Name: Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למד הערכת הרכבת ציר מיוטי בביציות עכבר באמצעות השתקת mRNA בתיווך siRNA וניתוח אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני חלוקת כרומוזומים ובהבנת אנאפלואידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי אוניברסיטת ג'ורג'יה, ומענק (HD071330) מהמכונים הלאומיים לבריאות ל-MMV.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת ג&#39;ורג&#39;יה. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות ביצית, רכישה או טרי להכין בינוני מינימאלי חיוני (ממ) ולהשלים עם 3 מ&quot;ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) כפי שמתוארים בטבלה 1. הנח בקבוק קלקר על איזון טעינה (טרה לאפס). הוסף את כל חומרים כימיים, למעט ה- BSA, על מנת ולהביא את הנפח הסופי עם MQ-מים לפי משקל לסך של 250 גרם. לאחר מכן להוסיף את BSA, מאפשר לפזר ולעקר מסנן. הערה: הבינוני ממ תאר דורש איזון ודגירת תא בתערובת גז רפואית של 5% CO 2, 5% O 2 ו- 90% N 2. עם זאת, כלי תקשורת אחרים (למשל, CZB) יכול לשמש המאפשרות לתא דגירה ב 5% CO 2 בתנאים אטמוספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור microinjection ביצית, לרכוש או להכין מדיום M2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמ &#39;גונדוטרופין של סוסת מושלות בסרום (PMSG) לריכוז של 5 IU / 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה ולשקם מניות siRNA לריכוז עבודה של 1 מיקרומטר. </li></ol> 2. ביצית אוסף עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: כדי לעורר התפתחות זקיק בשחלה ולהגדיל את מספר הזקיקים טרום ביוץ, לנהל 5 IU של PMSG intraperitoneally לנקבות עכברים 48 שעות לפני איסוף ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 3: לאוסף ביצית ותרבות, להגדיר תרבות מנות 35 מ&quot;מ עם 3 מיליליטר של ממ / BSA בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מיליליטר milrinone. מעכב phosphodiesterase זה שומר על הביציות בprophase-לעצור ומונע התמוטטות נבטי שלפוחית ​​(GVBD). לאזן את הכלים התרבות בתערובת גז רפואי לפחות 15 דקות. הערה: התקשורת בתוספת של milrinone נדרשת בכל אוסף ביצית, כמו גם microinjection ביצית ולאחר תקופת ההמתנה תרבות 24 שעות siRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר השחלות מנקבות העכברים באמצעות מעבדה הוקמה מתרגל 15 ולהעביר לצלחת תרבות חדשה עם מראש התחממתי equilibrated ממ / BSA / milrinone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת התרבות על הבמה של סטראו לאוסף ביצית. שחרור קומולוס-ביצית מתחמים (COC של) על ידי ניקוב ידני זקיקי Antral עם 27 מחטי G. תקן שחלה אחת לתחתית צלחת התרבות, עם מחט 27 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר, ולהשתמש במחט שנייה לנקב את כל הזקיקים הגדולים. חזור על פעולה עבור כל השחלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלי הפה pipetting סטנדרטיים או באמצעים אחרים של שאיפת ביצית, לאסוף את כל הביציות שמוקפות 2 שכבות או יותר של תאי קומולוס קומפקטיים. העבר את COC של למנה חדשה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את תאי קומולוס מקיפים על ידי pipetting העדין חזר עם טפטפת מיליליטר 1 מוגדר שאיפת נפח של 750 μl. חזור על שלב pipetting כ -12 פעמיםולאפשר לביציות להתאושש במשך 5 דקות. המשך בדרך זו עד שרוב תאי קומולוס הוסרו או כל. מעבירים את הביציות הערומות למנת תרבות אחרת ולאפשר לאזן על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקצות את הביציות הערומות לשלוש קבוצות ניסוי שישמש ל: microinjection (i) של siRNAs הספציפי נגד היעד של עניין, (ii) microinjection של siRNAs נוקבים (שליטה), וכן (iii) קבוצת ביקורת-מוזרק אינה כדי להסביר תנאי תרבות. </li></ol> 3. הביצית Microinjection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תרבות מנות עם 3 מיליליטר תקשורת M2 בתוספת milrinone (1 מיקרוגרם / מיליליטר) לmicroinjection ביצית. להכין מנות תרבות המכילות ממ / BSA / milrinone לשטיפה והתרבות הבאה של ביציות מוזרקות. הערה: בינוני M2 מכיל HEPES חיץ ודורש התחממות מראש