Name: יצירה אנושי דרוזופילה S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: חקור מנגנוני תיקון שגיאות בחלוקת תאים באמצעות שורת תאי Drosophila S2 רגישה למעכבי Kinesin-5. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקת המיטוזה ותהליכי תיקון שגיאות בקינטוכורים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לפטרישיה Wadsworth על המתנה של מבנה kinesin-5. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (5 R01 GM107026) לTJM ועל ידי מענק מחקר מס &#39;5-FY13-205 מהמצעד הפרוטות קרן לTJM, כמו גם תמיכה מקרן צ&#39;רלס ה&#39; הוד, Inc, בוסטון, מסצ&#39;וסטס. לTJM

1. תאי transfecting S2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ25 סנטימטר 2 בקבוק תרבית בעבר, להוסיף GFP-להביע טובולין α תאי S2 10 עד נפח סופי של 2 מיליליטר ב 100% confluency, ולאפשר להם חצי לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ ל כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהצלחת. Transfect 2 מיקרוגרם של Eg5-mCherry לבנות 11 עם 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר בתוספת 10% FBS (המכונה להלן בתקשורת של שניידר) וTransfection מגיב, בעקבות הפרוטוקול של היצרן. לאטום את הצלחת עם Parafilm ו דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך 16-18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר. חזור תאים 25 ° C חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 לאחר transfection, להעביר 500 μl של תאי transfected לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה 35 מ&quot;מ המכילה 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לאינדוקצית מבחן. לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO </sub&gt; לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. חותם את הצלחת בParafilm ולדגור על 25 מעלות CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip כדי להפוך coverslips מצופה concanavalin, מספיק נפח פיפטה של concanavalin פתרון (0.5 מ&quot;ג / מיליליטר מומס בH 2 O) למעייל חומצה שטפה, להסיר את העודפים, ולאפשר את coverslip לייבוש באוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip מצופה concanavalin x 22 מ&quot;מ 22 מ&quot;מ בצלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה, אז זרע 500 μl ב 100% confluency של התאים המושרה על coverslip ולאפשר לתאים לדבוק במשך שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק לביטוי Eg5-mCherry, להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי הדמיה מתאימים) עם תקשורת להדמיה ב RT על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שימוש במקורות אור מתאימים ומערכות סינון לדמיין את התאים. לדוגמא, יש מיקרוסקופ השתמש במחקר זה מקור LED לבן אור וEGFP (FITC / Cy2) וDsRed (TRITC / Cy3) קוביות מסנן. Eg5-mCherry localizes לmicrotubules ומועשר Neaקטבי כישור r. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שווידאת כי התאים מביעים שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, להעביר את שארית תאי transfected, uninduced לבקבוק תרבות 2 רקמה 25 סנטימטרים המכיל 4 מיליליטר של התקשורת של שניידר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם / מיליליטר לבקבוק של תאי transfected ולהמשיך פיצול בנוכחות של 25 מיקרוגרם / מיליליטר Blasticidin S HCl עד המוות של תאים מפסיק להיות בטוח כדי לבדוק ביטוי של Eg5-mCherry מעת לעת. דגירה שורות תאים ב 25 מעלות צלזיוס חממה. הערה: אחוז התאים לבטא עליות Eg5-mCherry לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי transfected ביציבות, תמשיך לפצל בהעדר התרופה ולהקפיא 12 תאים לשימוש עתידי. </li></ol> הפרעת 2. RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר אזור נ&quot;ב ~ 500 של Klp61F מcDNA (LD15641) באמצעות פריימר עם רצף הוסיף אמרגן T7 (רצף שנקבע בחומרי רשימה) להיותמשמש כתבנית לסינתזת dsRNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ארבע תגובות PCR, 50 μl כל, המכילות DNA של תבנית 100 ng, 25 מיקרומטר של כל צבע יסוד, מאגר מתאים, ופולימראז. הגדר את פרוטוקול ה- PCR על thermocycler על פי הפרוטוקול של היצרן של פולימראז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה וארבע תגובות נקיות PCR באמצעות PCR לנקות ערכה על פי הפרוטוקול של היצרן. אחסן את התבנית נקייה ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן RNA גדילים הכפול (dsRNA) מתבנית בעזרת ערכת שעתוק RNA T7, הבאים להוראות היצרן. מצפה ~ ריכוז 5-15 מ&quot;ג / מיליליטר של dsRNA. אחסן dsRNA ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למציאת Klp61F עם dsRNA, מאפשר לתאים S2 להביע Eg5-mCherry בconfluency 25% ללמחצה לדבוק בתחתית צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ לשעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהמנות ולהוסיף 5 מיקרוגרם של dsRNA נגד Klp61F (דרוזופילה kinesin-5) מדולל ל1 מיליליטר של שניידר סרום ללא &#39;תקשורת של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על RT עבור שעה 1, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של התקשורת של שניידר עם 10% FBS. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר טיפול dsRNA, לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת 4 CuSO לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. דגירה תאים ב 25 מעלות צלזיוס במשך שעה עוד 24. </li></ol> 3. הדמיה של תא חי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslip מצופה לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ&quot;מ נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של התאים שטופלו בdsRNA ומושרה O / N על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק כ 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את coverslip לתא ורד (או כלי מתאים) להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תאי mitotic להביע שתי Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. הערה: תאי mitotic להביע GFP-α-טובולין רק צריך צירים monopolar מאז Klp61F, אשר נדרש לדו-קוטבי ציר, הוא הפיל 10,13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף תמונות של צירים דו קוטביים (למשל, 1 מסגרת לדקה) זמן לשגות בתאים המבטאים את שני Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הדמיה, להסיר את המדיה מתא הוורד, ולהחליף אותו בתקשורת של שניידר מכילה STLC 1 מיקרומטר מעל 3 חילופים רצופים תקשורת (~ 5 מיליליטר סה&quot;כ) לתוך התא לדמיין קריסת ציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכישלון התרופה ולהפוך את קריסת הציר, להסיר בזהירות את התקשורת המכילה STLC מתא הוורד, ולשטוף בתקשורת של שניידר 4x (סה&quot;כ 6-8 מיליליטר) לפני מילוי תא הוורד בפעם האחרונה עם תקשורת טרי. תמשיך הדמיה. </li></ol> Assay תיקון 4. שגיאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 22 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ concanavalin coverslips מצופה לתרבות מנות רקמה 35 מ&quot;מ נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 500 μl של תאים שטופלו בKlp61F dsRNA על coverslip המצופה concanavalin ולאפשר להם לדבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תאי adherאד, להוסיף 1.5 מיליליטר של התקשורת של שניידר לכל מנה להביא את הנפח הסופי עד 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעצור את התאים במיטוזה, להוסיף MG132 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר לכל אחד מהכלים, ודגירה עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף STLC 1 מיקרומטר דגירה עבור שעה 1 כדי לאפשר ליצירת מונופולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את STLC על ידי שטיפת coverslips פי 3 עם 2 מיליליטר של התקשורת של שניידר הטרי בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם התקשורת של שניידר, בנוסף לכל תרופות תרופתיות (למשל, מעכבי קינאז אורורה) או DMSO כביקורת. הערה: ריכוזי מונעי להשתנות וריכוזים סופיים נכונים צריכים להיקבע על ידי הנסיין. פתרונות מניות נעשים בדרך כלל כזה שהמעכב מדולל 1: 1,000 לתקשורת. במקרה זה דילול 1: 1000 של DMSO (או ממס מתאים) משמש כשליטה ברכב. אנו משתמשים ב מעכב אורורה Binucleine 2 בריכוז סופי של 40 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאי T בנקודתי זמן שונהo לבחון את ההתקדמות של היווצרות ציר דו קוטבית ולהעריך מדינות מצורפים kinetochore. לתקן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות לשטוף את coverslips עם 2 מיליליטר של 1x BRB-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים על ידי הוספת 2 מיליליטר של paraformaldehyde 10% בדילול מלא 1x BRB-80 במשך 10 דקות. paraformaldehyde Pipet זהירות במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize תאים עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 1% Triton-X במשך 8 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 3x עם 2 מיליליטר של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת coverslips תא-צד עם הפנים כלפי מעלה על גבי גיליון של Parafilm (השתמש סמן כדי לתייג Parafilm כראוי כדי לעקוב אחר השקופיות) בצלחת פטרי 150 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את coverslips עם 150 סרום μl מבושל חמור (BDS) ולדגור על RT עבור שעה 1 לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב. שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. כדי להפוך את תא הלחות, בשורה על שפת צלחת 150 מ&quot;מעם מעבדה רטובה לנגב ומכסה במכסת צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בלוק, ודגירת coverslips עבור שעה 1 ב RT עם 150 μl של נוגדנים עיקריים מדולל כראוי בBDS להכתים לkinetochores וmicrotubules לריכוזים סופיים של 2 מיקרוגרם / מיליליטר (או על פי המלצות יצרן) ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה . שימו לב: כאן, פרוטוקול הקיבעון ניתן לעצור המשיך להיות בשלב מאוחר יותר. ניתן לאחסן coverslips בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips במשך 30-60 דקות ב RT עם נוגדני fluorophore מצומדות המתאימים המשניים המדולל בBDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 3x עם 500 μl של 1x PBS + 0.1% Triton-X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה coverslips עם 150 μl של ה- BDS המכיל 1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI ריכוז סופי למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips 2x עם 1x PBS + 0.1% Triton-X, והר גoverslips צד תא על שקופית 3x1 &quot;עם 8 μl של ההרכבה תקשורת. צבע הפינות עם לק כדי לשתק את coverslips על גבי שקופיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה עם צירים דו קוטביים שמביעים Eg5-mCherry. קח סדרת Z בהיקף של 30 מטוסים במרווחים 0.2 מיקרומטר בכל הערוצים באמצעות מטרת 100X. לנתח בזהירות את kinetochores וmicrotubules כדי לקבוע את המדינות מצורפים (bioriented או קבצים מצורפים syntelic). </li></ol>

