Name: DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד את שיטת DamID-seq למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA בתאי יונקים באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה מספקת רזולוציה משופרת לניתוח ארגון גרעיני וויסות שעתוק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר Bas van Steensel על שסיפק את וקטורי הביטוי של יונקים DamID. אנו מודים למרכז ייל לניתוח גנום ולליבת הגנומיקה במרכז תאי הגזע של ייל על הייעוץ בהכנת ספריות NGS ויישום ריצוף DNA בתפוקה גבוהה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון הסטארט-אפ מבית הספר לרפואה של ייל, מענק פיתוח מדענים מאיגוד הלב האמריקאי (12SDG11630031) ומענק זרע מ-Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
<li>Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID%3A+mapping+of+in+vivo+protein-genome+interactions+using+tethered+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase.</a> Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).</li>
<li>de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+HP1+binding+in+Drosophila%3A+developmental+plasticity+and+genomic+targeting+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals.</a> Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).</li>
<li>DamID mammalian vectors. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm">http://research.nki.nl/vansteensellab/Mammalian_plasmids.htm</a> (2015).</li>
<li>Illumina TruSeq adaptors & PCR primers. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/">https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/</a> (2015).</li>
<li>Optimization of PCR cycles for NGS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/">https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/</a> (2015).</li>
<li>Bernstein, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NIH+Roadmap+Epigenomics+Mapping+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium.</a> Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).</li>
<li>Encode Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS Biol. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יש לבחון האם חלבונים מתויגים Dam שומרים על הפונקציות של חלבונים אנדוגניים לפני ניסוי DamID-seq. יש לקבוע תמיד את הלוקליזציה התת-תאית של חלבוני מעטפת גרעינית מתויגים ב-Dam ולהשוות אותה לזו של החלבונים האנדוגניים. לחקר גורמי שעתוק, מוצע לבחון האם חלבון היתוך דאם יכול להציל את תפקודי החלבון האנדוגני בוויסות ביטוי הגנים. ניתן לבצע בדיקה פונקציונלית זו באורגניזמים בהם קיימות מוטציות נוקאאוט של חלבונים קושרי DNA אנדוגניים. מכיוון שההתקדמות בהנדסת הגנום אפשרה פוטנציאלית להפיל כל גן אנדוגני מעניין, ניתן לבחון את הפונקציות של חלב...

