משלוח בתיווך הפאג של ממוקדת Srna בונה להפיל Gene Expression ב E. coli

המטרה הכוללת של הליך זה היא להפיל גנים מעניינים באוכלוסייה הולכת וגדלה של E.coli. לעתים קרובות משתמשים בהפלות גנים כדי לחקור שאלות בסיסיות של תפקוד גנים. לשיטות אלה עשוי להיות יישום גם בביולוגיה סינתטית.

למשל, בהשתקת גנים לא רצויים כמו גורמי אלימות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה בתרביות אצווה של E.coli ללא שינוי גנטי קודם, עם תוצאות שניתן לראות רק לאחר מספר שעות. כדי להתחיל, באמצעות פלסמיד המכיל קלטת ביטוי sRNA שתוכננה על פי פרוטוקול הטקסט, בצע מוטגנזה מכוונת אתר ברצף על ידי זיהוי ראשון של רצף המדריך של 24 זוגות בסיסים בקלטת הביטוי.

תכנן וסינתז פריימרים קדימה ואחורה עם אזורי הומולוגיה קצרים לקלטת ה-sRNA הקיימת, לצד רצף המנחה החדש של 24 זוגות בסיסים. הכן תרבית של חמישה מיליליטר של E.coli ב-LB ואנטיביוטיקה הנושאת את תבנית ביטוי sRNA פגמיד. גדל את התאים בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול.

לאחר חילוץ וטיהור התבנית sRNA phagemid מהתרבית, הכינו שתי תגובות PCR, תוך שימוש פי 10 עד 50 מהכמות המומלצת של תבנית DNA עבור sRNA phagemid ופולימראז בנאמנות גבוהה. הכן תגובה אחת עם קדימה ואחת עם פריימר הפוך. לאחר שימוש בתנאי PCR סטנדרטיים להפעלת התגובות, שלב את שתי התגובות בצינור מיקרוצנטריפוגה.

ואז לחשל את המוצרים על ידי חימום ל 98 מעלות צלזיוס באמבט מים רותח. כבו מיד את מקור החום ואפשרו לאמבטיה לחזור לאט לטמפרטורת החדר במהלך השעה-שעתיים הבאות. כדי לחסל את התבנית הלא מוטנטית sRNA, הוסף מיקרוליטר אחד של אנזים הגבלה DpnI לתערובת, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, או למשך הזמן המומלץ על ידי היצרן לעיכול מלא.

לאחר מכן, הפוך תאי E.coli מוכשרים כימית עם אחד עד חמישה מיקרוליטר של תוצר ה-PCR המחוסם. לאחר מכן בודד מושבות בודדות על ידי ציפוי סלקטיבי על צלחות LB עם אנטיביוטיקה. כדי לאמת את שילוב רצף המדריך הנכון עם PCR של המושבה.

השתמש בקצה פיפט של 200 מיקרוליטר כדי לאסוף כמות קטנה של תאים ממושבה אחת שהשתנתה. מוסיפים את התאים שנאספו ל-50 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז בצינור מיקרו-צנטריפוגה ומערבבים על ידי פיפטינג. לאחר מכן, בעזרת מחזורי חום על שולחן העבודה, או אמבט מים רותחים, יש לזרוק את התאים על ידי חימום ל-95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות.

באמצעות מיקרוליטר אחד של התאים הליזים כתבנית ה-DNA, בצע PCR בהתאם לתנאים המוצגים כאן. לאחר אימות הרצף המנחה הנכון, יש לחסן תרבית של חמישה מיליליטר בשיבוט ה-sRNA הנכון, ולגדל את התאים בן לילה. למחרת, הכינו מלאי גליצרול על ידי שילוב של 750 מיקרוליטר של תרבית הלילה עם 250 מיקרוליטר של 60% גליצרול בצינור קריו-פקק הברגה.

