אסטרטגיה רומן המשלב מערך-CGH, רצף שלם-exome and בתוך הרחם אלקטרופורציה בחולדות לזיהוי גנים סיבתי של מומים המוח
1 בדצמבר 2017
Periventricular קשרי הטרוטופיה (PNH) היא הצורה הנפוצה ביותר של מום ההתפתחות בקליפת המוח (MCD) בבגרות אבל את הבסיס הגנטי שלה אינו ידוע במקרים ספורדיים ביותר. לאחרונה פיתחנו אסטרטגיה לזיהוי גנים מועמדים חדשניים עבור MCDs וכדי לאשר ישירות שלהם תפקיד סיבתי בתוך vivo.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות גנים מועמדים חדשים להפרעות של מומים במוח, ולאשר באופן ישיר את תפקידם הגורם in-vivo. אסטרטגיה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה על ידי גילוי נתיבים מולקולריים הקשורים להתפתחות המוח ולפתולוגיות תואמות. היתרון המרכזי של אסטרטגיה זו הוא שהיא תסייע בגילוי גנים חדשים הקשורים להפרעות מוחיות ובפיתוח כלים אבחנתיים חדשים.
באמצעות גישה זו יכולנו לחשוף את התרומה המכריעה של הגן C6orf70 לפתוגנזה של הטרטופיה נודולרית פריוונטריקולרית (periventricular nodular heterotopia), מום מוחי הנגרם כתוצאה מנדידה עצבית לא תקינה. את הפרוצדורה תדגים פביאן שאלר (Fabienne Schaller), מהנדסת מהמעבדה שלנו. הכינו חולדה בהריון ביום E15 לפרוצדורה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב ובהתאם להנחיות המוסדיות והלאומיות.
יש לוודא שהבעל חיים נמצא תחת הרדמה נאותה, שמרחם עינית הוחל על העיניים, ושהבטן נגלחה וחומשה כראוי. לאחר ביצוע חתך אנכי של שני סנטימטרים בעור ובשריר של קו האמצע בבטן הזנבית באמצעות מספריים חדים, חשוף בזהירות קרן רחם אחת מחלל הבטן. טפטף תמיסת סלין נורמלית שחוממה מראש ל-37 degree Celsius כדי להרטיב את העוברים.
יש לשמור על הרחם לח במהלך הפרוצדורה. להזרקת DNA, החזיקו בעדינות עובר ביד אחת כך שהראש יהיה נגיש בקלות. לאחר מכן, באמצעות היד השנייה, הכניסו בזהירות קפילרית זכוכית המחוברת למיקרו-מזרק לתוך ventricle לטרלי שמאלי, הממוקם במרחק של מילימטר אחד מקו האמצע ובעומק של שניים עד שלושה מילימטרים.
השתמשו במיקרו-מזרק כדי להזריק כ-1 µL של DNA עם fast green כדי לאפשר ניטור חזותי של ההזרקה. כדי לבצע אלקטרופורציה של ה-DNA אל תוך התאים, טפטפו תחילה תמיסת סליין נורמלית על פני האלקטרודה בגודל 3 על 7 מילימטרים. לאחר מכן, מקמו את האלקטרודה החיובית בצד שבו בוצעה ההזרקה ואת האלקטרודה השלילית בחדר ימני שלא הוזרק.
השתמשו בדוושת הרגל כדי להנחית חמישה פולסים חשמליים במרווחים של 950 millisecond. לאחר האלקטרופורציה, החזירו את קרן הרחם לחלל הבטן והוסיפו סליין סטרילי כדי לאפשר לעוברים להתמקם בצורה טבעית יותר וכדי לפצות על אובדן נוזלים במהלך הניתוח. סגרו את דופן השריר באמצעות תפריים כירורגיים ספיגים, ולאחר מכן את העור באמצעות תפרים בודדים (simple interrupted stitch).
ספקו אלגזיה פוסט-אופרטיבית למשך עד 48 שעות או כפי שמומלץ בהנחיות המוסדיות. החזירו את החולדה לכלוב המגורים הנקי שלה ועקבו אחריה עד להתעוררותה מההרדמה. לאחר קיבוע המוחות ב-4%paraformaldehyde כפי שפורט בחלק הכתוב של הפרוטוקול, שטפו ב-PBS למשך 10 דקות.
במהלך השטיפה, הכין 50 milliliters של 4% agar ב-PBS תוך וידוא שטמפרטורת האגרוז המומס אינה עולה על 50 degrees Celsius. צקת את האגרוז לתבניות הטמעה מפלסטיק ולאחר מכן הנח את המוחות בתוך האגרוז. מקם את המוחות המוטמעים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius והמת עד שהאגרוז יפולימריז למשך שעה אחת לפחות.
