DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין
27 בינואר 2016
אנו מתארים זאת assay על ידי צימוד זיהוי methyltransferase אדנין DNA (DamID) לרצף תפוקה גבוה (DamID-seq). שיטה משופרת זה מספקת רזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר, ומאפשרת ניתוח נתונים DamID-seq בשיתוף עם נתונים רצף אחרים תפוקה גבוהה כגון שבב seq, RNA-seq, וכו '
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות רצפי DNA גנומיים הקשורים לחלבונים מעניינים בתאי בעלי חיים על ידי ריצוף תפוקה גבוהה. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר ארגון גרעיני ושעתוק או ויסות בתאי יונקים, כגון זיהוי אזורים גנומיים הקשורים לעמילואיד הגרעיני או לגורמי שעתוק ספציפיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שריצוף תפוקה גבוהה מספק רזולוציה גבוהה יותר מנכס ה-DamID המקורי, תוך שימוש במיקרו-מערכי DNA, וכי טכניקה זו מאפשרת ניתוח צולב עם נתוני ריצוף התפוקה הגבוהה שלנו.
מי שידגים את ההליך יהיה ברנן אולסון, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לשכפל את הגן המעניין לווקטור DamID. לאחר מכן, צור מניות לנטי-ויראליות המבטאות DamV5 POY ו-V5-Dam באמצעות מערכת ביטוי לנטי-ויראלי.
העבר את וקטור ה-DamID עם פלסמידי האריזה הלנטי-ויראלית בעקבות הליך הטרנספקציה קדימה בהתאם לפרוטוקול היצרן. הקפד לכלול שלב סינון באמצעות מסנן PVDF נקודת אפס ארבע חמש מיקרון. כעת, התכוננו להדביק את התאים בנגיף הלנטי.
יום אחד מראש, העבירו את התאים הדבקים על צלחות של שש בארות. המשך להשתמש באנטיביוטיקה. המטרה היא להגיע למפגש של 50% למחרת לזיהום.
למחרת, הוציאו מהמקפיא את ה-DamV5 POY הקפוא ואת ה-V5-Dam lentiviral supernatants, והניחו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה. על צלחות התרבות, הסר את מצע הגידול והחלף אותו בחצי מיליליטר של מצע גידול טרי ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, העמיסו את הבארות במיליליטר של נגיף לנטי מופשר.
טען שתי בארות עם V5-Dam, שתי בארות עם DamV5 POY, ושתי בארות ללא lentivirus כבקרה שלילית. סובבו את התמיסה על התאים והחזירו את הצלחת לחממה. 24 שעות לאחר מכן, החלף את התרחיפים הנגיפיים על התאים בשני מיליליטר של מצע גידול ללא אנטיביוטיקה.
לאחר מכן, המשיכו בדגירה למשך 48 שעות נוספות. יומיים לאחר מכן, השלם את התהליך הזה על ידי ביצוע פרוטוקול הטקסט לבידוד ה-DNA הגנומי, שאמור להימשך כשעה. לאחר מכן, הגבירו את שברי ה-DNA המתיליים של אדנין מה-DNA הגנומי.
תהליך זה אורך כיומיים-שלושה, והפרטים מכוסים בפרוטוקול הטקסט. עבור הליך זה, יש לפרק תחילה את ה-DNA המתילי של אדנין המוגבר. לפני השימוש ב- DNA Fragmentase, חשוב למדוד תחילה את חוזקו כדי לקבוע את זמן העיכול המתאים.
השתמש בכל מוצרי מתיל PCR מטוהרים זמינים לבדיקת אבחון זו. התחל בהגדרת תערובת מאסטר המורכבת משישה מיקרוגרם של DNA, 12 מיקרוליטר של מאגר 10X Fragmentase, ומלא אותו במים עד 114 מיקרוליטר. לאחר מכן, מערבב את מלאי ה-Fragmentase למשך שלוש שניות והוסף שישה מיקרוליטר לתערובת המאסטר בסך הכל 120 מיקרוליטר.
לאחר מכן, מערבב את תערובת המאסטר למשך שלוש שניות. כעת, מלאו חמישה צינורות תגובה ב-20 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ודגרו על כל ששת הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס. הסר צינור אחד לאחר חמש דקות, והוסף חמישה מיקרוליטרים של EDTA כדי לעצור את התגובה.
