יצירה "אנושי" דרוזופילה S2 שורת תאים רגיש לתרופתי עיכוב של Kinesin-5

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור קו תאי דרוזופילה S2 הרגיש למעכבי מולקולות קטנות של מנוע קינזין-5, כך שניתן יהיה להשתמש בהם לחקר תיקון שגיאות. תיקון שגיאות במהלך חלוקת התא הוא תהליך שבו אינטראקציות שגויות של קינטוכור ומיקרו-צינוריות מתערערות, כדי לתת לתא הזדמנות שנייה, או הזדמנות אחרת, ליצור חיבורים נאותים כך שניתן יהיה להפריד את הגנום כראוי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של התא, הקשורות לתהליך תיקון שגיאות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים להשתמש בקו תאים של דרוזופילה S2 שיש להם פחות כרומוזומים, ורגישים למעכב קינסין-5, שניהם מאפשרים הדמיה של אירועי תיקון שגיאות בודדים. החל מבקבוק מרובע של 25 סנטימטר מתורבת בעבר של 100% GFP-אלפא טובולין המבטא תאי S2, העבירו שני מיליליטר מהתרבית לצלחת של 35 מילימטר. לאחר מכן, דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך כשעה כדי להיצמד למחצה.

מוציאים את המדיום מהצלחת, ומוסיפים מיליליטר אחד של המדיום של שניידר, בתוספת FBS, לשני מיקרוגרם של מבנה Eg5-mCherry ומגיב טרנספקציה כדי להעביר את התאים בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש בפרפילם כדי לאטום את הצלחת, ודגירה על התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד מהמדיום של שניידר ומחזירים את התאים לחממה.

ביום השלישי לאחר הטרנספקציה, העבירו 500 מיקרוליטר של תאים שעברו טרנספטציה לצלחת תרבית רקמה חדשה בגודל 35 מילימטר המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום שניידר לזירוז בדיקה. כדי לגרום לביטוי של Eg5-mCherry, הוסף נחושת גופרתית לריכוז סופי של 500 מיקרומולר. אוטמים את המנה בפרפילם ודוגרים בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

מניחים החלקת כיסוי מצופה בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר שהוכנה בעבר בצלחת תרבית רקמה נקייה בגודל 35 מילימטר. לאחר מכן זרעו 500 מיקרוליטר של התאים המושרים ב-100% על החלקת הכיסוי, ואפשרו לתאים להיצמד בטמפרטורת החדר. כדי לבדוק את ביטוי Eg5-mCherry , הרכיבו את החלקה לתוך תא ורדים עם מדיום ותמונה בטמפרטורת החדר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, על פי ההנחיות בפרוטוקול הטקסט.

לאחר שווידאתם שהתאים מבטאים גם Eg5-mCherry וגם GFP אלפא טובולין, העבירו את שארית התאים הלא מושרים לבקבוק תרבית רקמה בגודל 25 סנטימטר מרובע, המכיל ארבעה מיליליטר של מדיום שניידר. הוסיפו לבקבוק Blasticidin S HCL בריכוז סופי של 25 מיקרוגרם למיליליטר, והמשיכו לפצל את התאים בנוכחות Blasticidin S HCL עד להפסקת מוות התאים. לאחר הכנת RNA דו-גדילי KLP61F על פי פרוטוקול הטקסט, זרעו תאי S2 המבטאים Eg5-mCherry לכלי תרבית של 35 מילימטר במפגש של 25%, ואפשרו להם להיצמד למשך שעה.

מוציאים את המדיום מהכלים ומוסיפים מיליליטר אחד של מדיום שניידר ללא סרום לחמישה מיקרוגרם של RNA KLP61F דו-גדילי. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה, הוסף מיליליטר אחד של מדיום שניידר עם 10% FBS. דגרו על התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.

24 שעות לאחר הטיפול ב-dsRNA, לגרום לביטוי של Eg5-mCherry על ידי הוספת נחושת גופרתית לריכוז סופי של 500 מיקרומולר. דגרו על התאים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות. כדי לבצע הדמיית תאים חיים, הנח החלקת כיסוי מצופה Concanavalin A בגודל 22 מילימטר על 22 מילימטר לתוך צלחת תרבית רקמה נקייה של 35 מילימטר.

זרעו 500 מיקרוליטר של תאים שטופלו ב-dsRNA שהושרו במהלך הלילה על החלקת הכיסוי, ואפשרו להם להיצמד למשך כשעה. לאחר איסוף תמונות זמן-lapse של צירים דו קוטביים על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את המדיום מתא הוורדים והוסף את המדיום של שניידר המכיל STLC מיקרו-מולרי אחד והחלף את מדיום STLC פעמיים נוספות, והשליך את המדיום לאחר כל שטיפה כדי לדמיין את קריסת הציר. כדי לשטוף את התרופה ולהפוך את קריסת הציר, הסר בזהירות את המדיום המכיל STLC מתא הוורדים והשליך אותו למיכל פסולת, והשתמש ב-6 עד 8 מילימטרים בסך הכל של המדיום של שניידר כדי לשטוף את התאים ארבע פעמים, ולהשליך את המדיה לאחר כל שטיפה.

