרוסקופיה דילול: סופי 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Life Technologies</td><td>T-35356</td><td>מיקרוסקופיה דילול: סופי 2.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Endotoxinfree פלסמיד מקסי ערכת</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>טיהור פלסמיד</td></tr></tbody></table>

dna electroporation, בידוד והדמיה של myofibers

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

לשריר בוגר יש מבנה ייחודי הניתן להדמיית תאים חיים. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול הניסיוני לביטוי חלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי בשריר flexor digitorum brevis (FDB). התנאים עברו אופטימיזציה כדי לספק מספר רב של סיבי שריר באיכות גבוהה המבטאים את הפלסמיד האלקטרופוטרי תוך מזעור נזק לשרירים. השיטה משתמשת בתגים פלואורסצנטיים על חלבונים שונים. שילוב שיטת ביטוי זו עם מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של תאים חיים, כולל הדמיה לאחר נזק הנגרם על ידי לייזר. צבעים פלואורסצנטיים בשילוב עם הדמיה של חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים מספקים מידע לגבי המבנה הבסיסי של השריר ותגובתו לגירויים.

Electroporation הוא טכניקה פולשנית שיעילות מציגה פלסמיד דנ&quot;א המטוהר לחבילת שריר (איור 1 א) brevis digitorum המכופף (FDB). שבעה ימים לאחר transfection fluorescently חלבון מתויג היא דמיין בmyofibers המבודד (איור 1). אז סיבים מבודדים הם מצופים ומוכנים להדמיה על מיקרוסקופ confocal. יכולים להיות נתונה לפגיעת סיבי לייזר מושרה. צבע FM יכול לשמש כדי לזהות את האתר של נזק קרום (איור 1 ג) <p class="j...

פרוטוקול זה משתמש באלקטרופורציה כדי להציג ולבטא חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית בסיבי שריר עכברים. לאחר ההתאוששות לאחר אלקטרופורציה, הסיבים מבודדים. לאחר מכן מדמים סיבים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה כדי להמחיש את מבנה השרירים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד סיבי שריר מהשריר כופף אצבעות קצר (flexor digitorum brevis) של עכברים, כדי שניתן יהיה לפגוע לאחר מכן בסרקולמה באמצעות פציעה בלייזר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לחקור את תפקוד החלבונים ואת מיקומם בסיבי שריר בוגרים ללא צורך ביצירת עכברים טרנסגניים. ניתן להתאים שיטה זו לבדיקת סוכנויות פרמצבטיות ושיטות אחרות לפגיעה בתאים.התחילו בהפשרת תמיסת הקולגנאז (collagenase). לאחר מכן, הכינו שתי בארות מפלטת 12 בארות. עבור כל סיב המיועד לבידוד, הוסיפו לבאור אחת מיליליטר של DMEM מחומם מראש עם BSA, ומלאו את הבאור השנייה במיליליטר של תמיסת רינגר (Ringer's) בריכוז 1x מחוממת מראש.הכינו גם צלחת פטרי (cigar dish) בנפח 35 מילימטר עם 10 מיליליטר של תמיסת Ringer's ריכוז 1x טרי. לאחר הסרת הרגליים מהחיה שעברה טרנספקציה, הצמידו רגל אחת למגש הפטרי כך שהסוליה תפנה כלפי מעלה, באמצעות מחטים בכיקל 30 דרך כל אחד מחמש קצות האצבעות. בקרסול, הכינו כל רגל באופן הבא.ראשית, יש לגזור את העור. התחילו מהקרסול וגזרו לאורך קו השיער עד לאצבעות. היזהרו לא לחתוך את השרירים שמתחת לעור.בשלב הבא, אחזו בעור בבסיס הקרסול וגזרו לרוחב העקב. לאחר מכן, הרימו את פתית העור באמצעות פינצטה, כוון את המספריים לעבר העור ולא לעבר השריר, וגזרו בזהירות את רקמת החיבור כדי להסיר את העור. כעת, כדי להסיר את

dna-electroporation-isolation-and-imaging-of-myofibers

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים נהלים מפורטים transfection היעילה של DNA פלסמיד לתוך הסיבים של שרירי כף הרגל של עכברים חיים באמצעות electroporation ואת להדמיה הבאות של ביטוי חלבון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

סרטון זה מדגים את הבידוד של מיופיברים בודדים משריר מורין Extensor Digitorum Longus (EDL) שנקטף. ניתן לגדל את המיופיברים המבודדים בתרבית כדי לחקור את פעילות תאי הגזע הקשורים למיופייבר.

בידוד מיופייבר: טכניקה להשגת מיופייבר יחיד משריר Extensor Digitorum Longus (EDL) של עכבר שנקצר

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

דג הזברה הוא מערכת המתעוררות לדוגמנות הפרעות אנושיות של שרירי השלד. אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לבודד myofibers שרירי שלד מדג זברה עוברית וזחל. שיטה זו מניבה הכנת צפיפות גבוהה myofiber מתאימה למחקר של מורפולוגיה סיבי שריר שלד בודדת, לוקליזציה subcellular חלבון, ופיזיולוגיה של שרירים.

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

אנו מתארים טכניקה ניסיוני הרומן נקרא מינימלית פולשנית שריר הטבעת (MIME), אשר מבוססת על ראיות כי רקמת שריר השלד מכיל תאים myogenic קיימא יכול להקל על התורם-תאית myogenesis כאשר מושתל לתוך שריר המארח.

שריר פולשנית הטבעה (MIME) - טכניקה ניסיוני הרומן כדי להקל על Myogenesis התורם-תאית

בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

מוצג כאן פרוטוקול כדי להעריך את המאפיינים ההתכווצות של שרירים מחוסנים myofibrils עם רזולוציית ננו ניוטון. הפרוטוקול משתמש בהתקנה עם גשוש כוח אופטי מבוסס אינטרפרומטריה. הגדרה זו יוצרת נתונים עם יחס אות לרעש גבוה ומאפשרת הערכה של קינטיקה מתכוובת של myofibrils.

בידוד מיו-בריאלס מבריות מביופסיות שריר השלד וקביעת תפקוד מתכווץ עם מתמר כוח רזולוציה ננו-ניוטון

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

אנו מתארים פרוטוקול לקבלת סיבים מנותקים אנזימטית באורכים וסוגים שונים משישה שרירים של עכברים בוגרים: שלושה מהם כבר תוארו (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) ושלושה מהם נותקו בהצלחה בפעם הראשונה (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

סיבי שריר שלד שלמים קצרים, בינוניים וארוכים המתקבלים על ידי דיסוציאציה אנזימטית של שישה שרירי גפיים אחוריות של עכברים: Beyond Flexor Digitorum Brevis

פרוטוקול זה מתאר את בידוד סיבי שריר יחיד שלמים מהסולאוס החמצוני ואת הקמת תרביות מיובלסט מטוהרות מאוד שמקורן בסיבים אלו. ההליך האופטימלי מניב באופן אמין כ-300–500 סיבי מיו שלמים לכל עכבר, ומאפשר ניתוחים מולקולריים ותאים במורד הזרם.

מבחן בידוד סיב יחיד להערכת התנהגות סיבי מיו חמצונית

למד את שיטת האלקטרופורציה להכנסת חלבונים פלואורסצנטיים לסיבי שריר עכברים. שיטה זו מאפשרת חקר לוקליזציה ותפקוד חלבונים בסיבים בוגרים מבלי ליצור עכברים טרנסגניים.

DNA Electroporation, בידוד והדמיה של Myofibers

גלה סרטונים נוספים