להכנת מלאי פגמיד ארוז M13, הכינו תרבית לילה של חמישה מיליליטר של E.coli, הנושאת את ביטוי ה-sRNA phagemid. כמו כן, הכינו תרבית לילה של חמישה מיליליטר של E.coli, הנושאת את הפלסמיד המסייע M13KO7. למחרת, לאחר טיהור ה-DNA, בצע טרנספורמציה משותפת של E.coli בעל יכולת כימית עם מיקרוליטר אחד של כל אחד מביטוי ה-sRNA של הפאגמיד והפלסמיד המסייע.

צלחת על LB-אגר עם אנטיביוטיקה לבחירה עבור שני המבנים. ביטוי פגמיד הוא נטל כושר גדול עבור התאים ועלול לגרום ליעילות טרנספורמציה נמוכה יותר. ייתכן שיהיה צורך להציג את הפלסמיד בשני שלבי טרנספורמציה עוקבים.

לאחר הדגירה של התאים שעברו טרנספורמציה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס, הכינו תרבית של 10 מיליליטר ממושבה אחת של הזן המותמר. למחרת בבוקר, צנטריפוגה את התרבית ב 3300 x גרם למשך 10 דקות. אוספים את הסופרנטנט ומסננים דרך פילטר של 0.2 מיקרון.

אחסן את תסנין הפאגמיד הארוז בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הכנת תאי F+מטרה, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחסן מושבה בודדת לתרבית של חמישה מיליליטר של מדיום LB עם אנטיביוטיקה, ולגדול בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, השתמש בחמישה מיליליטר של מדיום LB סלקטיבי כדי לדלל את תאי המטרה F+1 עד מאה, והמשך לדגור.

תרבית התאים במשך כשעתיים עד לקבלת OD600 של 0.3, מה שמעיד על צמיחה בשלב היומן. תאים המיועדים להשתקה צריכים להיות בשלב אקספוננציאלי כאשר ביטוי של שתיקת F pilus לזיהום פגמיד יעיל. הוסף יחס של אחד למאה של פגמידים ארוזים M13 לתאי המטרה כדי להשיג כמעט 99% זיהום של אוכלוסיית היעד.

אפשר לזיהום להמשיך בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 30 עד 60 דקות. לאחר מכן בדוק את פנוטיפ השתקת ה-sRNA כרצונך. בעקבות הפרוטוקול שהודגם בסרטון זה, קלטת השתקת ה-sRNA של פלסמיד pAB.

001 שונה למטרה ל-mKate2. איור זה מדגים כי זן ה-E.coli הנגוע בפאגמיד האנטי-mKate2 לא הראה פלואורסצנטיות mKate2 ניתנת לזיהוי על הרקע. עם זאת, זן זה אכן ביטא GFP, מה שמצביע על קליטה מוצלחת של הפאגמיד.

בניסוי זה, זן E.coli עם כלורמפניקול אצטילטרנספראז משולב כרומוזומלית, או גן CAT, נדבק בפאגמיד המכוון ל-CAT, ונבדקה השתקת sRNA של עמידות לכלורמפניקול. תאים שבהם הפאגמיד התמקד ב-CAT הראו הישרדות מופחתת בריכוזים נמוכים של כלורמפניקול, וכמעט 99% הרג בריכוזים גבוהים יותר. מצד שני, תאים לא נגועים, או תאים נגועים ב-sRNA שהשתיק mKate2, היו עמידים לכלורמפניקול בכל הריכוזים שנבדקו.

כפי שמוצג כאן, תוספת האמפיצילין, המשמשת לבחירה רק עבור חיידקים הנושאים את הפאגמיד, הפחיתה את הישרדות הכלורמפניקול לרמות בלתי ניתנות לזיהוי. שינוי גן המטרה של ה-sRNA וייצור פגמיד נגוע יכול להיעשות תוך חמישה ימים. אל תשכח שעבודה עם פאג'ים יכולה להיות מסוכנת ביותר עבור ניסויים אחרים במעבדה, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון שימוש בכלי מעבדה ייעודיים, בזמן ביצוע הליך זה כדי למנוע זיהום לא רצוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתכנן, לשכפל ולייצר פאגמידים נגועים, הנושאים sRNA כדי להפיל כל גן מעניין באוכלוסייה הגדלה באופן פעיל של E.coli.