לאחר מכן לאחר הוספת מדיום טרי למילוי החדר, המשך בהדמיה. כדי לקבל גישה למדיום לשטיפת תרופות ושטיפה, הסר בזהירות את החלקת הכיסוי העליונה מתא הוורדים כשהיא מאובטחת במיקרוסקופ. לחלופין, צלחת פטרי עם תחתית זכוכית שטופלה ב-Concanavalin A בדומה להחלקות הכיסוי יכולה לשמש להדמיית תאים חיים.

לאחר זריעת 500 מיקרוליטר של תאי S2 שטופלו ב-KLP61F dsRNA על גבי החלקת כיסוי Concanavalin A ואפשרה לתאים להיצמד, הוסף 1.5 מיליליטר של המדיום של שניידר כדי להביא את הנפח הסופי לשני מיליליטר. לאחר שהתאים נעצרו במיטוזה על פי פרוטוקול הטקסט, הוסיפו STLC מיקרומולרי אחד ודגרו למשך שעה כדי לאפשר למונופולים להיווצר. שטפו את ה-STLC על ידי שימוש בשני מיליליטר של מדיום שניידר טרי כדי לשטוף את החלקות הכיסוי שלוש פעמים.

כדי לתקן את התאים בנקודות זמן שונות של היווצרות ציר דו קוטבי, ולהעריך אתרי הצמדה של קינטוכור, התחל בשימוש בשני מיליליטר של 1X BRB80 כדי לשטוף במהירות את החלקות הכיסוי. במכסה מנוע כימי, הוסף שני מיליליטר של 10% PFA ב-1X BRB80, ודגירה למשך 10 דקות. לאחר מכן, כדי לחדור לתאים, הוסף 1% טריטון X ב-1X PBS ודגירה למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש בשני מיליליטר של 0.1% טריטון X ב-1X PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. לאחר מכן, העבירו את פתק הכיסוי, כשצד התא פונה כלפי מעלה, על דף פרפילם בצלחת פטרי 150 מילימטר. הוסיפו 150 מיקרוליטר של סרום חמור מבושל, או BDS, להחלקות הכיסוי, ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

לאחר הדגירה יש להסיר את הגוש ולהוסיף 150 מיקרוליטר של נוגדנים ראשוניים שהוכנו על פי פרוטוקול הטקסט לפני הדגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר שטיפת הכיסוי מחליק שלוש פעמים, הוסיפו נוגדנים משניים מצומדים Fluoro-4 מדוללים ב-BDS ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 60 דקות. לאחר שטיפת פתקי הכיסוי נשטפה שלוש פעמים, דגרו אותם עם 150 מיקרוליטר BDS, המכילים מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI למשך חמש דקות.

לאחר מכן, לאחר שטיפת החלקות הכיסוי פעמיים, השתמש בשמונה מיקרוליטר של מדיום הרכבה כדי להרכיב את הדגימה, כשצד התא כלפי מטה, על שקופית של שלושה על אינץ '. השתמש בלק כדי לצבוע את הפינות. לבסוף, השתמש במטרה של פי 100 כדי לדמות תאים עם צירים דו קוטביים המבטאים Eg5-mCherry.

קח סדרת Z, המורכבת מ-30 מישורים במרווחים של 0.2 מיקרומטר בכל הערוצים. נתח בזהירות את הקינטוכור והמיקרו-צינורות כדי לקבוע את מצב ההתקשרות. KLP61F נדרש ליצירת צירים דו קוטביים בתאי Drosophila S2; עם זאת, מעכבי קינזין-5 של מולקולות קטנות אינם יעילים נגדו.

תמונות אלה מראות כי Kinesin-5 Eg5 האנושי יכול להציל את התפקוד של KLP61F בתאי Drosophila S2. כאשר מוסיפים את מעכב Kinesin-5, STLC, רמות הקשורות למיקרו-צינוריות של המנוע צונחות, והציר קורס, וכתוצאה מכך נוצר מונופול בתאים חסרי KLP61F אנדוגני כתוצאה מ-RNA I מוצלח.איור זה מדגים כי ניתן להפוך את עיכוב Kinesin-5 על ידי שטיפת התרופה, וניתן לעקוב אחר התאוששות של ציר דו קוטבי לאורך זמן. עם הסרת המעכב, Eg5-mCherry מתחבר מחדש למיקרו-צינורות, והתאים יכולים להתקדם לאנפאזה דו-קוטבית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור קו תאים של Drosophila S2 הרגיש למעכב מולקולה קטנה של Kinesin-5. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשש שעות, אם מבוצעת כראוי. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לתכנן מראש, מכיוון ששיטה זו דורשת הכנה מספר ימים מראש.

אל תשכח שעבודה עם מעכבי מולקולות קטנות עלולה להיות מסוכנת, אז תמיד ללבוש כפפות. ניתן להוכיח בניית תאי זבוב פירות אנושיים באמצעות יישום טכנולוגיות Crispr-Cas 9, והחלפת Drosophila Kinesin-5 על ידי מקבילו האנושי. פיתוח תאי דרוזופילה מואנשים אמור לקדם את ההבנה שלנו לגבי תיקון שגיאות ותהליכים תאיים חיוניים אחרים בעתיד.