יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במחיקה המתווכת על ידי CRISPR/Cas9 ספציפית לאלל כדי לחקור את הבקרה על שעתוק גנים בתאי גזע עובריים של עכבר. היתרון המרכזי של טכניקה זו, המשתמשת בגנום היברידי ליצירת מחיקות מונו-אלליות ולניתוחן, הוא שהיא מבטלת את הצורך לנתח מחיקות מונו-אלליות מוגברות שעשויות שלא להיות חיוניות.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הגנומיקה הפונקציונלית. לדוגמה, איזה גן מוסדר על ידי מחזק (enhancer) ספציפי, ועד כמה הגן תלוי במחזק בודד לצורך פעילותו. מכיוון ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פלוריפוטנציה של תאי גזע, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות.

לדוגמה, הדבר יכול לסייע לנו להבין כיצד תאי גזע משנים את גורלם כדי להפוך לנוירונים, לתאי דם או לשריר. לאחר תכנון, בנייה ואישור של רצף ה-guide RNA, או gRNA, המיועד לשימוש, יש להכין להחדרה (טרנספקציה) של הפלסמידים נטולי האנדוטוקסינים לתאי ES. בעזרת צנטריפוגה, יש להשקיע 1×10⁶ תאי גזע עובריים מסוג F1, שהופקו מהכלאה של Mus musculus 129 עם Mus castaneus, בתוך מבחנה של 1.5 מליליטר ב-300 ×g למשך חמש דקות.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העל-נוזל (supernatant) והוסיפו 100 microliters של תמיסת השחרור (resuspension buffer) המסופקת על ידי יצרן הערכה. למחיקת אזור ה-DNA המטרה, הוסיפו חמישה micrograms מכל אחד מהפלסמידים P Cas9 GFP 5-prime ו-3-prime gRNA. ערבבו בעדינות באמצעות פיפטה.

הימנעו מהחדרת בועות אוויר. לאחר מכן, השתמשו בטיפ הפיפטה האלקטרוני של המיקרופורטור כדי לשאוב 100 µL מתערובת האלקטרופורציה, תוך הקפדה להימנע מהחדרת אוויר לטיפ. לאחר מכן, חברו את הפיפטה למכשיר הטרנספקציה.

בחר את הפרוטוקול המתאים ולחץ על start. בזמן שהאלקטרופורציה פועלת, עקוב אחר הקצה. בהגדרה נכונה, בועות זעירות אמורות להופיע מאלקטרודת המבחנה.

ניצוץ מעיד על נוכחות של בועת אוויר ויפריע לתהליך הטרנספקציה. אם הדבר קורה, יש לחזור על האלקטרופורציה עם סדרת תאים חדשה. לאחר האלקטרופורציה, העבירו את התאים שעברו טרנספקציה לצלחית בעלת ציפוי ג'לטין של עשרה סנטימטרים המכילה עשרה מיליליטר של מצע גידול לתאי ES.

דגרו את התאים שעברו טרנספקציה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר 48 שעות, השתמשו בציטומטר זרימה (flow cytometer) כדי למיין ולהבדיל את תאי ה-ES החיוביים ל-GFP. לאחר מכן, זרעו 1 עד 1.5 times 10⁴ תאים חיוביים ל-GFP בצלחת בקוטר 10 סנטימטרים מצופה ג'לטין, המכילה 10 milliliters של מצע גידול לתאי ES.

זריעה בצפיפות נמוכה זו תקל על איסוף מושבות בודדות של תאי ES. לאחר ארבעה עד חמישה ימים, השתמשו במיקרוסקופ כדי לזהות מושבות בודדות של תאי ES בצורת כדור. באמצעות פיפט, העבירו כל מושבה לבאר אחת בלוח 96-בארים שטופל מראש בג'לטין ומכיל 30 µL של tripsom.

לאחר שכל המושבות נבחרה והופרדו לתוך מדיום, גדלו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור פחמן דו-חמצני עד שרוב הבארות יגיעו לרמת התמזגות של מעל 70%confluent. תהליך זה אורך בדרך כלל כיומיים. כאשר התאים מוכנים לפיצול, הסירו את המדיום והוסיפו 30 microliters של tripsom.

דגרו את התאים למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו לכל באר 180 µL של מצע גידול לתאי ES כדי לנטרל את ה-trypsin. בצעו פיפטור מעלה ומטה כדי להשיג סספנסיה של תאים בודדים.