על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנאים אטמוספריים. ממ דורש התחממות מראש ואיזון באמצעות גז רפואי כלתארד לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מערכת microinjection. טען את מחט הזריקה עם 5 μl של פתרון siRNA ספציפי 1 מיקרומטר. Secure פיפטה האחזקה ומחט זריקה לmicromanipulators של מערכת microinjection והקים את יחידת ההזרקה עם נפח ולחץ מכוילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מיקרו טיפת 200 μl של תקשורת M2 בצד הפנימי של המכסה של צלחת תרבות 3 סנטימטר ולהוסיף ביצית להתקנה וליישור של מערכת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בביצית כמדריך, להתאים את העמדות של מחטי האחזקה והזרקה. החל לחץ שלילי לפיפטה ההחזקה לאבטח בעדינות את הביצית ולהתאים את המיקום של מחט הזריקה לקוטר הרחב ביותר של התא. התאם את הגדרות כדי לאפשר microinjection של כ 10 pl של פתרון siRNA בכל מקום לתוך הציטופלסמה הביצית. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53586/53586fig1.jpg" /> microinjection 1. ביצית איור להגדיר. ( <strong&gt; תמונה) נציג של מיקרו-טיפת 200 μl של תקשורת M2 ממוקמת על המכסה מצלחת תרבות 3 סנטימטר, עם מחט פיפטה האחזקה והזרקה ממוקמת על ימין ועל השמאל, בהתאמה. (ב) קבוצה של prophase-עצרתי ביציות (GV-שלבים) לפני microinjection. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53586/53586fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את המכסה לשלב סטראו ולהוסיף מיקרו-טיפת 200 μl של תקשורת M2 הטרי. להוסיף קבוצה של ביציות (~ 10) למייקרו-הטיפה על ידי הפה pipetting, או שיטות חלופיות, ואז לחזור למכסה עם מיקרו-טיפה לבמה microinjection. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך microinject הביציות בודדות. Secure ביצית אחת עם פיפטה מחזיקה, הכנס באיטיות את קצה מחט ההזרקה לתוך הציטופלסמה ולגרש את עוצמת הזריקה של פתרון siRNA. לחזור מחט הזריקה ומו בזהירותיש ביצית שהוחדרו לעמדה בתחתית מיקרו הטיפה. הזז ביציות מוזרקות ללא הצלחה עמדה בראש מיקרו הטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על תהליך microinjection עם כל ביצית. כדי לשמור על כדאיות ביצית אופטימלית, microinject רק מספר קטן של ביציות בכל פעם. ודא שתהליך זה לא לוקח יותר מכמה דקות כדי למנוע טמפרטורה ו- pH שינויים במייקרו-הטיפה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב ביציות מוזרקות בהצלחה או להעביר בזהירות את המכסה עם מיקרו-הטיפה של ביציות הזריקו לסטראו. מעבירים את ביציות קיימא מוזרקים על ידי הפה pipetting או שיטות חלופיות, לממ / BSA בינוני / milrinone לשטוף ולאזן על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בקבוצה אחרת של ביציות, לחזור על תהליך microinjection עם מחט זריקה חדשה עמוסה siRNAs שאינו ספציפי לקבוצת הביקורת. שטוף את הביציות בממ / BSA / milrinone והעברה לצלחת תרבות נפרדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות כל הקבוצות שלביציות במשך 24 שעות בממ / BSA / milrinone על 37 מעלות צלזיוס באווירה של גז רפואי. הערה: תקופת התרבות &#39;בלוק milrinone&#39; נחוצה לדלדול mRNA / חלבון מטרה יעילה. </li></ol> 4. ביצית תרבות להבשלת meiotic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4: לכל קבוצת ניסוי של ביציות הגדרת 4 מנות תרבות (35 מ&quot;מ) עם 3 מיליליטר ממ / BSA. להשלים מנה אחת לכל קבוצת תקשורת עם 10% בסרום שור עוברי (באיכות גבוהה) (FBS) לשימוש עבור הבשלת ביצית. אפשר את כל מנות התרבות לאזן על 37 מעלות צלזיוס עם תערובת גז רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר ביציות מ&#39;בלוק milrinone &#39;, ברצף לשטוף את הביציות שלוש פעמים במנות המכילות ממ / BSA ולאחר מכן להעביר את הביציות לצלחת ההתבגרות מכילה תקשורת עם 10% FBS. תרבות כל קבוצות הביצית במשך 17 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר חידוש והתקדמות של מיוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות היכונו fixa ביצית: יום 5tion, כולל: paraformaldehyde 4% (PFA) במאגר PEM (i) (100 צינורות מ&quot;מ [pH 6.9], 