Name: יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: חקור מחיקות מונואלליות מבוססות CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים של עכבר ללימוד תפקוד אנאנסרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספציפי של רגולציה אללית ותרומה לגנומיקה תפקודית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לכל חברי מעבדת מיטשל על הדיונים המועילים. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, הקרן הקנדית לחדשנות ומשרד המחקר והחדשנות של אונטריו (מענקי תפעול ותשתיות המוחזקים על ידי JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
<li>Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+erythroid-specific%2C+developmental-stage-independent+enhancer+far+upstream+of+the+human+%27beta-like+globin%27+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).</li>
<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
<li>Mlynarczyk-Evans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosomes+alternate+between+two+states+prior+to+random+X-inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation.</a> PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).</li>
<li>Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+polymorphisms+and+other+mismatches+reduce+performance+of+quantitative+PCR+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays.</a> Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).</li>
<li>Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+base+mispairs+by+Taq+DNA+polymerase%3A+implications+for+single+nucleotide+discrimination+in+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR.</a> Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).</li>
<li>Keane, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+genomic+variation+and+its+effect+on+phenotypes+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation.</a> Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).</li>
<li>Yalcin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-based+characterization+of+structural+variation+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome.</a> Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

המחברים קראו מדיניות של יופיטר על ניגוד העניינים ואין להם קונפליקטים לחשוף.

עריכת טכנולוגיה הגנום בתיווך CRISPR / Cas9 מספק שיטה פשוטה, מהירה וזולה עבור שינוי הגנום. השיטה המפורטת כאן כדי ליצור ולנתח מחיקה משפר monoallelic לאפיון משפר תפקודי מנצלת SNPs בתאי עכבר F1. היתרונות של סוג זה של גישה הם: 1) מחיקות משפרים monoallelic אינן מייצרות תופעות בלבול המתרחשות כאשר משפר קריטי נמחק אללים שניהם, כלומר, הפחתה גדולה רמות החלבון של הגן המוסדר המוביל לתא קטלני או שינה פנוטיפ; 2) האם התדירות של מחיקת monoallelic נמוכה קבלת מחיקה הומוזיגוטים היא פחות סביר...