מכל באער, העבר 70 µL לכל אחת משלוש פלטות של 96 באערים מצופות ג'לטין, המכילות 130 µL של מצע גידול לתאי ES בכל באער. דגרי ב-37 °C. כאשר הפלטות יגיעו ל-70 עד 85% התלכדות (confluency), השתמש בהן לביצוע גנוטיפיקה ואנליזת ביטוי של כל שיבט, כפי שמתואר בסעיפים הבאים.

הקפיאו את מאגרי התאים כפי שמתואר במסמך המצורף. בשלב זה, יעוצבו ארבעה סטים של פריימרים כדי לסנן את הכלונים עבור המחיקה הרצויה. אלו כוללים: פריימרים פנימיים, פריימרים חיצוניים, ופריימרים חופפים ל-gRNA עבור אתרי המטרה של ה-gRNA הן ב-5-prime והן ב-3-prime.

התחילו בביקור באתר המודגש כאן כדי להשיג את עקבת הפולימורפיזם של נוקלאיד בודד (single nucleotide polymorphism) או ה-snip המתאימה לגנוטיפים 129 ו-Cas. קישור זה מוביל לדף ה-CRISPR של מעבדת Mitchell. שם, לחצו על הקישור המצוין.

האתר יעביר אתכם לדפדפן הגנום של UCSC המכיל את הערוץ המציג SNPs בין הגנומים 129 ו-Cas בהרכבת גנום העכבר MM-9. לאחר מכן, הזינו את קואורדינטות האזור המיועד למחיקה ולחצו על "go". בצעו זום-אין על אזור של כ-500 base pairs במרכז המחיקה הרצויה, המכיל יותר משלושה SNPs.

עיצוב פריימרים ספציפיים לאלל עשוי להיות מורכב אם ה-snips נדירים. אם לא ניתן לעצב פריימרים ספציפיים לאלל באופן מוחלט, ניתן להשתמש בפריימרים בעלי ספציפיות חלקית לאלל. זכרו רק להשוות את ערכי ה-CT בין השיבטונים עם המחיקה לאלו ללא המחיקה במהלך ניתוח תוצאות ה-qPCR.

כעת, לחצו על "View" בפאנל העליון. מהתפריט הנפתח, בחרו ב-DNA. דף ה-"Get DNA in Window" יופיע.

באפשרויות עיצוב הרצף, בחרו באותיות גדולות (all uppercase), ולאחר מכן לחצו על Get DNA כדי להציג את רצף המטרה בפורמט של אותיות גדולות. העתיקו רצף זה והדביקו אותו בקובץ מסמך Word. לאחר מכן, השוו את הרצף למסלול ה-129 cast snip, סמנו את מיקומי ה-snip ואת ה-129 snips באמצעות אותיות קטנות.

לאחר סיום עבודה עם הרצף 129, העתיקו אותו כדי ליצור שני רצפים בפורמט fast day. אחד עבור 129 ואחד עבור Cas. ברצף Cas, החליפו את הבסיס הנכון בכל מיקום snip, וסמנו את ה-snip באות קטנה.

בשלב הבא, סמנו את הרצף עם הגנום התואם לו, 129 או Cas. לאחר מכן, הקלידו בדפדפן את הכתובת של Primer3Plus. באזור המתאים, הדביקו את רצף 129 עם ההחלפה של ה-snip.

השתמש בהגדרות ברירת המחדל כדי לתכנן את הפריימרים. כדי לתכנן את הפריימרים הספציפיים לאלל הפנימי, לחץ על התפריט הנפתח מימין ל-Task ובחר ב-Primer List, ולאחר מכן לחץ על Pick Primers. דף חדש ייפתח ויציג רשימה של פריימרים קדמיים (forward) ואחוריים (reverse).

סמנו את תיבת הבחירה כדי לבחור פריימר קדימה (forward) או אחורה (reverse) שבו מסומן snip באות קטנה, בין אם בקצה ה-3-prime ובין אם בתוך ארבעה בסיסים מקצה ה-3-prime. שימו לב כי פריימרים בעלי snip בקצה ה-3-prime מראים ספציפיות אללית מוגברת במהלך qPCR. לחצו על "Send to Primer3 Manager" בתחתית המסך.

ייפתח דף חדש המציג את הפריימר שנבחר. כדי לבחור את הפריימר השני, חזור לדף רשימת הפריימרים, ולחץ על כפתור החזרה כדי לשוב לדף הראשי. בתפריט הנפתח של המשימות, בחר Detection.