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ EGTA) עם 0.5% Triton-X 100, וכן (ii) PBS בתוספת 5 FBS% שישמש כדי לשטוף ולחסום את הביציות. הערה: פתרונות אלה דורשים מראש התחממות עד 37 מעלות צלזיוס לפני קיבוע ביצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבעון ביצית (אחרי תרבות 17 שעות), במהירות להעביר את כל קבוצת ניסוי של ביציות על ידי הפה pipetting או שיטות חלופיות לבארות בודדות (של צלחת 4 היטב) המכיל 750 μl של טרום חימם 4% פתרון PFA ולדגור על 37 ° צלזיוס במשך שעה 1. בהמשך לכך לשטוף כל קבוצה של ביציות 3 פעמים (15 דקות כל אחד) ב -750 μl של PBS מראש חימם המכיל 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות בלוק בPBS / 5% FBS O / N 200 μl ב 4 ° C כדי למזער נוגדנים נוקבים מחייבות. </li></ol> ניתוח 5. Immunofluorescence <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 6: הערה: Immunostaining נעשה בצלחת רב גם וOOCytes מועברים באופן סדרתי לבארות רציפות, המכיל פתרונות נוגדן ולשטוף בהתאמה. או יכולים לשמש 48 או 96-גם צלחות, פשוט להתאים את הפתרון המבוסס על נפח גודל היטב. ל96-גם צלחות להשתמש 200 μl בכל טוב. ביציות מועברות לפתרונות השונים לפי הסדר הבא: פתרון נוגדן ראשוני - 3 בארות לשטוף - פתרון נוגדנים משני - 3 בארות לשטוף. כדי להגביל את החשיפה לאור הצלחת יכולה להיות מכוסות בנייר כסף. הכן FBS / 5% הטריים PBS ולהשתמש בפתרון זה כדי להכין דילולים נוגדן (למשל, אנטי-pericentrin ארנב (1/1000), אנטי-טובולין עכבר (1/1000)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביציות קבועות של כל קבוצת ניסוי לבארות בודדות המכילות 200 μl (או 100 μl, אם פחות נפח רצוי) של פתרון הנוגדן הראשוני ולכסות היטב עם parafilm. דגירה על פי תנאי נוגדן ספציפי אופטימליים (למשל, C ° 37 עבור שעה 1, או 4 ° CO / N). הערה: dilutio נוגדן ראשוניn כמו גם זמן דגירה ספציפי וטמפרטורה דורשים בדיקות כדי לקבוע את התנאים אופטימליים לנוגדנים שונים בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה עם הנוגדן הראשוני, לשטוף את הביציות שלוש פעמים PBS / 5% FBS (10-15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הביציות לתמיסה המכילה נוגדנים משני fluorescently- מצומדות (למשל, 1 / 1,000 דילול של נוגדנים נגד ארנב ואנטי עכבר מצומדות עם fluorochromes של אורכי גל שונים). דגירה עבור שעה 1 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביציות שלוש פעמים PBS / 5% FBS (10 - 15 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב לשטוף הסופי, להעביר את הביציות על גבי זכוכית נקייה ולשאוב בעדינות כל פתרון לשטוף עודף. זה יהיה לשתק את הביציות על משטח הזכוכית. הוסף 8 μl של ההרכבה תקשורת (המכיל DAPI) וכיסוי בזהירות תקשורת ההרכבה עם כיסוי להחליק x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ. מנמיכים את coverslip לאט, כדי למנוע השמנה בועות אוויר ו / או נזק לביציות. הערה: לחלופין, כדי לשמור על תכונות 3-מימדית של הביצית לניתוח מיקרוסקופיה confocal, להוסיף נפח קטן של 100 חרוזי זכוכית מיקרומטר (מעורבים עם וזלין) לפינות להחליק את המכסה לפני ההרכבה בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות חנות ב 4 מעלות צלזיוס, או להמשיך להערכת התקדמות meiotic כמו גם הניתוח של רמות ביטוי ולוקליזציה חלבון subcellular באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במסננים יש צורך להתאים את הנוגדנים משני בשימוש. </li></ol>

<ol><li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+Centrioles+in+the+First+and+Second+Meiotic+Spindles+of+Mouse+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Absence of Centrioles in the First and Second Meiotic Spindles of Mouse Oocytes.</a> J Cell Sci. 11 (2), 521-541 (1972).</li>
<li>Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+Reduction+During+Gametogenesis+and+Its+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Centrosome Reduction During Gametogenesis and Its Significance.</a> Biol Reprod. 72 (1), 2-13 (2005).</li>
