Name: כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למד כיצד לכמת שינויים ברשתות הנימיות הקורטיקליות במוח עכברים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים in vivo ו-ex vivo. שיטה זו חושפת את השפעת הרעלן HIV על מורפולוגיית כלי הדם ותורמת להבנת הפרעות נוירוקוגניטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למריה ג'פסון, ד"ר פייבי ג'ורדן וד"ר לינדה קלהאן מאוניברסיטת רוצ'סטר Multiphoton Core על הייעוץ הטכני לאורך השלמת פרוטוקול זה. אנו מודים גם לד"ר צ'אנגיונג פנג על ייעוץ סטטיסטי מומחה, ולד"ר מייקן נדרגארד מהמרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר על עיצוב לוח הראש ששימש במאמר זה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים T32GM007356 ו-R01DA026325 מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH); ועל ידי המרכז לחקר האיידס של אוניברסיטת רוצ'סטר P30AI078498 (NIH).

<ol><li>Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coat+of+many+colors%3A+neuroimmune+crosstalk+in+human+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection.</a> Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).</li>
<li>Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+associated+dementia%3A+symptoms+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 associated dementia: symptoms and causes.</a> Retrovirology. 3, 28(2006).</li>
<li>Antinori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+research+nosology+for+HIV-associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders.</a> Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).</li>
<li>Clifford, D. B., Ances, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder.</a> The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).</li>
<li>Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-associated+neurocognitive+disorder%3A+pathogenesis+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroimmune+pharmacology+%3A+the+official+journal+of+the+Society+on+NeuroImmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities.</a> Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+production+of+IL-17A+induces+glial+activation%2C+microvascular+pathology+and+enhances+the+neuroinflammatory+response+to+systemic+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia.</a> PloS one. 8 (2), e57307(2013).</li>
<li>Silva, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+central+nervous+system+expression+of+HIV-1+Tat+leads+to+accelerated+rarefaction+of+neocortical+capillaries+and+loss+of+red+blood+cell+velocity+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity.</a> Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).</li>
<li>Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thin-skull+window+technique+for+chronic+two-photon+in+vivo+imaging+of+murine+microglia+in+models+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Bruce-Keller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphine+causes+rapid+increases+in+glial+activation+and+neuronal+injury+in+the+striatum+of+inducible+HIV-1+Tat+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice.</a> Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).</li>
<li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).</li>
<li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+hypercapnia+reveals+an+underlying+cerebrovascular+pathology+in+a+murine+model+for+HIV-1+associated+neuroinflammation%3A+role+of+NO-cGMP+signaling+and+normalization+by+inhibition+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterase-5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 253(2012).</li>
<li>Farber, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+and+agent-specific+dilation+of+intracerebral+microvessels+by+volatile+anesthetics+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices.</a> Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת לנתח מבני כלי דם במוח במגוון רחב של דגמים / הגדרות ניסיוניות. להצלחה של שיטה זו, שלושה שלבים קריטיים חייבים להיות משתלטים. ראשית, החלון הדק-הגולגולת אסור לפגוע בגולגולת או במוח בסיסי. זה קל לנקב את הגולגולת בדילול, או לגרום לדליפה של כלי דם חום מושרה. זה יכול להפריע הדמיה כצבע הניאון ידלוף למטוס של מוקד ולטשטש את הנימים. אם הגולגולת לעתים קרובות שוברת במהלך תקופת ההכנה דקה-גולגולת, הוא סביר ביותר הנגרם על ידי לחץ כלפי מטה גדול מדי. מחזיק תרגיל ...

