זיהוי של Kinesin-1 מטענים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

המטרה הכוללת של מתודולוגיה זו היא לזהות את מטעני Kinesin-1 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו מסייעת לנו לענות על שאלות מפתח בתחום המנועים המולקולריים, כגון אילו מטענים נישאים על ידי קינזינים ומיוזינים היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמוטציות השליליות הדומיננטיות של KIF5B יכולות לעזור לנו לזהות חזותית את המטען הזה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

כדי להתחיל, עבור הדמיית תאים חיים או פלואורסצנטיים עקיפים ב-40X ומטה, הזינו 0.2 עד 0.3 מיליון תאי HeLa במיליליטר אחד של מדיום שלם בכל באר של צלחת שש בארות. גדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוז פחמן דו חמצני. למחקרים אימונופלואורסצנטיים עקיפים עם הגדלות מעל פי 40, בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום, השתמש באלכוהול מוחלט כדי לשטוף כוסות כיסוי ולהעמיד אותן בבארות של צלחת שש בארות לייבוש באוויר.

כאשר החלקות הכיסוי התייבשו, הניחו אותן בבארות וזרעו 0.2 עד 0.3 מיליון תאים במיליליטר אחד של DMEM שלם בכל באר של הצלחת. תרבית התאים בן לילה. למחרת, בתוך ארון בטיחות ביולוגית, השתמש ב-0.1 מיליליטר של מדיום טרנספקציה כדי לדלל 0.6 מיקרוגרם של סוג פרא מתויג tdTomatod או פלסמיד ביטוי KIF5B ללא מנוע עם או בלי פלסמיד המבטא חלבון מטען מועמד.

בצינור מיקרו-צנטריפוגה נוסף של 1.6 מיליליטר, הוסף 1.8 מיקרוליטר של מגיב הטרנספקציה ל-0.1 מיליליטר של מדיום טרנספקציה. ואז לדגור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף 0.1 מיליליטר של מגיב הטרנספקציה המדולל לדגימות ה-DNA המדוללות.

הפוך את הצינורות כדי לערבב את התוכן וסובב במשך חמש שניות. לאחר מכן דגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות. במהלך תקופת הדגירה להיווצרות קומפלקס הטרנספקציה, השתמש ב- PBS כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.

לאחר מכן הוסיפו 0.8 מיליליטר של מדיום טרנספקציה מחומם מראש לכל באר, והחזירו את הצלחות לחממה. לאחר שמגיב הטרנספקציה המדולל דגר במשך 45 דקות, הוסף 0.2 מיליליטר מהתמיסה טיפתית בכל באר של הצלחת. נענעו בעדינות את צלחת שש הבארות למשך חמש שניות והחזירו אותה לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך שש עד שמונה שעות.

לאחר מכן השתמש ב-DMEM מלא כדי להחליף את המדיום. כדי לבצע הדמיית תאים חיים לאחר 16 שעות נוספות של דגירה, הוסף את כתם ה-DNA המשולב Hoechst 33342 למדיום לריכוז סופי של 1 מיקרומולר ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, באמצעות מטרה של 40X, בחנו את התאים לביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים.

כדי לבצע אימונופלואורסצנציה עקיפה על תאים שהודגרו עם מגיב טרנספקציה: לאחר הכנת פרפורמלדהיד על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-PBS בטמפרטורת החדר כדי לשטוף את התאים על ידי סיבוב צלחת שש הבארות למשך חמש שניות. מוסיפים מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד טרי ו- PBS לבאר ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת על ידי סיבוב הצלחת ולזרוק את התמיסה.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 0.1% Triton-X 100 ב-PBS לכל באר ודגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לחלחל לתאים. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים ארבע פעמים, והשליך את התמיסה לאחר כל שטיפה. הוסיפו נוגדנים ראשוניים ודגרו על התאים בטמפרטורת החדר עם נדנוד במשך ארבע שעות.

לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים ארבע פעמים על ידי סיבוב הצלחת. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של נוגדנים משניים מצומדים בצבע פלואורסצנטי ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר עם נדנוד למשך שעתיים. לאחר שטיפת התאים ארבע פעמים עם PBS, הוסיפו מיליליטר אחד של DAPI ודגרו בחושך בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות.

אם משתמשים במשקפי כיסוי עם הדגימות, יש למרוח 10 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה במרכז שקופית המיקרוסקופ ולהרכיב זכוכית כיסוי מעל תמיסת ההרכבה. ואז לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, השתמשי בלק כדי לאטום את הקצוות ולדגור בחושך במכסה אדים במהלך הלילה.

כדי לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, השתמש במטרה של 40X עם ערכות המסננים עבור DAPI, CFP, FITC ו-Cy3 במידת הצורך. כפי שהודגם כאן, KIFB מסוג בר המתבטא באופן אקסוגני הופיע באופן הומוגני בציטופלזמה, בעוד ש-c-MYC הופיע בעיקר בגרעין. המוטציה חסרת המנוע KIF5B, לעומת זאת, יצרה אגרגטים בציטופלזמה וזה הוביל לצבירה של c-MYC.

בנוסף, ה-KIF5B חסר המנוע גרם גם לצבירה של ה-c-MYC האנדוגני וגורם השעתוק p53, מה שמצביע על כך ש-c-MYC ו-p53 הם שניהם המטענים של Kinesin-1 ו-KIF5B מווסת את הלוקליזציה התת-תאית של שני החלבונים האנדוגניים. איור זה ממחיש כי התנועה של גורמי השעתוק על ידי KIF5B נראית ספציפית מכיוון שהביטוי של המוטציה חסרת המנוע KIF5B לא השפיע על הלוקליזציה התת-תאית של c-Fos או גרם לו להצטבר. נתונים אלה חושפים כי השיטה המודגמת בסרטון זה מאפשרת זיהוי ספציפיות גבוהה של מטעני Kinesin-1.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהקינזינים המתאימים ביותר לתאים שיש להם נפח רב של ציטופלזמה כך שניתן לצפות בקלות בהצטברות בציטופלזמה. לאחר פיתוח זה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המנועים המולקולריים לבנות מוטציות שליליות דומיננטיות דומות של קינזין ומיוזינים אחרים על מנת לזהות את המטענים הספציפיים שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד להשתמש במוטציה השלילית הדומיננטית של מנוע מולקולרי כדי לזהות את המטען הזה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

אל תשכח שעבודה עם פנו, אתידיום ברומיד ופרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר איתם בעור בזמן ביצוע הליך זה. תודה שצפית. בהצלחה בניסוי שלך.