<li>Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+anchoring+of+gamma+tubulin+complexes+by+pericentrin+controls+spindle+organization+and+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry.</a> Mol Biol Cell. 15 (8), 3642-3647 (2004).</li>
<li>Ma, W., Baumann, C., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEDD1+is+crucial+for+meiotic+spindle+stabilty+and+accurate+chromosome+segregation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">NEDD1 is crucial for meiotic spindle stabilty and accurate chromosome segregation in mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 339 (439-450), (2010).</li>
<li>Ma, W., Viveiros, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+pericentrin+in+mouse+oocytes+disrupts+microtubule+organizing+center+function+and+meiotic+spindle+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Depletion of pericentrin in mouse oocytes disrupts microtubule organizing center function and meiotic spindle organization.</a> Mol Reprod Dev. 81 (11), 1019-1029 (2014).</li>
<li>Bouniol-Baly, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Transcriptional+Activity+Associated+with+Chromatin+Configuration+in+Fully+Grown+Mouse+Germinal+Vesicle+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential Transcriptional Activity Associated with Chromatin Configuration in Fully Grown Mouse Germinal Vesicle Oocytes.</a> Biol Reprod. 60 (3), 580-587 (1999).</li>
<li>De La Fuente, R., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Activity+of+the+Mouse+Oocyte+Genome%3A+Companion+Granulosa+Cells+Modulate+Transcription+and+Chromatin+Remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Activity of the Mouse Oocyte Genome: Companion Granulosa Cells Modulate Transcription and Chromatin Remodeling.</a> Dev Biol. 229 (1), 224-236 (2001).</li>
<li>Hodgman, R., Tay, J., Mendez, R., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPEB+phosphorylation+and+cytoplasmic+polyadenylation+are+catalyzed+by+the+kinase+IAK1%2FEg2+in+maturing+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">CPEB phosphorylation and cytoplasmic polyadenylation are catalyzed by the kinase IAK1/Eg2 in maturing mouse oocytes.</a> Development. 128 (14), 2815-2822 (2001).</li>
<li>De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+in+the+germinal+vesicle+%28GV%29+of+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications in the germinal vesicle (GV) of mammalian oocytes.</a> Dev Biol. 292 (1), 1-12 (2006).</li>
<li>Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+with+gene+function+by+double-stranded+RNA+in+early+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development.</a> Nat Cell Biol. , 270-275 (2000).</li>
<li>Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reduction+of+dormant+maternal+mRNAs+in+mouse+oocytes+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference.</a> Development. 127 (19), 4147-4156 (2000).</li>
<li>Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renaissance+of+mammalian+endogenous+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Renaissance of mammalian endogenous RNAi.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2550-2556 (1016).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף

אמנם יש מספר שיטות להעברת חומצות גרעין אקסוגניים לתאים סומטיים, כגון electroporation וtransfection, microinjection הוא השיטה האופטימלית עבור משלוח של מולקולות RNA לביציות עכבר תעתיק שקטות. הפרוטוקול הנוכחי מספק גישה יעילה לדלדול במבחנה של mRNAs הספציפי המאפשר בדיקה הפונקציונלית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות. גישה זו גורמת לדלדול תמליל יעיל וישים מאוד. למרות siRNAs שימש למקד ספציפית תמלילי Pcnt, יכולים להיות מועסקים בתנאים דומים ליעד כמעט בכל גן ש...