וירוס כשל חיסוני אנושי 1 (HIV-1) פולש למוח בשלב האקוטי של זיהום בנגיף, ופרודוקטיבית מדביק שני מיקרוגלים ומקרופאגים תושב המוח, שמוביל להפעלתם - ואת שחרורם של שני מתווכים דלקתיים המופק מהמארח וHIV-1 המסיס virotoxins כגון טאט וgp120 (שנסקר ב1,2). כתוצאה מכך, מדינת neuroinflammatory כרונית הופכת הוקמה במערכת העצבים המרכזית, שחשב לתרום לפתוגנזה של HIV-1 הפרעות Associated נוירוקוגניטיבי (יד) 3-5. ביטוי יתר כרוני של HIV-1 תאת או אינטרלוקין -17A (IL) בתוך מערכת העצבים המרכזית של עכברים הוכח לגרום לואקום כלי דם 6,7. זה מעלה את האפשרות שneuroinflammation הכרוני עשוי לתרום לפתוגנזה של יד בהשפעות על מערכת כלי הדם במוח. כדי לבחון שאלה זו נוספת, פיתחנו שיטות לכמת struc כלי דם המוחיטורס. מאמר זה מתאר שיטה לכימות מספר צמתים נימים, מגזרי נימים, אומר אורך קטע, סך אורך קטע, אומר קוטר נימים, ונימים כוללת באמצעות in vivo ההדמיה של רשתות נימים דרך חלון קליפת המוח דק גולגולת נפח (שונה ממתואר בעבר פרוטוקולים) 8,9, כמו גם הדמיה vivo לשעבר של חלקים במוח, באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. גישה משולבת זו מספקת לכימות הוליסטית של פרמטרים כלי דם מוחי, מאז חלון קליפת המוח דק-גולגולת in vivo מאפשר לשימור הסביבה במוח, בעוד ההדמיה vivo לשעבר של רשתות נימים בפרוסות מוח מאפשרת שחזור מלא, תלת ממדים רשתות נימים - אשר לאחר מכן ניתן לכמת באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ Leica</td><td>Leica בע"מ</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>תאורה בעוצמה גבוהה</td><td>דולן-ג'נר</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Stryker&nbsp;</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>T / PUMP</td><td>Gaymar Industries, Inc.</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>TEC-4 וופורייזר איזופלורן</td><td>Datex Ohmeda</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל דמעות מלאכותי</td><td>באטלר AHS</td><td>7312</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פובידון-יוד&nbsp;</td><td>Aplicare</td><td>52380-1855-9</td><td></td></tr><tr><td>מספריים בון משובחים במיוחד</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumot #5 מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת כלוריד ברזל</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-16</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 454 ג'ל דבק מיידי פריזמה</td><td>Henkel</td><td>45404</td><td></td></tr><tr><td>Dental Cement</td><td>Stoelting</td><td>51459</td><td></td></tr><tr><td>Microtoruqe II ערכת ידית</td><td>Pearson Dental</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>005 Burr for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Norland Blade (Dental Microblade)</td><td>Salvin Dental</td><td>6900</td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td>מסרטן קבוצה 2B</td></tr><tr><td>תפר קלוע</td><td>Ethicon</td><td>735G</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים אביב</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; צנתר עורקי</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>MAC-01</td><td>קצה הצנתר נמתח ידנית על מנת להקטין את קוטרו.</td></tr><tr><td>לחץ דם מוניטר</td><td>עולמי דיוק חדירות</td><td>SYS-BP1</td><td></td></tr><tr><td>מתמר לחץ דם וכבלים</td><td>עולם דיוק חודרות</td><td>BLPR2</td><td></td></tr><tr><td>RAPIDLab מנתח גזי דם&nbsp;</td><td>סימנס&nbsp;</td><td>248</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; l צינור נימי</td><td>VWR</td><td>15401-413</td><td></td></tr><tr><td>טקסס אדום-דקסטרן (70,000 מגה-וואט, 10 מ"ג/ק"ג מומס במי מלח)</td><td>Invitrogen</td><td>D-1830</td><td></td></tr><tr><td>Adult Brain Slicer Matrix</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope</td><td>Olypmus</td><td>FV-1000 MPE</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee Ti:Sa לייזר</td><td>ספקטרה-פיזיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)</td><td></td><td>זמין ב-http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Amira Software</td><td>Visage Imaging&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה hiv