עשה זאת כל 10 דקות עד שכל צינורות התגובה נאספים. כעת, נתח 12 נקודות חמישה מיקרוליטר מכל צינור, המתאים לכחצי מיקרוגרם של DNA, ואותה כמות של DNA לא מעוכל על ג'ל אגורוז. מהג'ל, קבע את הזמן המינימלי הדרוש לעיכול רוב המריחה לסביבות נקודת האפס שני קילובסיסים.
השתמש בזה כזמן העיכול המרבי. כעת, הגדר את הפיצול בפועל, כמו המבחן המקדים, ועצור את העיכול בשש נקודות זמן במרווחים שווים, כולל חמש דקות, וחשב את הזמן המקסימלי. לאחר העיכול, משוך את ששת העיכול וטהר אותם באמצעות ערכת טיהור PCR, או חרוזי קיבוע הפיכים בשלב מוצק.
לדלל את ה-DNA המטוהר בכ-15 מיקרוליטר של מאגר EB. השלבים הבאים הם לתקן את קצות ה-DNA המקוטע, להוסיף תלויות אדנין, לקשור את מתאמי הריצוף ולהמיר את המתאמים בצורת Y ל-DNA דו-גדילי. כל השלבים הללו מפורטים בפרוטוקול הטקסט, והשלמתם לא אמורה להימשך יותר מיומיים.
לאחר קשירת מתאמי ריצוף ל-DNA מקוטע, והמרת מתאמים בצורת Y ל-DNA דו-גדילי, בחר שברים בגודל הרצוי. התחילו בהכנת ג'ל אגורוז של שני אחוזים ב-TAE, ותוך נקיטת אמצעי זהירות, הוסיפו אתידיום ברומיד לריכוז סופי של 500 ננוגרם למיליליטר. צור מספיק נתיבים כדי שכל הדוגמאות ושני סולמות יהיו גובלים בנתיבים ריקים.
כעת, הוסף שמונה מיקרוליטר של צבע העמסה ל-10 מיקרוליטר מכל שפיכת DNA והכין את סולם ה-1 Kb Plus עם צבע טעינה פי 6 ומים ביחס של אחד לאחד לארבעה. לאחר מכן, טען את נתיבי הג'ל בסדר הבא: סולם DNA, DNA נפלט וסולם DNA נוסף. לאחר הטעינה, הפעל את הג'ל ב -120 וולט ל -60 דקות.
מאוחר יותר, הרכיבו משקפי בטיחות ומגן פנים כדי לראות לזמן קצר את הג'ל באור UV. בדוק את סולמות ה-DNA כדי לראות אם הג'ל אזל מספיק כדי שניתן יהיה לכרות שלוש פרוסות ג'ל בין 300 ל-400 זוגות בסיסים. לאחר מכן, גזרו את הרצועות בין 300 ל-400 זוגות בסיסים מכל נתיב, והשתמשו תמיד בלהב חדש לכל נתיב.
הסר כמה שפחות מהג'ל כדי להפוך כל פרוסת ג'ל באופן אידיאלי מתחת ל-100 מיקרוליטר, והעביר כל אחד לצינור המיקרופוגה שלו. לאחר מכן, חלץ את ה-DNA מפרוסות הג'ל לפי פרוטוקול הטקסט. המשך לעקוב אחר פרוטוקול הטקסט כיצד להעשיר את הקטעים ששונו על ידי מתאם הרצף מה-DNA שחולץ.
לאחר מכן, קבל ניתוח באיכות גבוהה של ה-DNA המטוהר על ידי ביואנלייזר, ואם הוא עומד בציפיות, שלח אותו לריצוף. לנטי-וירוסים הונדסו לבטא חלבון היתוך Dam-V5-lamin B1, שאומת כקו-לוקאלי עם חלבון הלאמין B1 האנדוגני על ידי צביעת אמינו פלואורסצנטית. נגיף זה ו-lentivirus בקרה המבטא חלבון היתוך Dam-V5 שימשו שניהם להדבקת מיובלסטים C2C12 של עכברים.