מיוזה היא תהליך החלוקה ייחודי המתרחש בתאי מין (ביציות וזרע) וכולל שתי חטיבות רצופות ללא התערבות סינתזת DNA להפריד כרומוזומים הומולוגיים וchromatids האחות במהלך מיוזה-אני ומיוזה-השנייה, בהתאמה 1. שגיאות בהפרדת כרומוזום במהלך חלוקת meiotic בביציות יכולות לגרום aneuploidy, שעובר בירושה על ידי העובר במהלך הפריה. יש לציין, השכיחות של aneuploidy בעוברים מתפתחים עולה עם עלייה בגיל האם והיא אחד גורמים עיקריים למומים מולדים, כמו גם אובדן הריון בנשים 1,2, וכך, מדגיש את הצורך חשוב להבין את הבסיס המולקולרי של aneuploidy במהלך חלוקת meiotic . במהלך חלוקת תא, הפרדה כרומוזום היא מכריע תלויה בהרכבה של מנגנון ציר microtubule והקמה של אינטראקציות כרומוזום-microtubule יציבה עבור התקשרות נכונה לציר הפוךקטבים. חשוב לציין, היווצרות ציר meiotic בביציות של יונקים שונים ממיטוזה בתאים סומטיים, ומוסדרת על ידי מרכזי ארגון-microtubule הייחודיים (MTOCs) שחסרי centrioles 3,4. חלבונים חיוניים נחוצים להתגרענות microtubule וארגון למקם לMTOCs ביצית, כולל γ טובולין שמזרז הרכבה microtubule. בנוסף, pericentrin פונקציות כמו חלבון פיגומים חיוני, אשר נקשר ועוגני γ טובולין, כמו גם גורמים אחרים בMTOCs 5. יש לציין, המחקרים שלנו מראים כי דלדול של חלבונים הקשורים-MTOC מפתח משבש ארגון ציר meiotic ומוביל לשגיאות הפרדת כרומוזום בביציות, שאינם מלא נפתרו על ידי מחסום ההרכבה ציר (SAC) 6,7. לכן, פגמים ביציבות ציר, שאינו מפעילים את מעצר meiotic, מהווים סיכון משמעותי בתרומה לaneuploidy. למרות התפקיד החיוני שלהם בהרכבת ציר וארגון, prot MTOC הביציתהרכב עין ותפקוד נשאר הבינו היטב. בדיקת תפקודם של חלבוני יעד ספציפיים בביציות יונקים היא מאתגרת, כמו התאים להפוך לתעתיק שקטים זמן קצר לפני חידוש מיוזה 8,9. לפיכך, ביציות מראש ביוץ להסתמך על חנויות mRNA אימהיות לחדש מיוזה ותומכות בחלוקה meiotic כמו גם חטיבות המחשוף הראשונות לאחר ההפריה 10,11. היעילות של התערבות RNA השפלה (RNAi) בתיווך של תעתיקי mRNA בביציות יונקים היא מבוססת היטב וRNAs האימהי גויס לתרגום במהלך התבגרות meiotic במיוחד נוח לsiRNA מיקוד 12-14. לכן, microinjection של RNAs התערבות הקצר (siRNAs) לביציות מספק גישה רבת ערך לרוקן mRNAs היעד לבדיקה פונקציונלית. כאן אנו מתארים שיטות לבידוד של ביציות עכבר ודלדול בתיווך siRNA של transcri הספציפינק &#39;כדי לבדוק את התפקוד של חלבון הקשורים MTOC חיוני, pericentrin. בנוסף, אנו מתארים תנאי ניתוח immunofluorescence להעריך היווצרות ציר meiotic בביציות.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גונדוטרופין בסרום סוסה בהריון (PMSG)</td><td>EMD Biosciences</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM)</td><td></td><td></td><td>*מתכון המתואר בטבלה 1</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של ארל (10x)</td><td>נתרן סיגמא</td><td>E-7510</td><td></td></tr><tr><td> ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פירובית, מלח נתרן&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין G, מלח אשלגן&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P-7794</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>S-9137</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>G-8540</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, דיסודיום מלח