<ol><li>Cheeseman, I. M., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+kinetochore-microtubule+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 33-46 (2008).</li>
<li>Maresca, T. J., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+a+new+kind+of+tension%3A+translating+kinetochore+mechanics+into+a+wait-anaphase+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal.</a> J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).</li>
<li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146, 568-581 (2011).</li>
<li>Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+promotes+turnover+of+kinetochore+microtubules+to+reduce+chromosome+segregation+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors.</a> Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).</li>
<li>Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+improper+chromosome-spindle+attachments+during+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division.</a> Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).</li>
<li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).</li>
<li>Learman, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSC+622124+inhibits+human+Eg5+and+other+kinesins+via+interaction+with+the+conserved+microtubule-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site.</a> Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).</li>
<li>Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+5-directed+compounds+inhibit+chimeric+kinesin-5+motors%3A+implications+for+conserved+allosteric+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms.</a> J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).</li>
<li>Maliga, Z., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+and+mutational+analysis+of+allosteric+Eg5+inhibition+by+monastrol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol.</a> BMC Chem Biol. 6, 2(2006).</li>
<li>Goshima, G., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+microtubule-based+motor+proteins+in+mitosis%3A+comprehensive+RNAi+analysis+in+the+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line.</a> J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).</li>
<li>Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Drosophila+cell-based+error+correction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Development of a Drosophila cell-based error correction assay.</a> Front Oncol. 3, 187(2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Drosophila+S2+cells+and+their+use+for+RNAi-mediated+loss-of-function+studies+and+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy.</a> Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+microtubule+dynamics+and+sliding+during+bipolar+spindle+formation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells.</a> Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nat Methods. 10, 957-963 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

חזותי תיקון שגיאות היא טכניקה רבת ערך כדי ללמוד את הצעדים כרוכים בתהליך תאי חשוב ומורכב זו. לשם כך, קבצים מצורפים שגויים נוצרים באמצעות מעכבים הפיכים, ותיקון שגיאות נצפה על כישלון של התרופה. assay זה היה במקור פותח באמצעות תאים בתרבית רקמת יונקים 5. עם זאת נוכחותם של מספר הגדול של kinetochores בסוגים רבים של תאי יונקים מודל מציבה אתגר בהתבוננות אירועי תיקון שגיאות בודדים. תאי תסיסנית S2 יש כמה כמו 4 זוגות של kinetochores, מה שהופך אותם שורת תאים עדיפה יותר להתבוננות תיקון שגיאות. עם זאת, חסרון עיקרי הוא שמעכבים רבים אינם יעילים בתאי תסיסנית S2. לפיכך, את היכולת ליצור שורת תאי תסיסנית S2 אנושית להביע kinesin-5 אנושיים מספקת כלי רב ערך כדי ללמוד תיקון שגיאות. למרות שתאי תסיסנית S2 יכולים להיותשורת תאים טובה יותר ללמוד תיקון שגיאות, השלבים המרובים הכרוכים בהשגת שורת התאים ודריסת גנים חיוניים מציבה כמה אתגרים לטכניקה זו. לדוגמא, יעילות transfection יכולה להיות נמוכה למדי. אם פחות מ -20% מהתאים המבטאים את Eg5-mCherry, transfection יש לחזור כתהליך הבחירה ייקח זמן רב יותר. כמו כן, אחוז תאי המבטאים שני חלבוני הניאון עלול להפחית לאורך זמן. זה ניתן להתגבר על ידי פיצול תאים בנוכחות Blasticidin S HCl וhygromycin B כדי לבחור עבור תאים לבטא Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, בהתאמה. כמו כן, חשוב לשים לב שיש לי תאי תסיסנית S2 orthologues לחלבונים רבים ואנושיים; לכן, זה קריטי, כדי לייעל את התנאים למציאת החלבונים אנדוגניים. תנאי מציאה אופטימליים עשויים להשתנות בסך של dsRNA ומשך טיפול. בהתחשב בהופעתה והשיפור המהיר של CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, דור של שורת תאי תסיסנית עם גן Klp61F הוחלף על ידי Eg5 אדם מציג חלופה רבת עוצמה שהיה להתגבר על המגבלות של transfection וגישת מציאה. העבודה שלנו מוכיחה כי לטוס לאדם החלפת גן צריך להיות אפשרות מעשית במקרה זה למרות שהחומרים כימיים הדרושים כדי לעשות זאת בתאי תסיסנית S2 כרגע בשלבי פיתוח. הליך זה אינו מוגבל לEg5, אבל יכול להיות מיושם ללמוד את הפונקציה של חלבונים אחרים בעלי עניין. אם באמצעות מעכבים שהעבר הוקם כדי להיות יעיל בתאי תסיסנית S2, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של מעכבים בתאים חיים חששות לגבי השפעות היעד בלי. שורת התאים הופקה באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם בהקרנת תפוקה גבוהה מנתח לזהות תרופות פוטנציאליות מיקוד חלבונים מעורבים בתיקון שגיאות.

