מאפייני electroactive פולימר החלקיקים מציגים photothermal

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להכין ננו-חלקיקי פולימר מוליכים המציגים תכונות פוטותרמיות, ולהעריך את הציטוטוקסיות שלהם. ננו-חלקיקי פולימר מוליכים הם חומרים אידיאליים לטיפול פוטותרמי מכיוון שהם סופגים אור בתחום האינפרא אדום הקרוב וממירים אותו לחום כדי להרוג תאים סרטניים. היתרון העיקרי של חומרי פוטותרפיה פולימריים הוא שניתן להתאים אותם לכוונון תכונות הספיגה שלהם על ידי יכולת תאימות ומיקוד גידול כדי לאפשר טיפול מקומי יעיל ולא פולשני בסרטן.

הפולימרים שאנו משתמשים בהם לטיפול פוטותרמי יכולים לשמש גם ליישומי אנרגיה חלופית, חיישנים ואלקטרוכרומיקה. אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שהתגובה רגישה ללחות. הבנה טובה של טכניקות סינתזה ללא אוויר היא חיונית.

הדגמה חזותית של מבחני תרבית תאים היא קריטית מכיוון שקשה לשלוט בטכניקות סטריליות. כל מבחני המשחק הרב-תפקידי דורשים דיוק ועקביות כדי להשיג תוצאות נאותות. לבקבוק בעל שלושה צווארים ותחתית עגולה אבטח מחיצה, מעבה המצויד במתאם בקרת כניסה ומתאם בקרת יציאת גז.

חבר את מתאם יציאת הגז למבעבע. לאחר מכן, חבר את מתאם הכניסה לקו ארגון שלנק עם צינורות PVC בעלי קירות עבים. התחל את זרימת הארגון לבקבוק התגובה, ותן לגז לזרום למשך מספר דקות.

לאחר הפעלת הוואקום, השתמש במבער בונסן כדי לייבש את התגובה ולאחר מכן לטהר את המנגנון בארגון. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות כדי להשיג סביבה נטולת אוויר. השתמש במזרק כדי להוסיף נקודה אחת אפס שבעה גרם של EDOT למנגנון דרך המחיצה.

מוסיפים 20 מיליליטר טטרהידרופוראן לבקבוק ומערבבים. מכינים אמבט אצטון קרח יבש בבקבוק דיואר בצורה נמוכה, ומצננים את בקבוק EDOT למשך 15 דקות במינוס 78 מעלות צלזיוס. לאחר מכן ירידה חכמה ב-11 מילימול של n-butyllithium בהקסנים תוך שמירה על טמפרטורה של מינוס 78 מעלות צלזיוס.

לאחר הוספה מלאה, מערבבים שעה נוספת. יש לנקוט משנה זהירות בעת טיפול בריאגנטים אורגנוליתיום. פתרונות אלה מסוכנים במיוחד, וצריכים להיות מטופלים רק על ידי מישהו שעבר הכשרה מקיפה בשימוש בהם.

הסר את אמבט האצטון הקרח היבש. ומיד התחל תוספת חכמה של 14 נקודות 13 מיליליטר של תמיסת אבץ כלוריד טוחנת אחת, תוך ערבוב במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף לתגובה ארבעה מילימול של אחד, ארבע דיאלקוקסי, שניים חמישה דיברומובנזן ו-80 מיקרומול של פלדיום טטראקיס, טריפנילפוספין.

התחל להזרים מחדש את התגובה ב-75 מעלות צלזיוס עם אמבט שמן. בכל יום, השתמש במזרק כדי לקחת דגימה קטנה מתערובת התגובה. זרז את הדגימה לשני מיליליטר של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת, והשתמש בשני מיליליטר של דיכלורומתאן כדי לחלץ את החומר.

זהה את התמצית על כרומטוגרפיה של שכבה דקה של סיליקה, או צלחת TLC, לצד תמיסות מוכנות מראש של EDOT מטוהר והמקביל ארבע דיאלקוקסי שתיים חמש דיברומובנזן. השתמש בתמיסה של 60 עד 40 של אתיל אצטט והקסנים כדי לפתח את הצלחת בתא זכוכית. לאחר השלמת התגובה, תוך שלושה עד חמישה ימים, יש לקרר את התגובה לטמפרטורת החדר.

הוסף 10 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת ואחריה 20 מיליליטר דיכלורומתאן כדי להרוות את התגובה. העבירו את עבודת התגובה למשפך הפרדה, ובודדו את השכבה האורגנית. שוטפים את האורגנים במים נטולי יונים עד ששטיפות המים כבר לא חומציות.

לאחר מכן, יבש את החומרים האורגניים מעל 15 גרם מגנזיום גופרתי. לאחר סינון המוצק, הסר את הממס באמצעות מאייד סיבובי כדי להפיק מוצק כתום צהוב. בכוס נבלה, הכינו מיליליטר אחד של שני אחוזים ממשקל בנפח PSS-co-MA במים, והוסיפו מוט ערבוב קטן.

הכינו תמיסה של 16 מיליגרם למיליליטר של מונומר בכלורופורם והעבירו 100 מיקרוליטר ממנו לצינור מיקרוצנטריפוגה. ממיסים 30 מיליגרם של חומצה סולפונית דודצילבנזן בצינור המיקרו-צנטריפוגה, ולאחר מכן השתמש במערבל מערבולת אוטומטי למשך 30 עד 60 דקות כדי להומוגניזציה של התמיסה. לאחר מכן, הוסף את השלב האורגני ההומוגני ב-10 מיקרוליטר לפתרון PSS-co-MA של שני אחוזים כל 60 שניות.