דיהידרט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו חיוניות (50x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>תערובת ויטמינים MEM (100x)</td><td>Sigma</td><td>M-6895</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנול אדומה</td><td>סיגמא</td><td>P-0290</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A1470</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.01</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax M2 מדיה עם Hepes</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-015-D</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs המכוונים ל-Pericentrin</td><td>Qiagen</td><td>GS18541</td><td></td></tr><tr><td>siRNAs בקרה שלילית&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (תמיסה של 16%)</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט חוצצת (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pericentrin (ארנב)</td><td>Covance</td><td>PRB-432C</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אצטילציה א-טובולין (עכבר)</td><td>Sigma</td><td>T-6793</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד רביט Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21430</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><חזק>ציוד עיקרי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ (SMZ 800)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Fluorescent מיקרוסקופ</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-הזרקות Femtojet</td><td>Eppenforf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מניפולטורים</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטי מיקרו הזרקה (femtotips)</td><td>Eppendorf</td><td>930000035</td><td></td></tr><tr><td>החזקת פיפטות (VacuTip)</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>פלסטיק</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחות תרבית</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 4 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 96 בארות</td><td>קורנינג מדעי החיים</td><td>3367</td><td></td></tr><tr><td>0.45 מ"מ מערכת סינון CA</td><td>430768</td><td></td> מדעי <td>החיים</td></tr></tbody></table>

meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך sirna

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

שגיאות בהפרדת הכרומוזומים במהלך חלוקה מיוטית בגמטות עלולות להוביל לאנופלואידיה המועברת לאחר מכן לעובר עם ההפריה. האנופלואידיה הנובעת מכך בהתפתחות העוברים מוכרת כגורם עיקרי לאובדן הריון ולמומים מולדים כגון תסמונת דאון. הפרדת כרומוזומים מדויקת תלויה באופן קריטי בהיווצרות מנגנון ציר המיקרו-צינורות, אך תהליך זה נותר לא מובן היטב בביציות של יונקים. באופן מעניין, הרכבת ציר מיוטי שונה מהמיטוזה ומוסדרת, לפחות בחלקה, על ידי מרכזי ארגון מיקרו-צינורות ייחודיים (MTOCs). הערכה של חלבונים הקשורים ל-MTOC יכולה לספק תובנה חשובה לגבי מנגנוני הרגולציה השולטים בהיווצרות וארגון ציר מיוטי. כאן, אנו מתארים שיטות לבודד ביציות עכברים ולרוקן חלבונים הקשורים ל-MTOC באמצעות גישה בתיווך siRNA לבדיקת תפקוד. בנוסף, אנו מתארים תנאי קיבוע ביציות וניתוח אימונופלואורסצנטי כדי להעריך היווצרות וארגון של ציר מיוטי.

