כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שינויים ברשתות הנימים בקליפת המוח לאחר חשיפה ממושכת ל- HIV virotoxin, tat. שיטה זו יכולה לעזור לבחון שינויים מרכזיים במורפולוגיה של נימי קליפת המוח שעשויים לתרום לפתוגנזה של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מדויק מבחינה פיזיולוגית של פרמטרים מורפולוגיים נימיים מרובים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפתוגנזה של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV. ניתן ליישם אותו גם על מחלות אחרות בהן מתרחשים שינויים בכלי הדם כמו מחלת אלצהיימר. התחל הליך זה על ידי מריחת ג'ל דמעות מלאכותי על עיניו של עכבר מורדם.

לאחר מכן, גלח את ראשו באמצעות סכין גילוח חשמלי. לאחר מכן, מרחו תמיסת יוד פובידון כדי לעקר את הקרקפת, והניחו לה להתייבש. תחת מיקרוסקופ אור, הסר את הקרקפת של החיה, כדי לחשוף לחלוטין את העצמות הקודקודיות, העצמות הקדמיות הזנביות ונקודת הברגמה.

מרחו כמות קטנה של תמיסת כלוריד ברזל של עשרה אחוזים על הגולגולת, על מנת לייבש את הממברנה להסרה קלה. לאחר מכן, הסר את הממברנה המיובשת, על ידי גירוד עדין של הגולגולת בעזרת המלקחיים. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק סביב חלון לוחית הראש.

לחץ בעדינות את לוחית הראש על גולגולת העכבר, כדי לשמור על אזור העניין במרכז החלון. לאחר מכן, מרחו טיפת מלט דנטלי על לוחית הראש, כדי לפלמר את הדבק. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק לאורך קצה חלון לוחית הראש כדי ליצור מאגר שיחזיק את מי המלח.

לאחר שהדבק התייבש, הברג את לוחית הראש לרתמת לוחית ראש העכבר. הסר כל דבק מחלון לוחית הראש באמצעות מקדחה המחוברת למקדחת מיקרו-טורפ, המכוונת ל-6,000 סל"ד. עצור כל 10 עד 15 שניות כדי למנוע התחממות יתר של גולגולת העכבר.

לאחר מכן, בעזרת מקדחה חדשה, התחל לדלל את הגולגולת באמצעות מקדחה מיקרו-טורפ במהירות של 4,000 סל"ד. העבר את המקדחה בעדינות על פני הגולגולת ללא לחץ ישיר כלפי מטה. לאחר שהגולגולת מדוללת לחלוטין, נתק את העכבר מהמחזיק והנח אותו על גבו.

הדביקו בעדינות את שתי הגפיים האחוריות כדי לחשוף בבירור את הירכיים המדיאליות. לאחר מכן הסר את השיער מעל שתי הירכיים האמצעיות וחטא את אתר הניתוח על ידי כיסוי הירכיים בפובידון יוד. לאחר מכן, הסר בעדינות את העור בירך ימין המדיאלית, מעל וריד הירך והעורק.

יש למרוח כשלוש עד חמש טיפות של 0.9% מי מלח על מקום הניתוח. לאחר מכן, הפרד את וריד הירך מהעורק, על ידי ניתוח בוטה לצרור נוירווסקולרי של עצם הירך. כעת, הניחו שתי חתיכות של שלושה סנטימטרים של תפר כירורגי, מתחת לעורק הירך, במרחק של כסנטימטר אחד זה מזה.

סובב את התפר העליון בכיוון השעון כדי ליצור חוסם עורקים וסקולרי שיסייע במניעת איבוד דם מוגזם במהלך הצנתור. לאחר מכן, בצע חתך קטן בעורק הירך באמצעות מספריים קפיציים, שם יוכנס מאוחר יותר הקטטר כדי לעקוב אחר הפרמטרים הפיזיולוגיים של העכבר. בהליך זה, הסר את העור בירך השמאלית המדיאלית של העכבר.

לאחר מכן, אתר את וריד הירך. בעזרת מזרק מיליליטר אחד ומחט בגודל 30, שאבו 130 מיקרוליטר מתמיסת הצבע הפלורסנט. הזריקו 100 מיקרוליטר מהצבע לאט לווריד הירך.

לאחר הסרת המחט, הפעל לחץ עדין ויציב על מקום ההזרקה כדי לעצור כל דימום ולאפשר לצבע להסתובב במשך חמש דקות. לאחר מכן, סגור את אתר הניתוח עם תפרים. הפוך בזהירות את העכבר על בטנו והנח אותו ברתמת לוחית ראש העכבר.