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

זיהום בנגיף הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) גורם לעתים קרובות להפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV-1 (HAND), ומאופיין במצב נוירו-דלקתי כרוני בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS), שנחשב מונע בעיקר על ידי הפעלה מתווכת ויראלית של מיקרוגליה ומקרופאגים תושבי המוח. זיהום ב-HIV-1 מלווה גם בשינויים בזרימת הדם במוח (CBF), מה שמעלה את האפשרות שדלקת עצבית כרונית הקשורה ל-HIV עלולה להוביל לשינויים ב-CBF ו/או בארכיטקטורת כלי הדם במוח. כדי לענות על שאלה זו, השתמשנו במודל עכברי לדלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV, ובדקנו אם חשיפה ארוכת טווח לסביבה דלקתית זו עלולה לפגוע בכלי הדם במוח ולגרום לנדירות של רשתות נימיות. במאמר זה אנו מתארים שיטה לכימות שינויים בצפיפות הנימים בקליפת המוח במודל עכבר של מחלה נוירו-דלקתית (עכברים טרנסגניים HIV-1 Tt). גישה ניתנת להכללה זו משתמשת בהדמיה דו-פוטונית in vivo של נימים בקליפת המוח דרך חלון קליפת המוח של גולגולת דקה, כמו גם הדמיה דו-פוטונית ex vivo של נימים בקליפת המוח של עכבר. הליכים אלה מייצרים תמונות וקבצי z-stack של רשתות נימיות, בהתאמה, אשר לאחר מכן ניתן לעבור ניתוח כמותי על מנת להעריך שינויים בארכיטקטורת כלי הדם במוח.

חלון קליפת המוח הדק-הגולגולת מאפשר בשני פוטונים הדמיה vivo של נימים בקליפת המוח (איור 1). אזור מתאים לתמונה מראה נימים רבות, שונות (איור 1 א). באותו שדה הראייה, אין קיר תא autofluorescence עורקים, וייתכן שיש אותות אחרים ניאון, כגון הקרינה קולגן, הנגרמים על ידי דור השני הרמוני 11 (איור 1). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:ri...

מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לכמת את ארכיטקטורת כלי הדם במוח באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני in vivo ו-ex vivo.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת שינויים ברשתות הנימיים הקורטיקליות לאחר חשיפה ממושכת לרעלן הווירוס של HIV, tat. שיטה זו יכולה לסייע בבחינת שינויים מרכזיים במורפולוגיה של הנימיים הקורטיקליות העלולים לתרום לפתוגנזה של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מדויק מבחינה פיזיולוגית של פרמטרים מורפולוגיים נימיים מרובים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפתוגנזה של הפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV, ניתן להשמיש אותה גם למחלות אחרות שבהן מתרחשים שינויים וסקולריים, כגון מחלת אלצהיימר. התחילו את הפרוצדורה על ידי מריחת ג'ל דמעות מלאכותיות לעיניו של עכבר שהורדם.בשלב הבא, גלחו את ראשו של בעל החיים באמצעות תספורת חשמלית. לאחר מכן, מרחו תמיסת פובידון יוד כדי לעקר את הקרקפת, והמתינו להתייבשותה. תחת מיקרוסקופ אור, הסירו את קרקפת בעל החיים כדי לחשוף לחלוטין את עצמות הפריאטליות (parietal bones), את עצמות הפרונטליות הכאודליות (caudal frontal bones) ואת נקודת ה-bregma.מרחו כמות קטנה של תמיסת ferric chloride בריכוז עשרה אחוזים על הגולגולת, כדי לייבש את הקרומי להסרה קלה. לאחר מכן, הסירו את הקרומי המיובש על ידי גירוד עדין של הגולגולת באמצעות הפינצטה. לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק מסביב לחלון של לוחית הראש.לחץ בעדינות את פלטת הראש כנגד גולגולתו של העכבר, כדי לשמור על אזור העניין במרכז החלון. לאחר מכן, מרח טיפה של דבק שיניים על פלטת הראש כדי לפולימריז את הדבק. בשלב הבא, מרח שכבה דקה של דבק לאורך קצה החלון של פלטת הראש כדי ליצור מאגר להחזקת ה-saline.לאחר שהדבק התייבש, הברגו את לוחית הראש אל רתמת לוחית הראש של העכבר. הסירו שאריות דבק מחלון לוחית הראש באמצעות מקדח המחובר למקדח micro-torp, המכוון ל-6,000 rpm. עצרו כל 10 עד 15 שניות כדי למנוע התחממות יתר של גולגולת העכבר.לאחר מכן, בעזרת מקדח חדש, התחילו לדקק את הגולגולת באמצעות מקדח micro-torp המכוון ל-4,000 rpm. הניעו את המקדח בעדינות על פני הגולגולת ללא הפעלת לחץ ישיר כלפי מטה. ברגע שהגולגולת דוקקה לחלוטין, נתקו את העכבר מהמחזיק והניחו אותו על גבו.הדביקו בעדינות את שתי הגפיים האחוריות בעזרת סרט הדבקה כדי לחשוף בבירור את הירכיים הפנימיות (medial thighs). לאחר מכן, הסירו את הפרווה משני צידי הירכיים הפנימיות וחטאו את אזור הניתוח על ידי כיסוי הירכיים ב-povidone iodine. בשלב הבא, הסירו בעדינות את העור מהירך הימנית הפנימית, מעל הווריד והעורק הפמורליים.יש להניח כשלוש עד חמש טיפות של סליין 0.9% על אזור הניתוח. לאחר מכן, יש להפריד את הווריד הפמורלי מהעורק, באמצעות דיסקציה קהה של הצרור הנוירו-וסקולרי הפמורלי. כעת, יש להניח שתי חתיכות של חוט תפר כירורגי באורך שלושה סנטימטרים כל אחת, מתחת לעורק הפמורלי, במרחק של כסנטימטר אחת מהשנייה.סובב את התפר העליון עם כיוון השעון כדי ליצור חסם כלי דם (vascular tourniquet) שיסייע במניעת איבוד דם מוגבר במהלך הצנתור. לאחר מכן, בצע חתך קטן בעורק הפמורלי באמצעות מספרי קפיץ, במקום שבו יוכנס מאוחר יותר הקטטר לניטור הפרמטרים הפיזיולוגיים של העכבר. בהליך זה, הסר את העור מהירר השמאלי המדיאלי של העכבר.בשלב הבא, אתרו את הווריד הפמורלי (הווריד בירך). באמצעות מזרק של 1 מיליליטר ומחט בדרגה (gauge) 30, שאבו 130 µL של תמיסת הצבע הפלואורסצנטי. מזריקו 100 µL של הצבע לאט אל תוך הווריד הפמורלי.לאחר הסרת המחט, הפעל לחץ עדין וקבוע על אתר ההזרקה כדי להפסיק כל דימום, והמתן חמש דקות כדי לאפשר לצבע להסריק. לאחר מכן, סגור את אתר הניתוח בעזרת תפריים. הפוך בזהירות את העכבר על בטנו והנח אותו ברתמת לוח הראש לעכברים.