זיהוי DNA methyltransferase אדנין (DamID) 1,2 הוא שיטה לגילוי אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א in vivo והוא גישה חלופית לimmunoprecipitation הכרומטין (שבב) 3. היא משתמשת בכמות נמוכה יחסית של תאים ואינו דורשת קישור צולב כימי של חלבון עם DNA או נוגדן ספציפי מאוד. האחרון הוא מועיל במיוחד כאשר חלבון המטרה הוא רופף או בעקיפין קשור ל- DNA. DamID שמש בהצלחה כדי למפות את אתרי הקישור של מגוון רחב של חלבונים כוללים חלבוני מעטפת גרעין 4-10, חלבוני הכרומטין קשור 11-13, אנזימי הכרומטין שינוי 14, גורמי שעתוק ושיתוף גורמים 15-18 ומנגנוני RNAi 19. השיטה היא ישימה באורגניזמים רבים, כולל ס 13 cerevisiae, ס 7 pombe, ג 9,17 elegans, ד &#39; melanogaster 5,11,18,20, א thaliana 21,22 כמו גם קווי עכבר ותא אנושי 6,8,10,23,24. הפיתוח של assay DamID היה מבוסס על זיהוי הספציפי של שברי ה- DNA מפוגל אדנין בתאים האיקריוטים שחסרים אדנין אנדוגני מתילציה 2. חלבון היתוך מתבטא, בהיקף של החלבון קושר DNA של עניין וא methyltransferase coli DNA אדנין (Dam), יכול methylate בסיס אדנין ברצפי GATC שנמצאים בקרבת מרחבי (באופן משמעותי ביותר בתוך 1 קילו ועד בערך 5 קילו) לאתרי הקישור של החלבון בגנום 2. קטעי דנ&quot;א שונה יכולים להיות מוגבר במיוחד והכלאה לmicroarrays כדי לזהות את אתרי הקישור הגנומי של החלבון של עניין 1,25,26. שיטת DamID מקורית זה הייתה מוגבל על ידי הזמינות של microarrays והצפיפות של בדיקות שנקבעו מראש. לכן יש לנו משולב רצף תפוקה גבוהה בלDamID 10 ומיועד השיטה כDamID-seq. המספר הגדול של כניסות קצרות שנוצר מDamID-seq מאפשר לוקליזציה מדויקת של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א הגנום. מצאנו שDamID-seq סיפק ברזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר מאשר DamID ידי microarray ללימוד lamina הגנום גרעיני עמותות (NL) 10. שיטה משופרת זו מאפשרת חיטוט עמותות NL בתוך מבני גן 10 ומקלה על השוואות עם נתונים אחרים תפוקה גבוהה רצף, כגון שבב seq ו- RNA-seq. פרוטוקול DamID-seq המתואר כאן פותח בתחילה לעמותות הגנום-NL מיפוי 10. אנחנו שנוצרנו חלבון היתוך על ידי קשירת עכבר או B1 Lamin אדם לE. methyltransferase אדנין coli DNA ובדק את הפרוטוקול ב3T3 fibroblasts העוברי של העכבר, עכבר C2C12 myoblasts 10 וIMR90 fibroblasts ריאות העובר אנושי (נתונים לא פורסמו). בפרוטוקול זה, אנחנו מתחילים עם גonstructing וקטורים ולהביע חלבוני היתוך דאם-קשורים בזיהום lentiviral בתאי יונקים 24. לאחר מכן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורטים של הגברת קטעי DNA-מפוגל אדנין והכנת ספריות רצף שצריכה להיות מיושמים באורגניזמים אחרים.

<table><tbody><tr><td>ViraPower Lentiviral Expression Systems</td><td>Life Technologies</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 ו-K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II Enzyme Mix</td><td>Life Technologies</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & ערכת טישו (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 או 69504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gateway pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T תאים</td><td>אוסף תרביות מסוג אמריקאי</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה, פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr>מותג<td>EDTA</td><td></td><td></td><td>לא קריטי</td></tr><tr><td>200 הוכחה מותג EtOH</td><td></td><td></td><td>לא קריטי</td></tr><tr>מותג<td>איזופרופנול</td><td></td><td></td><td>לא קריטי</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td>מסופק עם מתאמי DamID חוצץ</td></tr><tr><td>"AdRt" ו-"AdRb"</td> רצפי <td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות הזמינים באסמכתא 24; ללא זרחון של קצה 5' או 3' למניעת קשירה עצמית.</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche Life Science</td><td>10481220001</td><td>מסופק עם מאגר</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543</td><td>מסופק עם</td></tr><tr><td>פריימר DamID PCR "AdR_PCR"</td> רצפי <td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות זמינים באסמכתא 24</td></tr><tr><td>סט פתרונות דאוקסינוקלאוטיד (dNTP) ניו</td><td>אינגלנד ביולאבס</td><td>N0446</td><td>100 מ"מ כל אחד של dATP, dCTP, dGTP ו-dTTP</td></tr><tr><td>יתרון 2&nbsp; תערובת פולימראז</td><td>Clontech</td><td></td><td>מסופקת 639201 עם חוצץ</td></tr><tr><td>1Kb בתוספת DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 ומיקרו; g/&micro; l</td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR מהירה</td><td>QIAGEN</td><td>28104 או 28106</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR של MinElute</td><td>QIAGEN</td><td>28004 או 28006</td><td>לנפח פליטה של פחות מ-30 ומיקרו; l</td></tr><tr><td>חרוזי SPRI / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>מחילים ערבוב נוסף וזמן פליטה רב יותר אם פחות מ-40 ומיקרו; l מאגר פליטה משמש</td></tr><tr><td>Buffer</td><td>EB QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>מסופק עם מאגר</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polymerase I, שבר גדול (Klenow)</td> New <td>England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynuleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' &#8594; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>מסופק עם</td></tr><tr><td>מתאמי ריצוף</td> מאגר רצפי <td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות זמינים באסמכתא 28</td></tr><tr><td>ערכת קשירה מהירה</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>בשימוש ב-3.4.3; מסופק עם מאגר תגובת קשירה מהירה ופריימר ריצוף מהיר T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>1 ו-2</td> רצפי <td>טכנולוגיות</td><td></td> DNA <td>משולבות הזמינים ב-ref. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 או KK2102</td><td>מסופק עם KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer ו-10 mM dNTP</td></tr><tr><td>mix agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>ethidium bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick QIAGEN</td><td></td><td>28704 או 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 או 1725122</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>0.45 & #956; m PVDF מסנן</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>25 מ"ל Seringe</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחות</td><td></td><td></td> תרבית רקמות <td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>6 בארות צלחות</td><td></td><td></td> תרבית רקמות <td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>עבור qPCR</td></tr><tr><td>מערבולת מיקסר</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>Dry Block Heater או Thermomixer</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה ג'ל עם מותג אספקת חשמל</td><td></td><td></td><td>לא</td></tr><tr><td>קריטי מגנט סטנד</td><td></td><td></td><td>לטיהור DNA עם חרוזי SPRI; צריך להחזיק צינורות של 1.5-2 מ"ל; מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td>מותג לא קריטי</td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה E-gel</td><td>Life Technologies</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-dna על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי dna-מפוגל אדנין