לאחר תוספת מלאה, יש לדלל את התמיסה בשני מיליליטר מים ולהסיר את מוט הערבוב. הנח את האמולסיה באמבטיית קרח, ולאחר מכן השתמש בבדיקה כדי להגביר את האלוזיה בשני מרווחים של 10 שניות במשרעת של 30 אחוז. הוציאו את הבקבוקון מאמבט הקרח והחליפו את מוט הערבוב כדי להמשיך לערבב את האמולסיה.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה נקודות שמונה מיקרוליטרים של מאה מיליגרם למיליליטר תמיסה מימית של ברזל כלוריד לתחליב המונומר, וערבבו במשך שעה כדי לייצר ננו-חלקיקים פולימריים מיוצבים עם PSS-co-MA. העבירו את תרחיף הננו-חלקיקים לצינורות צנטריפוגה של שבעה מיליליטר, וצנטריפוגה את המתלה ב-75, 600 פעמים G למשך שלוש דקות. לבסוף, החזר את הסופרנטנט, ודיאליזה במים למשך 24 שעות באמצעות צינורות דיאליזה במשקל מולקולרי של 100 קילו-דלטון.

תרבית SCOV שלושה תאי סרטן שחלות ב-DMEMs בתוספת 10 אחוז סרום בקר עוברי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5 אחוז פחמן דו חמצני בצלוחיות T 75. לאחר פירוק וספירת תאים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים, הזינו תאים בצפיפות של 5,000 תאים לבאר בצלחת של 96 בארות. דגרו על התאים למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזי פחמן דו חמצני.

מיד לפני השימוש, השלה את תרחיף הננו-חלקיקים למצע גידול מלא בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר. סנן את מתלה הננו-חלקיקים דרך מסנן סטרילי של נקודת אפס שני מיקרומטר. לאחר מכן יש לדלל את התרחיף לריכוזי החשיפה הרצויים עם מדיום גידול מלא בתוספת אחוז אחד של פטרפטומיצין פניצילין.

הסר בעדינות את המדיום מכל באר והחלף ב-100 מיקרוליטר של תרחיף הננו-חלקיקים בריכוזי חשיפה שונים. לאחר הדגירה של התאים, הסר בזהירות את התמיסה, ולאחר מכן החלף את המדיום ב -100 מיקרוליטר של נקודת אפס מסוננת סטרילית חמישה מיליגרם לתמיסת MTT מיליליטר. דגרו על התאים במשך שעתיים עד ארבע שעות בחממה.

לאחר מכן בדוק את התאים במיקרוסקופ כדי לבדוק אם נוצרו גבישי פורמאזן. הסר בזהירות את תמיסת ה- MTT והחלף אותה ב -100 מיקרוליטר דימתיל סולפוקסיד. מניחים את הצלחת על שייקר ומערבבים מספר דקות.

לבסוף, מדוד את הסופגים של כל באר ב-590 ננומטר ו-700 ננומטר. ערכים אלה תואמים את שיא הסופגים של מוצר Formazan וקו בסיס בהתאמה. ניתן לאפיין את המונומרים המתקבלים על ידי ספקטרוסקופיה של מימן ופחמן 13 NMR.

תגובות צימוד Negishi מצמידות את טבעת הפניל ל-EDOT וגורמות לשיא פרוטון הפניל לעבור משבע נקודות PPM לשבע נקודות שמונה PPM. פרוטון ה-theyenel גם עובר במעלה השדה ל-6 נקודות 5 PPM. ארבעת הפרוטונים על פחמני גשר האתילנדיוקסי מתפצלים לשתי קבוצות של מכפילות בארבע נקודות שלושה PPM.

ספקטרום הפחמן 13 NMR מציג שיאים באחד 70, אחד 45, אחד 40 ואחד 13 עבור פחמני התיאנל, ואחד 50, אחד 20 ואחד 12 עבור פחמני הפנילן. התאימות הציטאלית של ננו-חלקיקי פולימר נקבעת באמצעות בדיקת כדאיות תאי MTT. בטווח ריכוז החלקיקים של נקודת האפס שתיים שלושה עד 56 מיקרוגרם למיליליטר, אז ננו-חלקיקים אינם מפחיתים את כדאיות התא לפחות מ-90 אחוז מהביקורת.

בדרך כלל ירידה בכדאיות התאים של פחות מ-20 אחוז היא מקובלת. לאחר ששולטים בו, לוקח כשבוע לסנתז את המונומר, שבוע נוסף לטהר אותו, ופחות מיממה להכין ולטהר את הננו-חלקיקים. ניתן להשלים את מחקר הרעילות תוך יומיים וחצי מזריעת התאים ועד לסיום הבדיקה.

בעת ניסיון מחקרי תאים במבחנה, זה קריטי לעקוב אחר טכניקות אספטיות מתאימות. ניתן לבצע מחקרים נוספים כגון בדיקות מתים חיים, מחקרי מיקרוסקופיה והפצה ביולוגית in vivo ומחקרי ביוץ פוטותרמיים עם הננו-חלקיקים שהוכנו באמצעות פרוטוקולים אלה כדי להבין טוב יותר את הפוטנציאל שלהם כסוכנים פוטותרמיים לטיפול בסרטן.