לאחר שהאגרוז פולימריז, יש לגזור את עודפי האגרוז מסביב למוח, ולאחר מכן להדביק את המוח לפלטת הבסיס של הוויברטום (vibratome), כך שהגישה הקדמית-אחורית של המוח תהיה ניצבת ללהב. לאחר המתנה של מספר דקות לייבוש הדבק, יש להניח את הפלטה עם המוח המודבק לתוך תא הוויברטום. מלא את הוויברטום ב-PBS והתחל בחיתוך של פלחים בעובי 100 micron.
לאחר החיתוך, העבירו את הפרוסות לזכוכיות מיקרוסקופ והסירו עודפי נוזלים. לאחר מכן, הוסיפו מספר טיפות של חומר קיבוע והניחו זכוכית כיסוי מעל הפרוסות. השאירו לייבוש למשך הלילה.
בצעו דימות של החתכים באמצעות הגדלה של 10x במיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר. כדי לנתח את התמונות, המירו תחילה את התמונה לפורמט 8-bit באמצעות תוכנה מתאימה לניתוח תמונות כמותי. לאחר מכן, בחרו תא פלואורסצנטי מייצג חיובי ל-GFP והגדירו ידנית את צורתו על ידי לחיצה על estimate ושימוש בכלי הבחירה החופשית (free hand selection tool) לשרטוט גבולות התא.
התוכנה שומרת באופן אוטומטי את הקוטר ואת סף העוצמה של התא. לחצו על find cells כדי לאפשר לתוכנה לאתר תאים שעברו טרנספקציה ברחבי הקורטקס. לאחר מכן, במידת הצורך, הסירו ידנית תוצאות חיוביות שגויות.
חלק את מלוא עובי הקורטקס לשמונה אזורי עניין, מנורמלים בחתכים פרטניים, על ידי לחיצה על כלי האזור (region tool) ובחירה בשמונה פסי אזור (region stripes), כאשר פסים 1 ו-8 תואמים לאזור הוונטריקולרי ולחלק העליון של הלוח הקורטיקלי, בהתאמה. לאחר מכן, לחץ על apply כדי לאפשר לתוכנה לספור את המיקום היחסי של תאים שעברו טרנספקציית GFP בכל הקורטקס. לבסוף, לחץ על save quantification כדי לייצא את הנתונים לקובץ Excel לצורך ניתוח.
בדיקות Array CGH וריצוף כל الاكזומים (whole exome sequencing) זיהו את C6orf70 כגן מועמד להפרעות התפתחותיות גנטיות. בדיקת Quantitative PCR קבעה כי גן זה, יחד עם PHF10 ו-DLL1, באים לידי ביטוי בקליפת המוח של חולדה. התמונות הבאות מציגות חתכים קורונליים מייצגים של הנאו-קורטקס במוחות של חולדות בשלב E20, חמישה ימים לאחר אלקטרופורציה עם קונסטרקט של חלבון פלואורסצנטי ירוק לבדו, או בשילוב עם shRNA המכוון לרצף המקודד של C6orf70, או עם קונסטרקט אי-התאמה (mismatch) שאינו יעיל יחסית.
השבתת ביטוי של Filament A שימשה כביקורת לפגיעה בנדידה עצבית. אלקטרופורציה תוך-רחמית עם shRNA המכוון ל-C6orf70 או ל-Filament A גרמה לעצירה של תאים חיוביים ל-GFP בתוך האזור הוונטריקולרי (ventricular zone), כפי שמוצג על ידי החיצים הלבנים, בעוד שתאים המבטאים GFP לבדו, או בשילוב עם מבנה mismatch, לא שינו את הנדידה העצבית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לקחת בחשבון איזה שלב של גנזה קורטיקלית ברצונך לנתח: פרליפרציה עצבית, נדידה או הבשלה.
אל תשכחו שלמידה של ביצוע אלקטרופורציה תוך-רחמית (in-utero electroporation) במוח עוברי של מכרסמים דורשת תקופת הכשרה ארוכה, מיומנויות ותרגול שוטף.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בזיהוי גנים מועמדים חדשים הקשורים להטרוטופיה נודולרית פריוונטריקולרית (PNH), מום שכיח של התפתחות קליפת המוח. מטרת המחקר היא לאשר את התפקיד הסיבתי של גנים אלו in vivo, ובכך להעמיק את הבנתנו לגבי מומי מוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- גנטיקה
- התפתחות המוח
רקע
- הטרוטופיה נודולרית פריוונטריקולרית היא צורה נפוצה של מומים בהתפתחות קורטקלית במבוגרים.