הפרדה שווה של הגנום בעת חלוקת תא דורשת אינטראקציות נכונות בין microtubules DNA והציר המשוכפל. Microtubules אינטראקציה פיזי עם הכרומוזומים באמצעות הרכב של חלבונים שמרכיב בcentromeres הידוע כkinetochore 1. הפצה נכונה של הכרומוזומים דורשת שkinetochores אחותם bioriented, שבו כל אחות קשורה microtubules מקורם קטבי ציר הפוכים. microtubule Kinetochore (KT-MT) קבצים מצורפים שאינם בקונפורמציה bioriented הם ערערו במהירות וביעילות כדי לספק את ההזדמנות להקים biorientation בתהליך המכונה תיקון שגיאות. Assay תיקון שגיאות שהוקם בעבר בתאי יונקים 5 דורש הרכבת צירים monopolar באמצעות מעכבי מולקולה קטנים הפיכים נגד Eg5 (kinesin-5). הטיפול התרופתי מייצר שפע של קבצים מצורפים syntelic שגויים שבבוטkinetochores אחות h לצרף לאותו מוט הציר. כישלון הבא של התרופה מאפשר להדמיה של תהליך תיקון השגיאות. Assay תיקון שגיאות יכול להיעשות בנוכחות של מעכבי מולקולה קטנים או knockdowns ללמוד את התרומה של חלבוני מועמד לתיקון קבצים מצורפים KT-MT שגויים. היכולת לדמיין תיקון שגיאות בתאים חיים היא כלי רב עוצמה כדי להבין את המנגנון המולקולרי מעורב בתהליך מורכב זה עוד יותר. עם זאת, המספר הגדול של כרומוזומים קיימים ברוב שורות תאים מציב אתגר בהתבוננות קבצים מצורפים KT-MT בודדים. תאי תסיסנית S2 יהיו אידיאליים ליישום assay תיקון שגיאות כפי שהם מכילים כמה כמו 4 כרומוזומים 6, אבל מעכבי מולקולה קטנים של kinesin 5 כגון S-trityl-L-ציסטאין (STLC) וmonastrol 7-9 אינו משפיע על הרכבה ציר או kinesin-5 תפקוד מוטורי בתאי תסיסנית. לכן אנו generaטד שורת תאי תסיסנית S2 להביע kinesin-5 האדם תחת אמרגן מושרה שהוא רגיש לkinesin-5 מעכבים. פרוטוקול זה מתאר כיצד מציאה homologue תסיסנית kinesin-5 אנדוגני, Klp61F, ולהשתמש בקו זה התא בassay תיקון שגיאות מבוססי התאים.

<table><tbody><tr><td>מגיב טרנספקציה אפקטיבי</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Klp61F cDNA</td><td>Drosophila Genomic Resource Center</td><td>13690</td><td>שם הגן LD15641</td></tr><tr><td>שניידר' s Media</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מאושר</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>מומת בחום, נחושת</td></tr><tr><td>(II) סולפט ממקור אמריקאי (CuSO4)</td><td>Sigma</td><td>C8027-500G</td><td>500&nbsp; מלאי</td></tr><tr><td>mM S-trityl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>164739-5G</td><td>1&nbsp; מלאי mM ב DMSO</td></tr><tr><td>Blasticidin HCl</td><td>Invitrogen</td><td>R21001</td><td>5&nbsp; מלאי מ"ג/מ"ל ב-1x PBS</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>T7 מערכת ייצור RNA בקנה מידה גדול</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td>ריכוז ה-dsRNA המשוער מכל תגובה הוא כ-5-15&nbsp; ומיקרו; g/&micro; l</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi F פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTAAAA</td></tr><tr><td>Klp61F RNAi R פריימר</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC</td></tr><tr><td>PCR ערכת ניקוי</td> Mo <td>Bio Laboratories, Inc</td><td>1250</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td>0.5&nbsp; תמיסת מ"ג/מ"ל המיוצרת על ידי המסה ב-1x PBS.</td></tr><tr><td>סרום חמור מבושל</td><td>Jackson ImmunoResearch Labs</td><td>017-000-121</td><td>תמיסת מלאי 5% במאגר PHEM 1x, מביאים את התמיסה לרתיחה. מאוחסן ב-4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr>מדיה <td></td><td></td><td>הרכבה</td><td>20&nbsp; מ"מ טריס pH 8.0,&nbsp; 0.5% N-פרופיל גלאט, 90% גליצרול. מאוחסן ב-4&nbsp; &deg;C.</td></tr><tr><td>1x צינורות BRB-80</td><td></td><td></td><td>80 מ"מ pH 6.9; 1&nbsp; מ"מ EGTA; 1 mM MgCl2</td></tr><tr><td>White אור מקור</td><td>Lumencor Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET EGFP קוביית מסנן</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td></td></tr><tr><td>DSRed קוביית מסנן</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-NDC80 נוגדן&nbsp;</td><td></td><td></td><td>מיוצר בהתאמה אישית על ידי Maresca Lab</td></tr><tr><td>DM1&alpha; (אנטי-אלפא;-טובולין)</td><td>Sigma</td><td>T6199</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד CID</td><td>AbCam</td><td>ab10887</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; s2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של kinesin-5