DNA נאסף והוגבר עבור שברי מתילציה של אדנין, כמתואר, ולאחר מכן רצף. לאחר מכן נבנו מפות אינטראקציה של גנום NL עבור כרומוזום אחד. רצועה אחת מציגה את יחסי ה-log2 RPKM.
הרצועה השנייה מציגה את הדומיינים הקשורים למינה בשחור. אלה אזורים הקשורים באופן משמעותי יותר לסכר למין B1 מאשר לסכר בקרה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים, אם היא מבוצעת כראוי.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות רצפי DNA הקשורים לחלבונים מעניינים על ידי ריצוף תפוקה גבוהה, יחד עם DamID. אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד ונורות UV עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו המתנה עד שהג'ל יתקרר לפני הוספת אתידיום ברומיד, ולבישת מגן עיניים ומגן פנים בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקה חדשנית המשלבת זיהוי דנ"א אדנין מתילטרנספראז (DamID) עם ריצוף רב-סמיכות (DamID-seq). שיטה משופרת זו מציעה רזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר לניתוח רצפי דנ"א גנומי הקשורים לחלבונים בתאי בעלי חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- גנומיקה
- ביולוגיה מולקולרית
- ביולוגיה של התא
רקע
- שיטת DamID-seq מאפשרת זיהוי של אזורים גנומיים הקשורים לחלבונים ספציפיים.
- טכניקה זו עולה על שיטת ה-DamID המקורית שהשתמשה במערכי DNA מיקרו-מערכים (microarrays).
- ריצוף בתפוקה גבוהה מאפשר ניתוח השוואתי עם סוגי נתוני ריצוף אחרים.
- הבנת הארגון הגרעיני ובקרת השעתוק היא קריטית בתאי יונקים.
מטרת המחקר
- לזיהוי רצפי DNA גנומי הקשורים לחלבונים רצויים.
- לשיפור הרזולוציה של ניתוח גנומי בתאים של בעלי חיים.
- לאפשר אינטגרציה של נתוני DamID-seq עם מערכי נתונים אחרים של ריצוף בספיקה גבוהה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שבט של הגן הנחקר לתוך וקטור DamID.
- הפקת מלאים של לנטי-וירוס המבטאים את DamV5 POY ו-V5-Dam.
- שימוש במערכת ביטוי לנטי-ויראלית להעברת גנים.
- ביצוע ריצוף בספיקת גבוהה (high throughput sequencing) לניתוח הנתונים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מספקת רזולוציה גבוהה יותר בהשוואה לטכניקות קודמות.
- היא מאפשרת זיהוי של אזורים גנומיים הקשורים לחלבונים גרעיניים.
- ניתוח השוואתי עם נתוני ריצוף אחרים משפר את ההבנה של גורמי שעתוק.
- הדגמת הפרוטוקול על ידי טכנאי מעבדה ממחישה את היישום המעשי שלו.
מסקנות
- שיטת DamID-seq משופרת זו היא כלי בעל ערך לניתוח גנומי.
- היא תורמת להבנת הארגון הגרעיני ובקרת הגנים.
- שילוב הטכניקה עם מערכי נתונים אחרים פותח אפיקים חדשים למחקר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
DamID-seq מספקת שיטה ברזולוציה גבוהה ובקנה מידה גנומי למיפוי אינטראקציות בין חלבון ל-DNA, המאפשרת אפיון מדויק של הארגון הגרעיני והבקרה התעתוקית בתאי יונקים. באמצעות שילוב של תיוג מבוסס מתילציה של אדנין עם ריצוף בסביבה של תפוקה גבוהה, הטכניקה מתגברת על המגבלות של DamID התלוי במערכי מיקרו-מערכים (microarrays) ותומכת בניתוח השוואתי עם מערכי נתונים אחרים של גנומיקה פונקציונלית, כגון ChIP-seq ו-RNA-seq. יכולת זו משפרת את תיקוף המטרות ואת הפחתת הסיכונים המכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי אספקת מפות אינטראקציה כמותיות וניתנות לשחזור המנחות בחירת מטרות תרופתיות מבוססת השערות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של אינטראקציות חלבון-DNA ברחבי הגנום בדיוק וברגישות גבוהים.