- הבסיס הגנטי של מרבית המקרים הספורדיים נותר במידה רבה לא ידוע.
- זיהוי גנים מועמדים יכול להוביל לכלי אבחון משופרים.
- הבנת מסלולים מולקולריים היא חיונית לטיפול בהפרעות התפתחות המוח.
מטרת המחקר
- זיהוי גנים מועמדים חדשים להפרעות של מומים במוח.
- אישור התפקיד הגורם של גנים אלו in vivo.
- העמקת ההבנה של נתיבים מולקולריים הקשורים להתפתחות המוח.
שיטות מעבדה שנעשה בהן שימוש
- הכנת נקבות חולדה ההרה ביום 15 לעובר (E15) להליכים ניסיוניים.
- יישום של אסטרטגיה חדשנית לזיהוי גנים מועמדים.
- אישור תפקודי הגן באופן vivo.
- הקפדה על הנחיות מוסדיות ולאומיות במהלך הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- זיהוי תפקידו של הגן C6orf70 בפתוגנזה של PNH.
- הדגמת הפרוצדורה על ידי המהנדסת למעבדה פאביין שלר (Fabienne Schaller).
- פוטנציאל לפיתוח כלים אבחנתיים חדשים המבוססים על הממצאים.
- תובנות לגבי נדידה נוירונלית חריגה הקשורה ל-PNH.
מסקנות
- המחקר מזהה בהצלחה גנים מרכזיים הקשורים למבניות לקויה של המוח.
- אישור in vivo של תפקידי הגנים חיוני להבנת PNH.
- הממצאים עשויים להוביל להתקדמות בשיטות אבחון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שילוב של array-CGH, ריצוף כל האקסומים (whole-exome sequencing) ואלקטרופורציה ברחם (in utero electroporation) מאפשר זיהוי שיטתי ותיקוף תפקודי של גנים הגורמים למומים במוח. זרימת עבודה זו נותנת מענה לפער קריטי בקישור בין ממצאים גנומיים למנגנונים ביולוגיים in vivo, ובכך תומכת בביטחון ניבוי בבחירת מטרות עבור הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת ראיות ישירות לתפקוד הגנים במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של תפקוד גנים מועמדים in vivo לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור שינויים גנומיים לתוצאות פנוטיפיות.
- מסייע בתעדוף מטרות גנטיות להמשך בחינה טיפולית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מבסס מודלים מאושרים של מכרסמים לצורך סריקה עוקבת של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- מספק מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של נדידה נוירונלית והתפתחות קורטיקלית.
- מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות פנוטיפיות לצורך השוואה בין מחקרים.
מחקר תרגומי וטרום-קלני
- מתאימה מודלים פרה-קליניים לפנוטיפים של מחלות בבני אדם לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- תומך ברצף מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף תפקודי in vivo.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אישור קשרי סיבתיות במערכות רלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
אסטרטגיה משולבת זו מגשרת בין גילוי גנומי לבין תיקוף in vivo, וממקמת אותה בממשק שבין הגילוי המוקדם למחקר פרה-קליני של הפרעות נוירו-התפתחותיות.
- ביולוגיה של הגילוי: מקשרת בין זיהוי גנים מועמדים לניתוח מסלולים תפקודיים במודלים של מכרסמים.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות, ספציפיות לאזור, של נדידה עצבית להכנת הבדיקה.
- אנליטיקה: מספקת פלטים סטטיסטיים וכמיות מיקום להשוואת הפרעות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מתאימה פנוטיפים של מודלים בבעלי חיים לממצאי דימות קליניים לצורך רלוונטיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה זרימת עבודה מודולרית הניתנת להתאמה למגוון מטרות גנים ופנוטיפים של מומים במוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בדיקות תפקודיות in vivo ותומך בחזרתיות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת ראיות ישירות לקשר סיבתי בין גן למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מטרות גנטיות עבור הת indicaciones נוירו-התפתחותיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באלקטרופורציה של עוברי מכרסמים ברחם (in utero electroporation) ובניתוח כמותי של תמונות.
- נדרשת גישה לתשתיות של ריצוף גנומי, מיקרו-הזרקה והדמיה קונפוקלית.
- נדרשת סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של דירוג פנוטיפי וניתוח נתונים.
- התאמה לשלבי התפתחות אחרים או לאזורים אחרים במוח עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תקופות הכשרה ממושכות ומיומנות טכנית חיוניות להשגת תוצאות in vivo הניתנות לשחזור.