לצורך דימוי דו-פוטוני in vivo, העבירו את מערך הניתוח למיקרוסקופ הדו-פוטוני וודאו כי רמת ההרדמה של בעל החיים נשמרת. לאחר מכן, הניחו כמות קטנה של saline 0.9% למאגר של פלטת הראש והורידו את עדשת המיקרוסקופ כך שתבוא במגע עם ה-saline. לאחר מכן, אתרו את אזור העניין באמצעות עדשת תצפית בשדה בהיר (bright field).לאחר מכן, התחל בדימוי דו-פוטוני. אתר מיטת נימי דם על מסך התצוגה והגדל אזור זה גם באמצעות הזומי האופטי. רכוש תמונות של הנימים באמצעות התוכנה לדימוי דו-פוטוני.עבור דימות דו-פוטוני ex vivo, בצעו חתך בקרקפת מהעצמות הבין-קודקודיות (interparietal bones) ועד לעצמות המצח של העכבר לאחר עקירה. קבעו את העור לדפנות הגולגולת באמצעות האצבע והאגודל, מקמו את המספריים העדינים במיוחד מתחת לעצם הבין-קודקודית המדיאלית וגזרו את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי עד למרחק של כ-3 mm לאחר נקודת ה-bregma. לאחר מכן, הפרידו את הגולגולת מהמוח והסירו בזהירות כל קרום מנינגיא מפני שטח המוח באמצעות פינצטה.החליקו בעדינות את הפינצטה מתחת למוח כדי לשחרר אותו מהגולגולת. לאחר מכן, הניחו את המוח במטריצת מוח ייעודית לעכברים, ושטפו אותו עם טיפות של ACSF. לאחר מכן, הסִירו נתח מוחי קורונלי בעובי של מילימטר אחד.הניחו את נתח המוח על זכוכית כיסייה קעורה המכילה ACSF, כאשר החלק הקדמי ביותר של הנתח פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כסו בעדינות את נתח המוח בעזרת כיסוי זכוכית. העבירו את הזכוכית לשולחן המיקרוסקופ והניחו כמות קטנה של 0.9%saline על כיסוי הזכוכית.הורד את עדשת המיקרוסקופ עד שתבוא במגע עם התמיסה המלוחית. לאחר מכן, אתר את קו האמצע של המוח באמצעות עדשת השדה המואר (bright field). כעת, התחל בדימות דו-פוטוני, ואתר שוב את קו האמצע באמצעות עדשת ה-25x.בצעו זאת על ידי חיפוש החריץ האורכי (longitudinal fissure) על פני השטח הקורטיקליים של החתך הקורונלי. לאחר מכן, הניחו את הקצה הימני של מסך ההדמיה על קו האמצע והזיזו את מסך התצוגה לצד (laterally) לאורך שלושה פריימים שלמים. אתרו את העומק שבו נימי הדם בקושי נראים על מסך התצוגה.לאחר מכן, הנמיכו את מישור המיקוד ב-20 micrometers נוספים כדי לקבוע את החלק העליון של ה-z-stack. הגדירו את עובי התמונה ל-one micrometer. הנמיכו את מסך התצוגה ב-100 micrometers וכווננו את עוצמת הלייזר כך שפחות מאחוז אחד מהפיקסלים יהיו ברוויה יתר (over-saturated).לבסוף, רכשו את ה-z-stack. באיור זה, לאחר הכנת פרוסת המוח, ממוקם אזור דימוי במרחק של כ-1.5 millimeters מקו האמצע. z-stack של 100 micrometer יוצר תמונה תלת-ממדית המשמשת לניתוח בתוכנת Amira Analytical Software.לאחר מכן, רשת הנימיים ממופה ידנית באמצעות הצבת צמתים בתחילתו ובסופו של נימה, או בכל נקודה שבה נימה אחת מתפצלת לאחרת. פעולה זו יוצרת תמונת שלד (skeletonized image) מלאה, ממנה מופקים באופן אוטומטי הפרמטרים המורפולוגיים. ניתן להפיק את מספר צמתי הנימיים, המקטעים, אורך המקטע הממוצע ואת אורך המקטעים הכולל באמצעות דימות ex vivo בשני פוטונים של פרוסות מוח של עכבר.כאן, תמונה דו-ממדית של רשתות הנימים מופקת באמצעות דימות in vivo, שבאמצעותו ניתן לחלץ את קוטר הנימים ולחשב את נפח הנימים הכולל באמצעות קוטר הנימים ואורך הסגמנט הכולל שהתקבל מהדימות ex vivo. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים הליך זה בשלוש שעות וחצי אם הוא מבוצע כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לפעול במהירות תוך שמירה על רמה קבועה של הרדמה, מכיוון ש-isoflurane עלול לגרום להרחבה של נימי קליפת המוח (vasodilation), ובכך להטות את הנתונים.במהלך הליך זה ניתן להשיג פרמטרים נימיים נוספים, כגון מהירות תאי דם אדומים או שטף תאי דם אדומים, אשר יכולים לספק הבנה מעמיקה יותר של השינויים הפתוגניים הנצפים בהפרעות נוירו-קוגניטיביות הקשורות ל-HIV ובמחלות ניוורו-דגנרטיביות אחרות. בהצלחה בניסוייכם.