גורמי רגולטוריים תעתיק הם קריטיים עבור כוונון במרחב ובזמן קנס של ביטוי גנים במהלך התפתחות 1 ושינוי של אלמנטים אלו יכולים לגרום למחלות בשל ביטוי 2 גנים סוטים. אזורים רבים הקשורים מחלה שזוהו על ידי מחקרי עמותה רחבים הגנום נמצאים באזורים ללא קידוד ויש להם תכונות של משפרי תעתיק 3-4. זיהוי משפר והתאמתי עם הגנים שהם מווסתים מסובכים כפי שהם בדרך כלל ממוקמים כמה kilobases מן הגנים שהם מווסתים ועשויים להיות מופעלים באופן רקמות ספציפיות 5-6. תחזיות Enhancer מבוססים בדרך כלל על סימני שינוי היסטון, מתחמי-cohesin מתווך ומחייבת של שעתוק סוג תא ספציפי גורמי 7-10. אימות של משפר חזוי לרוב נעשתה באמצעות assay וקטוריות שבו משפרים מפעיל ביטוי של גן כתב 11-12. נתונים אלה מספקים נמידע aluable מהפוטנציאל רגולטוריות של רצפים משפרים משוערים אבל לא חושף את תפקידם בהקשר הגנומי אנדוגני שלהם או לזהות את הגנים שהם מווסתים. הגנום עריכה משמש ככלי רב עוצמה כדי לחקור את הפונקציה של גורמים רגולטוריים תעתיק בהקשר אנדוגני שלהם על ידי ניתוח הפסד של פונקציה. התקדמות עריכת הגנום, כלומר מערכת עריכת הגנום CRISPR / Cas9, לסייע בחקירת פונקציה הגנום. מערכת CRISPR / Cas9 קלה לשימוש להתאמה למערכות ביולוגיות רבות. החלבון Cas9 הוא ממוקד לאתר מסוים בגנום ידי RNA מדריך (gRNA) 13. המתחם SpCas9 / gRNA סורק את הגנום רצף גנומי היעד שלה אשר חייב להיות 5 &#39;כדי מוטיב הסמוך protospacer (PAM) רצף, NGG 14-15. זיווג מאגר של gRNA למטרתה, 20 נוקלאוטידים (NT) רצף משלים gRNA, יפעיל פעילות nuclease SpCas9 וכתוצאה מכך doublדואר גדיל Break (DSB) 3 נ&quot;ב במעלה הזרם של רצף PAM. סגולי מושג באמצעות זיווג בסיס שלם באזור הזרע gRNA, 6-12 nt סמוך PAM; לעומת זאת, חוסר התאמה 5 &#39;של הזרע בדרך כלל נסבלים 16-17. הציג DSB ניתן לתיקון או עד הסוף שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ) תיקון דנ&quot;א או תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) תיקון דנ&quot;א mechanisms.NHEJ יוצר לעתים קרובות כניסה / מחיקה (indels) של כמה נ&quot;ב באתר היעד שיכול לשבש מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של גן. כדי ליצור מחיקות גדולות בגנום שני gRNAs, אשר לאגף את האזור של עניין, ניתן להשתמש 18-19. גישה זו שימושית במיוחד עבור המחקר של משפרי תעתיק התקבצו לאזורים מלאי לוקוס או-משפרי סופר אשר שגודלם עולים על משפר קונבנציונלי 9,18,20-22. מחיקות Monoallelic הם מודל ערך ללימוד -regulation cis של שעתוק. הנצפה צ&#39;אנגדואר ברמת תמליל לאחר מחיקת monoallelic של משפר וקושר לתפקיד משפר כי ויסות גנים ללא תופעות הבלבול שעלול להתרחש כאשר שעתוק של שני אללים מושפע ההשפיע כושר הסלולר פוטנציאלי. הערכת ביטוי מופחת קשה אולם ללא היכולת להבחין בין נמחק מן אלל הסוג הבר. יתר על כן, genotyping מחיקות בכל אלל ללא היכולת להבחין בין שני אללים הוא מאתגר, במיוחד עבור מחיקות גדולות של&gt; 10 kb עד 1 Mb 23 שבו קשה להגביר את האזור סוג בר כולו על ידי PCR. השימוש בתאי גזע עובריים F1 שנוצר על ידי מעבר Mus musculus 129 עם Mus castaneus מאפשר שני אללים כדי להיות מובחן על ידי אלל ספציפי PCR 18,24. הגנום ההיברידי בתאים אלו, מסייע הקרנה מחיקה ספציפית אלל וניתוח ביטוי. בממוצע יש SNP כל נ&quot;ב 125 בין שני אלה הגנוםמתן, גמישות בעיצוב פריימר לביטוי גנוטיפ מנתח. הנוכחות של SNP אחד יכול להשפיע על טמפרטורת ההתכה פריימר (מ T), ולמקד סגוליות PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) הגברה המאפשר אפליה של שני אללים 25. יתר על כן חוסר התאמה בתוך הסוף &#39;3 ​​של פריימר משפיעה מאוד על היכולת של DNA פולימרז להאריך מן פריימר למנוע הגברה של יעד אלל הרצוי 26. כמתואר בפרוטוקול הבא הוא השימוש בתאי גזע עוברי F1 עבור מחיקות משפרות ספציפית אלל של יותר מ 1 kb וניתוח ביטוי שלאחר מכן באמצעות מערכת עריכת הגנום CRISPR / Cas9 (איור 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> איור 1. מחיקת Enhancer באמצעות CRISPR / Cas9 ללמוד ציס -regulation של ביטוי גנים. (א) בתאי גזע עובריים F1 שנוצר על ידי הכלאה בין Mus musculus 129 Mus castaneus משמשים כדי לאפשר למחיקה ספציפית אלל. (ב) שני RNAs המדריך (gRNA) משמש כדי לעורר מחיקת Cas9 בתיווך גדולה של האזור משפר. (ג) קובע פריימר ומשמשים לזיהוי מונו גדול ומחיקות דו-אללים. פריימרים הכתומים הם פריימרים בפנים, פריימרים הסגול הם פריימרים מחוץ ואת פריימרים הירוקים הם פריימרים איגוף gRNA. (ד) שינויים בביטוי הגנים מנוטרים באמצעות qPCR אלל ספציפי. RFU מציין יחידות קרינה יחסיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>פולימראז DNA בנאמנות גבוהה של Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td> DNA <td>פולימראז בנאמנות גבוהה המשמש בהרכבת gRNA</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L gRNA_Cloning</td><td></td></tr><tr><td>Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td>רצף יעד משובט לתוך וקטור זה כדי ליצור את הפלסמיד gRNA</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 ו-EGFP מותאם לקודון פלסמיד ביטוי משותף</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>מערכת טרנספקציה ניאון 100 ומיקרו; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Microporator Transfection Technology</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>מגיב מיצוי DNA גנומי</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & PCR ניקוי</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני פלסמיד במהירות גבוהה</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi פלסמיד ערכת אנדוטוקסין חינם&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR בחר תערובת עבור CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>qPCR ריאגנט</td></tr><tr><td>iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>מגיב שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין עם EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V (7.5%)</td> <td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>יעילות מקסימלית DH5 &alpha; תאים מוכשרים</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>תא ES מוסמך</td><td></td><td>FBS נתון לבדיקות קודמות בתאי ES של עכברים לפלוריפוטנטיות</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>לא חיוני חומצה אמינו-חומצה</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>סרט איטום</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>LX Biocision</td><td>BCS-405</td><td>מיכל הקפאת תאים ללא אלכוהול</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>מעכב לתרבית תאי F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td> מעכב <td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>לתרבית תאי F1 ES</td></tr><tr>מעכב<td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>לתרבית תאי F1 ES</td></tr></tbody></table>