Generating a &#34;Humanized&#34; Drosophila S2 Cell Line Sensitive to Pharmacological Inhibition of Kinesin-5

קינטוכורים הם מבנים גדולים מבוססי חלבון המורכבים על צנטרומרים במהלך חלוקת התא ומקשרים כרומוזומים למיקרו-צינורות ציר. פיזור נכון של החומר הגנטי דורש שהקינטוכורות האחיות בכל כרומוזום יהפכו לדו-כיווניות על ידי היצמדות למיקרו-צינורות מקטבי ציר מנוגדים לפני שהם מתקדמים לאנאפאזה. עם זאת, מצבי התקשרות שגויים ולא דו-כיווניים הם נפוצים וקיימים מסלולים תאיים כדי לזהות ולתקן התקשרויות כאלה במהלך חלוקת התא. התהליך שבו אינטראקציות קינטוכור-מיקרו-צינוריות לא תקינות מתערערות מכונה תיקון שגיאות. כדי לחקור תיקון שגיאות בתאים חיים, חיבורים שגויים נוצרים בכוונה באמצעות עיכוב כימי של מנוע קינזין-5, מה שמוביל להרכבת ציר חד קוטבי, והמעבר מאוריינטציה לא נכונה לדו-כיוון נצפה לאחר שטיפת תרופות. המספר הגדול של כרומוזומים בסוגים רבים של תאי תרבית רקמה מהווה אתגר בהתבוננות באירועי תיקון שגיאות בודדים. דרוזופילה תאי S2 הם נושאים טובים יותר למחקרים כאלה מכיוון שיש להם רק 4 זוגות כרומוזומים. עם זאת, מעכבי קינזין-5 של מולקולות קטנות אינם יעילים נגד דרוזופילה קינזין-5 (Klp61F). כאן אנו מתארים כיצד לבנות קו תאי דרוזופילה שמחליף ביעילות את Klp61F בקינזין-5 אנושי, מה שהופך את התאים לרגישים לעיכוב פרמקולוגי של המנוע ומתאימים לשימוש בבדיקת תיקון שגיאות מבוססת תאים.

Klp61F נדרש כדי ליצור צירים דו קוטביים. Kinesin-5 האנושי, Eg5, יכול להציל את הפונקציה של Klp61F בתאי תסיסנית S2 (איור 1 א ו- D). עם תוספת של מעכב 5 kinesin (STLC), רמות microtubule הקשורים לירידה המוטורית (איור 1 ו- E), וקריסת הציר, וכתוצאה מכך מונופול (איור 1 ג וF) בתאים חסרי Klp61F אנדוגני על RNAi המוצלח (סרט נוסף 1). ראוי לציין כי צירים דו קוטביים יקרסו על תוספת של STLC בתאים אנושי S2 כי kinesin-5 פעילות אינה נדרשת לשמור על דו-קוטבי ציר בתאים אנושיים. פער זה עשוי להיות מעניין תוצאה מהבדלים בחפיפת microtubule interpolar ו / או יציבות במערכות מודל שני 14. ניתן Reve (איור 2 א ו- E) Kinesin-5 עיכוב<html> rsed על ידי שטיפה את התרופה וההתאוששות של ציר דו קוטבי ניתן בעקבות לאורך זמן. עם הסרת המעכב (איור 2 ו- F), Eg5-mCherry מחדש מקורבים עם microtubules כמרכיב ציר דו קוטבי (איור 2C ו- G), ותאים יכולים להתקדם לanaphase דו קוטבית (איור 2 ד ו H, סרט נוסף 2 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig1.jpg" /> איור 1. תוספת של STLC 1 מיקרומטר מוביל לצירי monopolar בתאי תסיסנית S2. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (AC) וה- GFP-α-טובולין (DF) בתוספת של 1 מיקרומטר STLC. Eg5 המעכב נוסף בבית 3 דקות. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת = דקות: שניות.<html> &quot;Target =&quot; _ w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594fig2.jpg" /> איור 2. רפורמות ציר דו קוטביות עם הסרת STLC. נציג תמונות מהזמן לשגות הדמיה של תא תסיסנית 2 להביע Eg5-mCherry (AD) וה- GFP-α-טובולין (EH) במהלך ניסוי כישלון STLC. STLC היה דהוי ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת STLC. בר סולם = 5 מיקרומטר. חותמת: דקות:. שניות <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="סרט 1" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov1.jpg" /> &quot;Target =&quot; _ ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov blank &quot;&gt; סרט נוסף 1. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד). הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry ( משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). STLC 1 מיקרומטר התווסף ב -2 דקות, וצורות ציר מונופול בתוך 10 דקות לאחר תוספת של המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשנייה. בר סולם = 5 מיקרומטר. <img alt="סרט 2" src="/files/ftp_upload/53594/53594mov2.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53594/washout.mov" target="_blank">סרט נוסף 2. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).</a> הדמיה הקרינה Widefield של דוגמא מייצגת של תא תסיסנית S2 להביע Eg5-mCherry (משמאל) וה- GFP-α-טובולין (מימין). ומדיה המכילה STLC 1 מיקרומטר הוסרהלשטוף ב5 דקות. רפורמות ציר דו קוטביות בתוך שעה 1 של הסרת המעכב. תמונות נרכשו כל 1 דקות ושיחקו בקצב של 10 פריימים לשניה. בר סולם = 5 מיקרומטר.