quantification-cerebral-vascular-architecture-using-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח...

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

 מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר 

מקור: Arango-Lievano, M. et. al., הדמיה אורכית in vivo של כלי הדם במוח: רלוונטיות למחלות מערכת העצבים המרכזית. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים הדמיה דו-פוטונית in vivo כדי להמחיש פלאק עמילואיד וכלי דם מוחיים עם תווית פלואורסצנטית. פלואורסצנציה כחולה מסמנת פלאק, בעוד פלואורסצנציה ירוקה מדגישה את כלי הדם במוח. מפה תלת מימדית של אזור העניין והדמיית פסיפס ברזולוציה גבוהה חושפות אינטראקציות מפורטות של פלאק עמילואיד עם כלי מוח.

הדמיה in vivo של כלי מוח ופלאק עמילואיד במודל עכבר של מחלת אלצהיימר

פרוטוקול זה מתאר התניה מוקדמת היפוקסית חוזרת ונשנית, או חשיפות קצרות להיפוקסיה מערכתית המפחיתות את נפחי האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח בעקבות חסימה חולפת של עורק המוח האמצעי בעכברים. הוא גם מפרט כימות כפול של נפח האוטם והפרעה במחסום הדם-מוח לאחר שבץ מוחי כדי להעריך את היעילות של הגנה נוירו-וסקולרית.

כימות של הגנת עצבים וכלי דם בעקבות חסימת עורק חוזר חוסר חמצן אכשור קד וחלוף התיכון מוחין של עכברים

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

כאן אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה דימות ברזולוציה, שחזור תלת מימדי של העכבר נוירו-וסקולריים יחידה, מחסום הדם - מוח באמצעות סעיפים לתרשים המוח. שיטה זו מאפשרת הפריט החזותי, ניתוח של כימות של organelles תאיים-BBB.

דימות ברזולוציה קונאפוקלית של מחסום הדם - מוח: הדמיה, שחזור תלת-ממד, כימות של Transcytosis

מטרת מאמר זה היא להציג שיטה המאפשרת שחזור תלת-ממדי של העץ כשאבדן בעכברים לאחר מיקרו שחושב טומוגרפיה והנחישות של אמצעי אחסון של מקטעי כל כלי יכול לשמש כדי לכמת vasospasm מוחין ב מודלים מאתר של דימום תת-עכבישי.

שיטה הנפחי עבור כימות Vasospasm המוחית במודל מאתר של דימום תת-עכבישי

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

למד כיצד לכמת שינויים ברשתות הנימיות הקורטיקליות במוח עכברים באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים in vivo ו-ex vivo. שיטה זו חושפת את השפעת הרעלן HIV על מורפולוגיית כלי הדם ותורמת להבנת הפרעות נוירוקוגניטיביות.

כימות של מוחין ארכיטקטורת כלי דם באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים במודל עכבר של neuroinflammation המושרה HIV

גלה סרטונים נוספים