יצירת crispr / cas9 מתווכת monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

משפרים שולטים בזהות התא על ידי ויסות ביטוי גנים ספציפיים לרקמה באופן בלתי תלוי במיקום ובאוריינטציה. משפרים אלה ממוקמים לעתים קרובות רחוק מהגן המווסת באזורים בין-גניים או אפילו בתוך גופו של גן אחר. האופי הבלתי תלוי במיקום של פעילות המשפר מקשה על התאמת משפרים לגנים שהם מווסתים. מחיקת אזור משפר מספקת ראיות ישירות לפעילות משפר והיא תקן הזהב לחשיפת תפקידו של משפר בשעתוק גנים אנדוגני. שיטות מחיקה קונבנציונליות המבוססות על רקומבינציה הומולוגית עלו על ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית עריכת הגנום המאפשרות שינויים מהירים ומדויקים בגנום של אורגניזמים מודלים רבים. ניתן להשתמש בעריכת גנום בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לתפעל את הגנום בסוגי תאים ואורגניזמים רבים במהירות ובחסכון, בשל הקלות שבה ניתן למקד את Cas9 לגנום על ידי RNA מנחה מפלסמיד ביטוי מותאם אישית. מחיקה הומוזיגוטית של אלמנטים חיוניים לוויסות גנים עלולה להוביל לקטלניות או לשנות את הפנוטיפ התאי, בעוד שמחיקה מונואללית של משפרי שעתוק מאפשרת לחקור את ויסות סיס של ביטוי גנים ללא נושא מבלבל זה. מוצג כאן פרוטוקול למחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עוברי (ES) של עכבר F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). מחיקה, סינון וניתוח ביטוי מונואלליים מתאפשרים על ידי פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNP) בין שני האללים המתרחשים בממוצע כל 125 bp בתאים אלה.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתאי F1 ES ללמוד -regulation cis של ביטוי גנים בתאים נמחקו משפרים monoallelic שנוצרו באמצעות CRISPR / עריכת הגנום Cas9 (איור 1). GRNA ועיצוב פריימר ספציפי אלל עבור genotyping ביטוי גנים הם גורמי המפתח בגישה זו. כל קבוצת פריימר אלל ספציפי חייבת להיות מאומתת על ידי qPCR כדי לאשר סגולי אלל. פריימרים אלל ספציפי כי להגביר רק יעד הדנ&quot;א הגנומי שלהם הם אידיאליים (איור 2). באופן אידי...