הדף הראשי יתרענן ותיבות עבור רצפי הפריימר השמאלי והימני יופיעו בתחתית. הדביקו את רצף הפריימר הראשון בתיבה המתאימה. לאחר מכן, עברו ללשונית General Settings הממוקמת לצד לשונית Main ושנו את ההגדרה עבור טווח גודל המוצר ל-80 עד 200 base pairs.

לחצו על "Pick Primers". ייפתח דף המציג חמישה זוגות פריימרים אפשריים עבור רצף הפריימר הראשון. בחרו סט פריימרים מרשימת זוגות הפריימרים על ידי סימון התיבות משמאל לפריימרים ולחצו על "Send to Primer3 Manager" בתחתית המסך. אלו יהיו הפריימרים הפנימיים הספציפיים לאלל 129.

חזרו על שלבים אלו כדי לתכנן פריימרים עבור האלל cast. לאחר מכן, יישמו טכניקה זו לתכנון פריימרים חיצוניים ספציפיים לאלל ופריימרים שאינם ספציפיים לאלל. לבסוף, בדקו את הספציפיות של הפריימרים לאלל באמצעות qPCR כפי שמתואר במסמך המצורף.

הפיקו את ה-genomic DNA מלוחית 96 הבארות שהוכנה קודם לכן. סובבו את הלוחית בצנטריפוגה לזמן קצר כדי להוריד את העיבוי לתחתית הבאר. DNA זה ישמש כתבנית לסריקת מחיקות (deletion screening).

בשלב הבא, בצעו qPCR במישור בעל 384 בארות, ובצעו כפילות עבור כל שיבט. השתמשו ב-PCR דו-שלבי ולאחריו בניתוח עקומת המסה עם זיהוי. לאחר ההרצה, בדקו תחילה כל אלל לאמפליקציה באמצעות הפריימרים הספציפיים לאלל הפנימיים.

העדר הגברה של אלל אחד או הבדלים בערך ה-CT של יותר מחמישה מחזורים בין האללים, מעידים על כך ששבטים אלו נושאים מחיקה (deletion) הטרוזיגוטית. העדר הגברה של שני האללים מעיד על כך שהם נושאים מחיקה הומוזיגוטית. לאחר מכן, בדוק את ההגברה של כל אלל באמצעות הפריימרים הספציפיים לאלל החיצוני.

אם מחיקת המטרה גדולה מ-1 KB, הגברה באמצעות פריימרים חיצוניים תתרחש רק אם קיימת מחיקה. ערך CT של 22 עד 28 מאשר את המחיקה. עבור מחיקות מטרה קטנות מ-1 KB, יש לאשש את גודל האמפליקון באמצעות אלקטרופורזה.

לוח בעל 96 בארות של שיבוטים עם מחיקה נסרק באמצעות qPCR תוך שימוש בפריימרים פנימיים ספציפיים לאלל. פסים אפורים מייצגים הגברה מפריימרים ספציפיים ל-Cas ופסים שחורים מייצגים הגברה מפריימרים ספציפיים ל-129. ערך CT נמוך או היעדר הגברה עם הפריימרים הפנימיים מעידים על מחיקת המטרה.

לאחר מכן מסננים את השיבוטים בעלי מחיקה באלל אחד או בשניהם באמצעות פריימרים חיצוניים. הגברה באמצעות פריימרים חיצוניים מאשרת את קיום המחיקה. שיבוטים בעלי מחיקה מונו-אללית מסוננים באמצעות פריימרים החובקים את אזורי המטרה של ה-gRNA, כדי לוודא היעדר הכנסות או מחיקות, המכונות indels, באלל שאינו מחוק.

רק שיבוטים מונו-אלליים ללא מחיקות או הוספות (indels) גדולות באתרים המיועדים באליל שאינו מחוק משמשים בניתוח הביטוי העוקב. מוצגים כאן תוצאות מייצגות משיבוטים שבהם נמחקו 129 או Cas SCR. ה-SCR הוא מחזק (enhancer) ספציפי ל-Sox2 שתואר לאחרונה בתאי ES.

סרגים אדומים מייצגים ביטוי של אלל ה-Sox2 Cas, וסרגים כחולים מייצגים הגברה של אלל ה-Sox2 129. כפי שניתן לראות בדמות זו, מחיקה של ה-SCR באלל ה-129 או ה-Cas הפחיתה את הביטוי של Sox2 ב-CIS. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן ליצור מחיקה גדולה באמצעות טכנולוגיית CRISPR ולהשתמש בפריימרים ספציפיים לאלל כדי לבצע גנוטיפינג לכלונים שנמחקו.