- ערך תפעולי: מספק בדיקה הניתנת לשחזור, המבוססת על הגברה, הנמנעת מהסתמכות על נוגדנים ועובדת במערכות תאים יונקיים מגוונות.
- ערך חיזוי: מייצר פרופילים כמותיים של אינטראקציות התומכים בהערכת רמת הביטחון במטרה ובהבהרת מסלולים ביולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר נתונים של מקטעים עם מתילציה של אדנין ברחבי הגנום, המתאימים לנורמליזציה ולהשוואה בין תנאים ניסיוניים.
- ערך תפעולי: מפיק נתוני ריצוף של קריאות קצרות (short-read sequencing) התואמים למסלולי עיבוד ביו-אינפורמטיקה סטנדרטיים לצורך זיהוי פסגות (peak calling) ואנליזה דיפרנציאלית.
- יכולת הרחבה: מאפשר עיבוד של מספר דגימות במקביל (multiplexed) ואינטגרציה עם בדיקות ריצוף אחרות למסלולי עבודה מתואמים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר השוואה של מפות אינטראקציה בין חלבון ל-DNA עם מערכי נתונים אפיגנטיים ותעתוקיים כדי להעריך רלוונטיות תפקודית.
- ערך תפעולי: תומך במחקרים אורך של דומיינים הקשורים ללמינה הגרעינית (LADs) ובדינמיקה שלהם במודלים של מחלות.
- המשכיות תרגומית: מקל על תיקוף מטרות המיושרות לסממנים ביולוגיים על ידי קישור אירועי קישור לביטוי גנים ומצבי כרומטין.
אינטגרציית תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת DamID-seq משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת תובנות מנגנוניות המכוונות את סריקת התרכובות ואת התיקוף הפרה-קליני. השיטה מייצרת נתוני קישור ברמה הגנומית שניתן לשלב עם תוצאות של סריקה פנוטיפית כדי לתעדף מטרות עם רציונל מנגנוני חזק.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות זיהוי מטרות גנומיות ישירות של חלבונים גרעיניים, פקטורי שעתוק או רגולטורים של כרומטין.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות ונורמליזציה (למשל, יחסי log2 RPKM) המאפשרים השוואה בין תנאים ותיקוף של "להיטים" (hits) במסעי סריקה.
- אנליטיקה: מייצר מפות אינטראקציה ברזולוציה גבוהה המתאימות לזיהוי שיאים (peak detection), העשרה של מוטיבים ומתאם עם נתוני RNA-seq או ATAC-seq.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של אתרי קישור של חלבונים עם וריאנטים גנומיים הקשורים למחלות או QTLs של ביטוי, כאשר הדבר נתמך על ידי נתונים משלימים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למיפוי אינטראקציות של חלבונים גרעיניים על פני מטרות וקווי תאים מרובים, ובכך מפחית פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני מטרה על ידי אספקת ראיות ישירות, ברמה הגנומית, לאינטראקציות חלבון-DNA.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה למיפוי אינטראקציות באמצעות זיהוי מבוסס הגברה, ובכך מפחית שונות הקשורה לשיטות המבוססות על נוגדנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית בתיקוף מטרות ובניתוח מסלולים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על פרופילי אינטראקציה כמותיים וניתנים לשחזור.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בשבוט מולקולרי ליצירת מבניהיזיונים של DamID ווקטורים לנטיביריאליים.
- תלוי בגישה להפקה של לנטיבירוס, ריצוף בסביבת throughput גבוהה וכלי ביואינפורמטיקה לניתוח מקטעים וזיהוי שיאים (peak calling).
- מחייב סטנדרטיזציה של תנאי ההדבקה, פרמטרים של פרגמנטציית DNA ובחירת גודל לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל אופטימיזציה של זמן העיכול ובחירת גודל המקטעים (למשל 300–400 bp) כדי להבטיח הכנת ספרייה יעילה.
- מוגבל על ידי צפיפות מוטיבי GATC בגנום, מה שעשוי להשפיע על הרזולוציה באזורים עשירים ב-AT או באזורים עם תכולת GC קיצונית.