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

בדיקת זיהוי DNA adenine methyltransferase (DamID) היא שיטה רבת עוצמה לאיתור אינטראקציות חלבון-DNA הן מקומיות והן ברחבי הגנום. זוהי גישה חלופית למשקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP). חלבון היתוך מבוטא המורכב מהחלבון המעניין ו-E. coli DNA adenine methyltransferase יכול למתילציה של בסיס האדנין במוטיבים של GATC ליד אתרי האינטראקציות בין חלבון ל-DNA. לאחר מכן ניתן להגביר ולזהות באופן ספציפי שברי DNA שעברו מתילציה של אדנין. בדיקת ה-DamID המקורית מזהה את המיקומים הגנומיים של מקטעי DNA שעברו מתילציה על ידי הכלאה למיקרו-מערכי DNA, המוגבלת על ידי זמינותם של מיקרו-מערכים וצפיפות הבדיקות שנקבעו מראש. במאמר זה, אנו מדווחים על הפרוטוקול המפורט של שילוב ריצוף DNA בתפוקה גבוהה ב-DamID (DamID-seq). המספר הגדול של קריאות קצרות שנוצרו מ-DamID-seq מאפשר זיהוי ומיקום אינטראקציות חלבון-DNA ברחבי הגנום בדיוק ורגישות גבוהים. השתמשנו במבחן DamID-seq כדי לחקור אינטראקציות גנום-למינה גרעינית (NL) בתאי יונקים, ושמנו לב ש-DamID-seq מספק רזולוציה גבוהה וטווח דינמי רחב בזיהוי אינטראקציות גנום-NL. גישת DamID-seq מאפשרת לבחון אסוציאציות NL בתוך מבני גנים ומאפשרת השוואה של מפות אינטראקציה של גנום-NL עם נתונים גנומיים פונקציונליים אחרים, כגון ChIP-seq ו-RNA-seq.

חלבון היתוך דאם-V5-LmnB1 אומת להיות שיתוף מקומי עם Lamin B חלבון אנדוגני על ידי צביעת immunofluorescence (איור 1). ההגברה PCR המוצלחת של שברי ה- DNA מפוגל אדנין היא צעד מפתח לDamID-seq. דגימות הניסוי צריכים להגביר כתם של 0.2-2 קילו תוך הבקרה השלילית (ללא DpnI, ללא האנזים או בלי תבנית PCR) צריך לגרום לא-ברור או פחות הגברה (א...