אימות ניסיוני של פעילות משפר ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח אובדן תפקוד. מוצג כאן פרוטוקול יעיל המשתמש במחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לחקור ויסות ספציפי לאלל של שעתוק גנים בתאי F1 ES המכילים גנום היברידי (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במחיקה המתווכת על ידי CRISPR/Cas9 ספציפית לאלל כדי לחקור את הבקרה על שעתוק גנים בתאי גזע עובריים של עכבר. היתרון המרכזי של טכניקה זו, המשתמשת בגנום היברידי ליצירת מחיקות מונו-אלליות ולניתוחן, הוא שהיא מבטלת את הצורך לנתח מחיקות מונו-אלליות מוגברות שעשויות שלא להיות חיוניות.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית. לדוגמה, איזה גן מוסדר על ידי מחזק (enhancer) ספציפי, ועד כמה הגן תלוי במחזק בודד לצורך פעילותו. מכיוון ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פלוריפוטנציה של תאי גזע, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות.לדוגמה, הדבר יכול לסייע לנו להבין כיצד תאי גזע משנים את גורלם כדי להפוך לנוירונים, לתאי דם או לשריר. לאחר תכנון, בנייה ואישור של רצף ה-guide RNA, או gRNA, המיועד לשימוש, יש להכין להחדרה (טרנספקציה) של הפלסמידים נטולי האנדוטוקסינים לתאי ES. בעזרת צנטריפוגה, יש להשקיע 1×10⁶ תאי גזע עובריים מסוג F1, שהופקו מהכלאה של Mus musculus 129 עם Mus castaneus, בתוך מבחנה של 1.5 מליליטר ב-300 ×g למשך חמש דקות.לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העל-נוזל (supernatant) והוסיפו 100 microliters של תמיסת השחרור (resuspension buffer) המסופקת על ידי יצרן הערכה. למחיקת אזור ה-DNA המטרה, הוסיפו חמישה micrograms מכל אחד מהפלסמידים P Cas9 GFP 5-prime

generating-crisprcas9-mediated-monoallelic-deletions-to-study

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי לתכנן ולבצע מיקוד מרובבת של משפרי עם החלבון פיוז'ן deactivating SID4X-dCas9-קראב, המכונה גם משפר הפרעה (משפר-i). פרוטוקול זה מאפשר זיהוי משפרי המווסתים ביטוי גנים ואסטמה ומקילה על ניתוח היחסים בין משפרי ויסות גנים מטרה משותפת.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

שיטה זו נועדה לעקוב אחר היווצרות תחומים PRC2-בתיווך כרומטין בקווי התא, ואת השיטה ניתן להתאים מערכות רבות אחרות.

שיטה ללמוד דה נובו היווצרות של כרומטין דומיינים

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

כאן, אנו מציגים שיטה ששונתה עבור הקפאת הזמנות של עוברי תא אחד, כמו גם פרוטוקול כי זוגות השימוש של עוברים הקפאת להקפיא ואלקטרופורציה עבור הדור היעיל של עכברים מהונדסים גנטית.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח מודלים של עכברים מהונדסים גנטית באמצעות תאי גזע עובריים, במיוחד עבור דנ"א גדול (KI). פרוטוקול זה מכוונן באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9, וכתוצאה מכך יעילות KI משופרת באופן משמעותי בהשוואה לשיטת מיקוד הדנ"א הליניארי ההומולוגית הקונבנציונלית בתיווך רקומבינציה.

מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

מאמר זה מדווח על בניית תאי נוקאאוט הקשורים לצנטרומר לחלבון-E (CENP-E) באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ושלוש אסטרטגיות סינון מבוססות פנוטיפ. השתמשנו בקו תאי הנוקאאוט של CENP-E כדי לבסס גישה חדשנית לאימות הספציפיות והרעילות של מעכבי CENP-E, שהיא שימושית לפיתוח תרופות ולמחקר ביולוגי.

יצירת Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines באמצעות מערכת CRISPR/Cas9

השיטה המוצגת מתארת את יצירתו של נוקאאוט גנטי בתיווך קריספר בקו תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) H9, המבטא ביציבות sgRNA המכוון לגן L2HGDH באמצעות מערכת העברת גנים בתיווך לנטיויראלי יעילה ביותר.

CRISPR-Cas9 תיווך מחיקת גנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים שגודלו בתרבית בתנאים נטולי הזנה

חקור מחיקות מונואלליות מבוססות CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים של עכבר ללימוד תפקוד אנאנסרים. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספציפי של רגולציה אללית ותרומה לגנומיקה תפקודית.

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

גלה סרטונים נוספים