להדמיית שני פוטונים in vivo, העבירו את המכשיר הכירורגי למיקרוסקופ שני הפוטונים והקפידו לשמור על רמת ההרדמה של בעל החיים. לאחר מכן, הנח כמות קטנה של 0.9% מי מלח לתוך מאגר לוחית הראש ומטרת המיקרוסקופ התחתונה כך שהיא תבוא במגע עם מי המלח. לאחר מכן, אתר את אזור העניין באמצעות יעד הצפייה בשדה הבהיר.

לאחר מכן, התחל בהדמיית שני פוטונים. אתר מיטה נימית במסך התצוגה והגדל אזור זה גם באמצעות הזום האופטי. רכוש תמונות של הנימים באמצעות שתי תוכנות הדמיית הפוטונים.

להדמיית פוטון ex vivo two, בצע חתך בקרקפת מהעצמות הבין-קודקודיות ועד לעצמות הקדמיות של העכבר ערוף הראש. אבטח את העור לצידי הגולגולת בעזרת האצבע המורה והאגודל, הנח את המספריים העדינים במיוחד מתחת לעצם הבין-קודקודית האמצעית וחתוך את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי עד כשלושה מילימטרים לאחר נקודת הברגמה. לאחר מכן, הפרד את הגולגולת מהמוח והסר בזהירות את כל קרומי המוח מפני השטח של המוח בעזרת המלקחיים.

החלק בעדינות את המלקחיים מתחת למוח כדי לשחרר אותו מהגולגולת. לאחר מכן, מקמו את המוח במטריצה מוחית, ספציפית לעכברים, ושטפו אותו בטיפות ACSF. לאחר מכן, הסר קטע מוח קורונלי בעובי מילימטר.

הנח את חלק המוח על מגלשת זכוכית קעורה המכילה ACSF, כאשר החלק הקדמי ביותר של החלק פונה כלפי מעלה. לאחר מכן כסו בעדינות את פרוסת המוח עם פתק כיסוי זכוכית. העבירו את השקופית לשלב המיקרוסקופ והניחו כמות קטנה של 0.9% מלח על החלקת הכיסוי.

הורד את מטרת המיקרוסקופ עד שהוא בא במגע עם מי המלח. לאחר מכן, אתר את קו האמצע של המוח באמצעות מטרת השדה הבהיר. כעת, התחל בהדמיית שני פוטונים, ואתר שוב את קו האמצע באמצעות המטרה פי 25.

השג זאת על ידי חיפוש הסדק האורכי במשטח קליפת המוח של החלק העטרתי. לאחר מכן, הנח את הקצה הימני של מסך ההדמיה על קו האמצע והזז את מסך הצופה לרוחב על פני שלוש פריימים שלמים. אתר את העומק שבו נימים בקושי נראים על מסך התצוגה.

לאחר מכן, הורד את מישור המיקוד למשך 20 מיקרומטר נוספים כדי לקבוע את החלק העליון של ערימת ה-z. הגדר את עובי התמונה למיקרומטר אחד. הורד את מסך התצוגה ל-100 מיקרומטר והתאם את עוצמת הלייזר לאורך כל הדרך כך שפחות מאחוז אחד מהפיקסלים יהיו רוויים יתר על המידה.

לבסוף, רכוש את מחסנית ה-z. באיור הזה, אחרי הכנת פרוסת המוח, ממוקם אזור הדמיה במרחק של כ-1.5 מילימטרים מקו האמצע. מחסנית z של 100 מיקרומטר מייצרת תמונה תלת מימדית המשמשת לניתוח בתוכנה האנליטית Amira.

לאחר מכן עוקבים אחר רשת הנימים באופן ידני על ידי הצבת צמתים בהתחלה ובקצה של נימים או בכל מקום שבו נימי אחד מסתעף לאחר. זה מייצר תמונה שלדית לחלוטין שממנה מופקים אוטומטית הפרמטרים המורפולוגיים. ניתן לחלץ את מספר הצמתים הנימים, המקטעים, אורך המקטע הממוצע ואורך המקטע הכולל באמצעות שני הדמיית פוטון ex vivo של פרוסות מוח עכבר.

כאן, תמונה דו מימדית של רשתות הנימים מופקת על ידי הדמיה in vivo, בה ניתן לחלץ את קוטר הנימים ולחשב את נפח הנימים הכולל באמצעות קוטר הנימים ואורך הקטע הכולל המתקבל מהדמיית ex vivo. לאחר שליטה, ניתן להשלים הליך זה תוך שלוש וחצי שעות אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנוע במהירות תוך שמירה על רמת הרדמה קבועה מכיוון שאיזופלורן עלול לגרום להרחבת כלי הדם של נימים בקליפת המוח, ובכך להטות את הנתונים.

במהלך הליך זה ניתן לקבל פרמטרים נימיים אחרים, כגון מהירות תאי דם אדומים או שטף תאי דם אדומים, שיכולים לספק הבנה מעמיקה יותר של השינויים הפתוגניים הנראים בהפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV ומחלות ניווניות אחרות. בהצלחה בניסויים שלך.