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור קו תאים של דרוזופילה S2 הרגיש למעכבי מולקולות קטנות של קינזין-5. מתואר גם השימוש בתאים אלה בבדיקת תיקון שגיאות מבוססת תאים.

יצירה &quot;אנושי&quot;<em&gt; דרוזופילה</em&gt; S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא ליצור שורת תאי Drosophila S2 הרגישה למעכבים של מולקולות קטנות של מנוע Kinesin-5, כדי שניתן יהיה להשתמש בהם לחקר תיקון שגיאות. תיקון שגיאות במהלך חלוקת התא הוא תהליך שבו אינטראקציות שגויות בין הקינטוכור למיקרוטובוליים destabilized, כדי להעניק לתא הזדמנות שנייה, או אפשרות נוספת, ליצור חיבורים תקינים כך שהגנום יוכל לעבור הפרדה נכונה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, הקשורות לתהליך תיקון השגיאות.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בקו תאים של Drosophila S2, בעל מספר כרומוזומים נמוך יותר ורגישות למעכב Kinesin-5, שניהם מקלים על ויזואליזציה של אירועי תיקון שגיאות בודדים. החל מבקבוק ריבועי של 25 סנטימטר שבו תורגשו תאי S2 המבטאים GFP-Alpha Tubulin ב-100% confluence, העבר שני מיליליטר של התרבית לצלוחית של 35 מילימטר. לאחר מכן, הדגר את התאים בטמפרטורת החדר למשך כשעה אחת עד להיצמדות חלקית.הסיר את המצע מהצלחת, והוסף מיליליטר אחד של מצע Schneider, מועשר ב-FBS, יחד עם שני מיקרוגרם של מבנה ה-Eg5-mCherry וחומר טרנספקציה כדי לבצע טרנספקציה לתאים בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש ב-Parafilm כדי לאטום את הצלחת, והדגר את התאים בטמפרטורה של 25 °C למשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מצע Schneider והחזר את התאים לאינקובטור.ביום השלישי לאחר הטרנספקציה, העבירו 500 microliters של תאים שעברו טרנספקציה לכלי תרבית רקמה חדש של 35 millimeter המכיל 1.5 milliliters של מצע Schneider's לצורך השראת בדיקה. כדי להשרות את הביטוי של Eg5-mCherry, הוסיפו נחושת גופיתית (copper sulfate) עד לריכוז סופי של 500 micromolar. אטמו את הכלי ב-Parafilm והדגירו בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך הלילה.הנח כיסוי זכוכית מצופה Concanavalin A בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר, שהוכן מראש, בתוך צלחת תרבית רקמות נקייה בקוטר 35 מילימטר. לאחר מכן, זרע 500 microliters של תאים מושריים בהתמזגות (confluent) של 100% על כיסוי הזכוכית, ואפשר לתאים להיצמד בטמפרטורת החדר. כדי לבדוק את ביטוי ה-Eg5-mCherry, הרכב את כיסוי הזכוכית בתוך תא רוז (rose chamber) עם מצע, ובצע דגימה תמונית בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, בהתאם להנחיות בפרוטוקול הכתוב.לאחר וידוא שהתאים מבטאים הן Eg5-mCherry והן GFP alpha tubulin, העבירו את שאר התאים שעברו טרנספקציה וטרם עברו השראה לבקבוק תרבית רקמות ריבועי של 25 סנטימטר, המכיל ארבעה מיליליטר של Schneider's medium. הוסיפו לבקבוק Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 micrograms per milliliter, והמשיכו בפיצול התאים בנוכחות Blasticidin S HCL עד שמות התאים יחדל. לאחר הכנת RNA דו-גדילי של KLP61F בהתאם לפרוטוקול הכתוב, זרעו תאי S2 המבטאים Eg5-mCherry לצלחית תרבית של 35 מילימטר במשרה של 25%confluency, והמתינו שעה אחת להצמדתם.הסיר את המצע מהצלחות והוסף מיליליטר אחד של מצע Schneider ללא סרום לחמישה מיקרוגרם של KLP61F RNA דו-גדילי. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, הוסף מיליליטר אחד של מצע Schneider עם 10%FBS. דגור את התאים ב-25 °C.24 שעות לאחר הטיפול ב-dsRNA, עוררו את הביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת נחושת גופרתית (copper sulfate) לריכוז סופי של 500 micromolar. דגרו את התאים בטמפרטורה של 25 degrees Celsius למשך 24 שעות נוספות. לצורך ביצוע דימוי של תאים חיים, הניחו כיסוי זכוכית (cover slip) מצופה ב-Concanavalin A בגודל 22 millimeter על 22 millimeter לתוך צלחת תרבית רקמות נקייה בקוטר 35 millimeter.זריעו 500 µL של תאי dsRNA שעברו השראה למשך לילה על לביש של זכוכית (cover slip), והמתינו כשעה עד להיצמדותם. לאחר איסוף תמונות time-lapse של כישורי מעמסה דו-קוטביים (bipolar spindles) בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הסירו את המצע מתא הוורד (rose chamber) והוסיפו מצע Schneider המכיל 1 µM של STLC, והחליפו את מצע ה-STLC פעמיים נוספות, תוך השלכת המצע לאחר כל שטיפה, כדי להדגים את קריסת הכישור. כדי לשטוף את התרופה ולהביא להפיכה של קריסת הכישור, הסירו בזהירות את המצע המכיל STLC מתא הוורד והשליכו אותו למכל פסולת, והשתמשו בנפח כולל של 6 עד 8 mm של מצע Schneider כדי לשטוף את התאים ארבע פעמים, תוך השלכת המצע לאחר כל שטיפה.