אנו מתארים זאת assay על ידי צימוד זיהוי methyltransferase אדנין DNA (DamID) לרצף תפוקה גבוה (DamID-seq). שיטה משופרת זה מספקת רזולוציה גבוהה יותר וטווח דינמי רחב יותר, ומאפשרת ניתוח נתונים DamID-seq בשיתוף עם נתונים רצף אחרים תפוקה גבוהה כגון שבב seq, RNA-seq, וכו &#39;

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לזהות רצפי DNA גנומיים הקשורים לחלבונים מעניינים בתאי בעלי חיים על ידי ריצוף תפוקה גבוהה. טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר ארגון גרעיני ושעתוק או ויסות בתאי יונקים, כגון זיהוי אזורים גנומיים הקשורים לעמילואיד הגרעיני או לגורמי שעתוק ספציפיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שריצוף תפוקה גבוהה מספק רזולוציה גבוהה יותר מנכס ה-DamID המקורי, תוך שימוש במיקרו-מערכי DNA, וכי טכניקה זו מאפשרת ניתוח צולב עם נתוני ריצוף התפוקה הגבוהה שלנו.מי שידגים את ההליך יהיה ברנן אולסון, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, עקוב אחר פרוטוקול הטקסט כדי לשכפל את הגן המעניין לווקטור DamID. לאחר מכן, צור מניות לנטי-ויראליות המבטאות DamV5 POY ו-V5-Dam באמצעות מערכת ביטוי לנטי-ויראלי.העבר את וקטור ה-DamID עם פלסמידי האריזה הלנטי-ויראלית בעקבות הליך הטרנספקציה קדימה בהתאם לפרוטוקול היצרן. הקפד לכלול שלב סינון באמצעות מסנן PVDF נקודת אפס ארבע חמש מיקרון. כעת, התכוננו להדביק את התאים בנגיף הלנטי.יום אחד מראש, העבירו את התאים הדבקים על צלחות של שש בארות. המשך להשתמש באנטיביוטיקה. המטרה היא להגיע למפגש של 50% למחרת לזיהום.למחרת, הוציאו מהמקפיא את ה-DamV5 POY הקפוא ואת ה-V5-Dam lentiviral supernatants, והניחו אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס להפשרה. על צלחות התרבות, הסר א

damid-seq-genome-wide-mapping-protein-dna-interactions-high

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

DNA וחלבונים-במיוחד רצף שכותרתו עם זיקה או קבוצות כתב ניאון באמצעות methyltransferases DNA או חלבון ואנלוגים cofactor סינטטיים. בהתאם לסגולי כקו-הפקטורים של האנזימים, aziridine או אנלוגים cofactor מופעלים כפולים מועסקים תיוג אחת או שני שלבים.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

רצף עמוק של אוכלוסיות השמרים שנבחר עבור אינטראקציות חיוביות שמרים 2-היברידית פוטנציאל התשואות שפע של מידע אודות אינטראקציה שותף חלבונים. כאן, אנו מתארים את הפעולה של ביואינפורמטיקה ספציפי כלים ותוכנות מעודכן המותאם אישית כדי לנתח נתונים רצף כזה המסכים.

Informatic ניתוח של נתוני רצף אצווה שמרים 2-היברידית המסכים

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

למד את שיטת DamID-seq למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA בתאי יונקים באמצעות ריצוף תפוקה גבוהה. השיטה מספקת רזולוציה משופרת לניתוח ארגון גרעיני וויסות שעתוק.

DamID-seq: מיפוי הגנום של אינטראקציות החלבון-DNA על ידי תפוקה גבוהה רצף של קטעי DNA-מפוגל אדנין

גלה סרטונים נוספים