Microinjection של siRNAs מספק גישה יעילה לשפלת mRNA ודלדול חלבון שלאחר מכן בביציות, המאפשר בדיקה פונקציונלית יעילה ומאוד ספציפית של גורמי יעד שונים במבחנה. בהמשך לכך, immunofluorescence משמש לניתוח פנוטיפ ספציפי, כמו גם כדי לאמת את דלדול חלבון בביציות מוזרק siRNA. בדוגמא הנוכחית, תיוג ניאון של ביציות בודדות עם DAPI יחד עם נוגדנים אנטי-טובולין ואנטי-pericentrin אפשר: אישור (i) של דלדול pericentrin כמו גם (ii) הערכה מקיפה של שני תצורות הכרומטין וציר meiotic בשליטה ו ביציות ...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את ההיווצרות והארגון של כישורי המיטוזה בציטטים בעקבות דהרגה (depletion) מתווכת irna של חלבונים מרכזיים הקשורים ל-MTOC, כגון perrin. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית, כגון המנגנוים המווסתים את הפרדת הכרומוזומים ושיבושים פוטנציאליים המובילים לאנויפלואידיה בכל האתרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מובילה ל-knockdown יעיל של התמלול ולניתוח אימונופלואורסצנציה ספציפי של ציטטים בודדים.ניתן להתאים פרוצדורה זו לחקר של כמעט כל חלבון מטרה. 48 שעות לפני יום האיסוף, יש לטפל בעכברים הנקבות המשמשים לאיסוף ציותים על ידי הזרקה תוך-בטנית של חמישה יחידות בינלאומיות של PMSG. לאחר איסוף השחלות בשיטות סטנדרטיות, העבירו אותן לצלחת עם מצע MEM המחומם מראש ומוסב, המועשר ב-BSA וב-mil reone, והכינו את השטח לבידוד הציותים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. שחררו את קומפלקס הציטית-קומיולוס (COCs) על ידי קיבוע השחלה לתחתית צלחת התרבית באמצעות מחט במידה 27, והשתמשו במחט שנייה כדי לנקב את הזקיקים האנטרליים באמצעות שאיבת ציותים או שיטת פיפטינג פה סטנדרטית.אספו את התאים הביצתיים (oocytes) המוקפים בשתי שכבות או יותר של תאי cumulus דחוסים. העבירו COCs אלו לצלחית חדשה המכילה M-E-M-B-S-A mild reone והדגירו אותם למשך שעה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, המשיכו בהסרת תאי ה-cumulus (denuding) מהתאים הביצתיים בשיטות סטנדרטיות.הכינו את צלחת התרבית להזרקה עם שלושה מיליליטרים של מצע M2 עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של milone. כמו כן, הכינו את צלחות השטיפה והתרבית עם MEMBSA milone. לאחר מכן, טענו חמישה מיקרוליטרים של תמיסת INA בריכוז 1 mM לתוך מחט ההזרקה והכינו אותה למיקרו-הזרקה.כעת הניחו טיפה של 100 µL של מצע M2 על המכסה של צלחת בקוטר 3 cm. העבירו אוקוציט אחד אל תוך הטיפה והשתמשו בו כדי לדייק את מיקום פיפטת ההחזקה. קבעו את אתר ה-OAS על ידי הצמדתו לפיפטת ההחזקה באמצעות לחץ שלילי.לאחר מכן, כווננו את מיקום מחט ההזרקה לקוטר הרחב ביותר של התבצית. ברגע שהמיקום נקבע, הזריקו כ-10 picoliters מהתמיסה לתוך הציטופלזמה של התבצית, תוך הימנעות מהגרעין. החזירו את המכסה לשולחן של המיקרוסקופ הסטריאוסקופי והוסיפו 100 µL של מצע M two טרי.העבירו כ-10 ציטות למצע. לאחר מכן, בבמה של המיקרו-הזרקה, המשיכו בביצוע המיקרו-הזרקה. קבעו כל אווציט באמצעות פיפט ההחזקה והחדירו באיטיות את מחט ההזרקה אל תוך הציטופלזמה.הזריקו את תמיסת ה-S irna וסוגו בזהירות את פיפטת ההזרקה. העבירו את התאים שהוזרקו בהצלחה לקצה אחד של הטיפה, ואת התאים שלא הוזרקו בהצלחה לקצה השני של הטיפה. הזרקה של 10 תאים אמורה לארוך מספר דקות בלבד, דבר שהוא קריטי לשמירה על חיוניותם.העבירו את המכסה אל במה המיקרוסקופ הסטריאו והעבירו את כל התאים שהוזרקו בהצלחה לצלוחית עם M-E-M-B-S-A Mel המחומם ל-37 degrees Celsius. העבירו את התאים לאנקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius עם אטמוספירת גז רפואית והדגירו למשך 24 שעות. התחילו בשחרור התאים מבלוק ה-mil reone על ידי שטיפת התאים שלוש פעמים ב-M-E-M-B-S-A.