לאחר מכן, הוסף מצע טרי כדי למלא מחדש את התא, והמשך בדימות. כדי לגשת למצע לצורך שטיפת התרופה או הסרתה, הסר בזהירות את כיסוי הזכוכית העליון מתא הוורד בעודו מקובע למיקרוסקופ. לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת פטרי עם תחתית זכוכית שטופלה ב-Concanavalin A בדומה לכיסויי הזכוכית, לצורך דימות תאים חיים.לאחר זריעה של 500 microliters של תאי S2 שטופלו ב-KLP61F dsRNA על ליתסית Concanavalin A והמתנה להיצמדות התאים, יש להוסיף 1.5 milliliters של מצע Schneider's כדי להביא את הנפח הסופי לשני milliliters. ברגע שהתאים נעצרו בשלב המיטוזה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש להוסיף one micromolar STLC ולדגור למשך שעה אחת כדי לאפשר היווצרות של monopoles. יש לשטוף את ה-STLC באמצעות שני milliliters של מצע Schneider's טרי לשטיפת הליתסית שלוש פעמים.כדי לקבע את התאים בנקודות זמן שונות של היווצרות כישוף דו-קוטבי (bipolar spindle), ולהעריך את אתרי ההיצמדות של הקינטוצ'ור, התחל בשטיפה מהירה של לביבות הזכוכית (cover slips) באמצעות שני מיליליטר של 1X BRB80. במנדף כימי, הוסף שני מיליליטר של 10% PFA ב-1X BRB80, והדגר למשך 10 דקות. לאחר מכן, כדי לבצע חדירות (permeabilization) לתאים, הוסף 1% Triton X ב-1X PBS והדגר למשך 10 דקות.לאחר מכן, השתמש בשני מיליליטר של 0.1% Triton X ב-1X PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן, העבר את הזכוכית של כיסוי הלמינה, כאשר הצד של התאים פונה כלפי מעלה, על גבי יריעת Parafilm בתוך צלחת פטרי של 150 מילימטר. הוסף 150 מיקרוליטר של סרום חמור מורתח, או BDS, לכיסויי הלמינה, והדגר בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת כדי לחסום קישור לא ספציפי של נוגדנים.לאחר הדגירה, הוצא את הבלוק והוסף 150 µL של נוגדנים ראשוניים שהוכנו בהתאם לפרוטוקול הכתוב, לפני דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר שטיפת לביות הזכוכית שלוש פעמים, הוסף נוגדנים משניים המצומדים ל-Fluoro-4 ומדוללים ב-BDS, ודגור בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר שטיפת לביות הזכוכית שלוש פעמים, דגור אותן עם 150 µL של BDS, המכיל 1 µg/mL של DAPI, למשך חמש דקות.לאחר שכיסויות הזכוכית נשטפו פעמיים, השתמשו ב-8 µL של מדיום קיבוע (mounting medium) כדי לקבע את הדגימה, כאשר צד התאים פונה כלפי מטה, על זכוכית נושאת בגודל 3x1 אינץ'. השתמשו בלק גוף כדי לצבוע את הפינות. לבסוף, השתמשו בעדשה אובייקטיבית 100X כדי לדמות תאים בעלי כישורי בטן דו-קוטביים המבטאים Eg5-mCherry.בצעו סריקת Z series, המורכבת מ-30 מישורים במרווחים של 0.2 micrometer בכל הערוצים. נתחו בקפידה את הקינטוכולור ואת המיקרוטובולים כדי לקבוע את מצב ההצמדה. KLP61F נחוץ ליצירת כישורים דו-קוטביים (bipolar spindles) בתאי Drosophila S2; עם זאת, מעכבים של Kinesin-5 שהם מולקולות קטנות אינם יעילים נגדו.תמונות אלו מראות כי Kinesin-5 Eg5 אנושי יכול לשקם את התפקוד של KLP61F בתאי Drosophila S2. כאשר מוסיפים את מעכב ה-Kinesin-5, STLC, הרמות של המנוע המקושרות למיקרוטובוליים יורדות, והכישס קורס, מה שמוביל להיווצרות של מונופול בתאים שחסר בהם KLP61F אנדוגני כתוצאה מ-RNA I מוצלח. איור זה מדגים כי ניתן להפוך את עיכוב ה-Kinesin-5 על ידי שטיפת התרופה, וניתן לעקוב אחר התאוששות של כישס ביפולרי לאורך זמן. עם הסרת המעכב, Eg5-mCherry נקשר מחדש למיקרוטובוליים, והתאים יכולים להתקדם לאנפאזה ביפולרית.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן יצירת שורת תאי Drosophila S2 הרגישה למולקולה קטנה המעכבת Kinesin-5. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשיש שש שעות, במידה ותבוצע כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לתכנן מראש, שכן שיטה זו דורשת הכנה מספר ימים לפני תחילת העבודה.אל תשכחו כי עבודה עם מעכבים של מולקולות קטנות עלולה להיות מסוכנת, לכן יש להרכיב כפפות תמיד. ניתן להוכיח בנייה של תאי זבוב פירות אנושיים באמצעות יישום של טכנולוגיות Crispr-Cas 9, והחלפה של ה-Drosophila Kinesin-5 במקבילו האנושי. פיתוח של תאי Drosophila אנושיים אמור לקדם את הבנתנו לגבי תיקון שגיאות ותהליכים תאיים חיוניים אחרים בעתיד.

generating-humanized-drosophila-s2-cell-line-sensitive-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תסיסנית שניידר (S2) הם תאים מערכת פופולרי יותר ויותר על גילוי וניתוח פונקציונלי של גנים. המטרה שלנו היא לתאר כמה טכניקות להפוך תאים מיקרוסקופיים S2 כגון מערכת ניסיונית חשוב יותר ויותר.

הכנת תסיסנית תאים S2 עבור במיקרוסקופ אור

זהו פרוטוקול לבודד אורך פעיל kinesin...

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

בעת צביעת דיסקים דמיוניים של דרוזופילה, לעיתים קרובות מתבצעת דיסקציה גסה בה הדיסקים חשופים אך נשארים מחוברים לגוף. לאחר המוכתמים, הדיסקים המעניינים מבודדים ומורכבים. הפרוטוקול לדוגמה מדגים הליך לדיסקציה והרכבה של דיסק דמיוני בכנף.

דרוזופילה דיסקציה דמיונית של הזחל: שיטה להתבוננות בהתפתחות אפיתליה

פרוטוקול זה מתאר את הנתיחה והטיפוח של אשכים שלמים וציסטות בקו הנבט מגלמים של Drosophila melanogaster. שיטה זו מאפשרת תצפית מיקרוסקופית על זרע הזרע ex vivo. יתר על כן, אנו מתארים בדיקה פרמקולוגית של השפעת המעכבים על שלבים ספציפיים של התפתחות תאי נבט באשכים גולמים.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

ניתוח פסיפס משוכפל ב תסיסנית הדיסק epithelia הדימוי הוא מודל מודל חזק ללמוד את המנגנונים הגנטיים והתאים של tumorigenesis. כאן אנו מתארים פרוטוקול כדי לגרום לגידולים בדיסקופיית כנף תסיסנית באמצעות מערכת GAL4-UAS, ולהציג שיטת אבחון לסווג את פנוטיפים הגידול.

אינדוקציה ואבחון של גידולים ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; אפיתלציה דיסק Imaginalia

כאן, אנו מציגים שיטה ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי החלפת את אקסון קידוד הראשון של גנים עם מנהלי התקנים של שעתוק. השיטה מבוססת על CRISPR/Cas9 ממקם את רצף transactivator תחת ויסות גנים הוחלף אנדוגני, כתוצאה מכך ומקילה על ההתבטאות transctivator באופן בלעדי בדפוסי ייתכן גנים ספציפיים.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות גישה גנטית הקדמי למסך עבור מוטציות המציגות ניוון נוירוזוסופילה מלאנוגסטר. היא משלבת שיטת טיפוס, ניתוח היסטולוגיה, מיפוי גנים ורצפי דנ א בסופו של דבר לזהות גנים חדשניים הקשורים לתהליך של הגנה עצבית.

ב Vivo Forward המסך הגנטי כדי לזהות גנים נוירוגינים הרומן ב Drosophila ילה melanogaster

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

ניתוח מחזור התא עם תיוג 5-אתניל-2'-deoxyuridine (EdU) ו פוספו-histone H3 (pH3) הוא הליך רב-שלבי שעשוי לדרוש אופטימיזציה נרחבת. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את כל השלבים עבור הליך זה כולל ניתוח תמונה וכימות כדי להבחין בין תאים בשלבי מחזור תאים שונים.

5-אתניל-2'-Deoxyuridine/Phospho-Histone H3 פרוטוקול תיוג כפול לניתוח התקדמות מחזור התא בתאי גזע עצביים Drosophila

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

חקור מנגנוני תיקון שגיאות בחלוקת תאים באמצעות שורת תאי Drosophila S2 רגישה למעכבי Kinesin-5. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של דינמיקת המיטוזה ותהליכי תיקון שגיאות בקינטוכורים.

יצירה "אנושי"

גלה סרטונים נוספים