לאחר מכן, העבירו את התאים למצע הבשלה המכיל 10% FBS. דגרו את התאים למשך 17 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, כך שהמיוזה תתחדש למחרת.קבעו את התאים. השתמשו בשאיבת תאים או בפיפטינג עם הפה כדי להעביר במהירות את קבוצות הניסוי השונות לבארות של פלטות בעלות ארבע בארות המכילות 750 µL של 4% PFA שחומם מראש. השאירו את התאים לדגירה למשך שעה לאחר מכן.שטפו כל קבוצה שלוש פעמים עם 750 µL של PBS מחומם עם 5% FBS. כל שטיפה צריכה להימשך 15 דקות באינקובטור. לאחר השטיפה, חסמו כל קבוצת אתרי O ב-5% FBS ב-BS. השאירו את החסימה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לצורך צביעה אימונוהיסטוכימית. השתמשו בשורה של שמונה בארות בלוח הרב-בארי עבור כל קבוצה ניסויית של תאים.4 פלטות בעלות 96 בארות טוענות 200 µL של תמיסה לכל בארה. התחילו את תהליך הצביעה עם תמיסת נוגדן ראשוני שהוכנה טרי. לאחר מכן, כסו את הבארות עם param והדגרימו את התאים בהתאם למפרט הנוגדן לאחר מתן הנוגדן הראשוני.שטפו את התאים שלוש פעמים עם 5% FBS ב-PBS למשך 10 עד 15 דקות לכל שטיפה. לאחר שלושה שטיפות, העבירו את התאים לבאר עם תמיסת נוגדן שניוני. כסו בארות אלו ב-paraform.הדגרי את התאים למשך שעה ב-37 degrees Celsius ולאחר מכן שטפי שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן. לאחר השטיפה, העבירי את התאים השaliים (oocytes) למשקופיות זכוכית נקיות. את כל התאים השaliים בקבוצת ניסוי אחת מעבירים למשקופית בודדת.שאבו כל תמיסה עודפת ששימשה לקיבוע התאים והוסיפו מיד שמונה מיקרוליטרים של dappy המכיל תמיסת קיבוע. לאחר מכן, כסו אותם בזהירות עם זכוכית כיסוי כדי למנוע בועות אוויר או פגיעה בתאים. התאים הוזרקו במיקרו-הזרקה עם בקרת nonspecific או perrin irna. לאחר 17 שעות של תרבית, רוב הבקרות הגיעו לשלב מטאפאזה 2 והכילו כישורי מיטוזה מאורגנים עם כרומוזומים מסודרים. סימון של Perrin, המוצג בצבע אדום, היה בהיר ומרוכז בקטבי הכישור.התמלילים הושבתו בהצלחה, שכן לא זוהתה צביעת perrin בתאים שהוזרקו irna. רובB ציטות אלו נותרו במטאפאזה I והפגינו מבני כישפור לא מאורגנים עם כרומוזומים שאינם מיושרים. מספר רב התקדמו למטאפאזה II, אך גם הם הפגינו כישפורים משובשים.כעת אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן האיסוף וההזרקה המיקרוסקופית של תאי בייצית של עכבר עם siRNA ספציפי, ולאחר מכן ביצוע צביעה אימונוהיסטוכימית של תאים אלו לצורך ניתוח פלואורסצנטי של היווצרות וארגון ה-spindles. חשוב לזכור לעבוד במהירות ובזהירות רבה כדי לשמור על חיוניות ואיכות הבייציות.

meiotic-spindle-assessment-mouse-oocytes-sirna-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

Reproducibly לספור את המספרים של mRNAs ב oocytes בודדים, מולקולה בודדת RNA פלורסצנטיות באתרו הכלאה (RNA-דג) היה אופטימיזציה עבור תאים שאינם מחסידי. Oocytes נאספו, hybridized עם הגששים ספציפית התעתיק, לכמת באמצעות תוכנה כימות של התמונה.

השימוש יחיד מולקולה פלורסנט ב באתרו הכלאה (SM-דג) כדי mRNAs Quantify ו Localize ב Oocytes מאתר

אנו מספקים מיתאר של הפרוטוקול הקליני להערכת לא פולשנית של בגרות ביצה אנושית באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב.

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

למד הערכת הרכבת ציר מיוטי בביציות עכבר באמצעות השתקת mRNA בתיווך siRNA וניתוח אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני חלוקת כרומוזומים ובהבנת אנאפלואידיות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

גלה סרטונים נוספים