אינדוקציה של הפעלה האימהית חיסונית בעכברים בשלב אמצע הריון עם ויראלי לחקות פולי (אני: C)

המטרה הכללית של הליך זה היא להשרות הפעלה חיסונית אימהית, או MIA, בעכברים באמצעות הזרקה תוך-peritonium של המדמה הוויראלי poly בשלב העוברי של אמצע ההיריון. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוירו-אימונולוגיה, כגון כיצד תפקוד חיסוני לקוי יכול להוביל להפרעות בהתפתחות המוח ובהתנהגות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא תוכננה במיוחד עבור חוקרים המעוניינים לחקור MIA כגורם סיכון סביבתי לאוטיזם וסכיזופרניה.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקלו בקשיים, מכיוון שהבדלים קטנים בשיטת השראת ה-MIA עלולים לשנות באופן משמעותי את התגובה ההמשכית בצאצאים. כדי להקים זוגות להרבעה מתוזמנת, התחילו בגידול של חמש עכברות לכל כלוב, אחת לצד השנייה בכלובים סטנדרטיים לעכברים כדי לסנכרן את מחזורי הנסתרת (estrus) שלהן, והשתמשו במנקב אוזניים כדי לסמן כל בעל חיים. בין שעה לשעתיים לפני תחילת מחזור החשיכה, העבירו את העכברות כך שיהיו שתיים בכל כלוב, שקלו ורשמו את משקל הגוף של כל עכברה בנפרד, ולאחר מכן הוסיפו עכבר זכר אחד לכל כלוב שבו שתי עכברות.

בין אפס לארבע שעות לאחר סיום מחזור החשיכה, הרימו בעדינות כל עכברה נקבה מבסיס הזנב, ואפשרו לבעל החיים להיאחז בסבכת הכלוב בעזרת הרגליים הקדמיות, כדי לקבוע אם קיימת מסה לבננה בפתח הנרתיק. אם לא נראה פקק, הכניסו בעדינות טיפ של פיפטה בנפח 200 microliter לתוך פתח הנרתיק. התנגדות כתוצאה מקרישה מאשרת את היווצרותו של פקק.

העבירו את העכברים עם הפקק לנכס חדש, שכן נוכחותו של פקק נמקני מאשרת רק שבוצע זיווג. בימים עובריים 10.5 עד 11.5, הרימו כל נקבה עם פקק בבסיס הזנב ובדקו אם קיימת בליטה בבטן, לאחר מכן שקלו את העכברים כדי לאשש את ההיריון, ושכנו את בעלי החיים ההריות בכלובים נקיים בנפרד. שקלו את אבקת ה-poly(I:C) בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter.

ביום עוברי 12.5, הוסיפו את הנפח המתאים של 0.9% sodium chloride לנפח התואם של poly(I:C) בשפופרת קונוסית, וסגרו את הפקק. גלגלו בעדינות את טיפת הסלין על גבי האבקה עד שהתמיסה תהיה צלולה. לאחר מכן, צנטריפוגו את השפופרת והעבירו את תמיסת ה-poly(I:C) לשפופרת מיקרוצנטריפוגה.

השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את היחס בין 260 ל-280 של תמיסת ה-poly(I:C). היחס צריך להיות בין 1.54 ל-1.82, כפי שמתואר על ידי היצרן. לאחר מכן, שקול את העכבר הראשון ומלא מזרק אינסולין של 0.3 milliliter בנפח המחושב התואם של תמיסת ה-poly(I:C).

לאחר מכן, הרימו את העכבר באמצעות הזנב, הניחו אותו על גג הכלוב וקבעו אותו באחיזת עורף. כעת הכניסו את המחט, כאשר הצד המשופע פונה כלפי מעלה, למרכז שבין שתי הפטמות העליונות בזווית של כ-20 מעלות ביחס לעכבר, והזריקו את תמיסת ה-poly(I:C). לאחר מכן, החזירו את העכבר לכלוב.

לאחר שכל העכברים הוזריקו, שכן את הכלובים בחדר שקט עם תנועה מועטה כדי למנוע השפעות מבלבלות אחרות, ושקול את העכברים למחרת בבוקר. לפחות שלושה ימים לפני הבדיקה ההתנהגותית, החלף את מצע הכלוב של צאצאי ההפעלה החיסונית האימהית (MIA) הבוגרים, בני 8 עד 12 שבועות. 30 דקות לפני הבדיקה, דאג להסתגלות של העכברים לחדר הבדיקה.

לבדיקת עיכוב תגובת הבהלה (pre-pulse inhibition), הגבילו את העכברים בצילינדרי פלקסיגלס המונחים על חיישן פ piezoelectric. התאימו את העכבר לתא עיכוב תגובת הבהלה למשך חמש דקות, באמצעות שישה ניסיונות של רעש לבן בעוצמה של 120 decibels. לאחר מכן, חשפו את העכברים לתערובות אקראיות של צלילים, כפי שמפורט בטבלה, והשוו את התוצאות לתגובת הבהלה הבסיסית (baseline startle response), כדי לקבוע את רמת עיכוב תגובת הבהלה של חיות ה-MIA.

עבור מבחן שדה פתוח, מקמו עכבר בפינה של זירה ריבועית פתוחה, בעלת אזור מרכזי מוגדר של 17 על 17 סנטימטר, והקליטו את מסלולו של העכבר למשך 10 דקות באמצעות מצלמה המותקנת בתקרה. לאחר מכן, כמתו את מספר הכניסות לאזור המרכזי ואת הזמן שהועבר בו. עבור מבחן קבורת גולות, התאימו עכבר לכלוב בדיקה המכיל מצע של שבבי עץ אספן נקיים ודחוסים בעומק של 5 סנטימטר למשך 10 דקות, לאחר מכן החזירו את העכבר לכלוב הבית, וסדרו בעדינות 20 גולות זכוכית בצבע כחול כהה ובקוטר של 1.5 סנטימטר במטריצה של ארבע על חמש בתוך כלוב הבדיקה.

כעת החזירו את העכבר לכלוב הבדיקה למשך 10 דקות, לאחר מכן החזירו את בעל החיים לכלוב הבית, וספרו את מספר הגולות שנקברו במהלך תקופת הבדיקה. הזרקה של Poly(I:C) ביום עוברי 12.5 יכולה לעורר תגובה דלקתית חריפה בציר השילייה-עובר האימהי, ולהוביל להשפעה כרונית על התפתחות המוח ועל פנוטיפים התנהגותיים. ואכן, poly(I:C) משרה ביטוי גבוה יותר של הגן Il6 בטחול האימהי, בשילייה ובמוח העובר, שלוש שעות לאחר ההזרקה.

באופן כללי, בהשוואה לצאצאים בוגרים שטופלו בתמיסת מלח, צאצאים בוגרים עם MIA מראים פחות כניסות לאזור המרכזי ומשך זמן קצר יותר באזור המרכזי במבחן השטח הפתוח. בעלי חיים שהוזרק להם poly(I:C) מפגינים גם התנהגויות קבירה תכופות יותר במבחן קבירת הגולות, ועכבה מקדימה (pre-pulse inhibition) נמוכה יותר. אובדן של תאי פורינז'ה באונה השביעית של המוחון הוא סימן היכר נוסף של צאצאים עם MIA, כאשר נצפו פחות תאי פורינז'ה חיוביים לקאלבינדין באונה השביעית של המוחון בבעלי חיים אלו, בהשוואה לקבוצות ביקורת שהוזרק להן מלח.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שלא להפריע לעכברים ההריות לאחר השראת MIA. לאחר מכן, ניתן להשרות גורמים נוספים, כגון סטרס פוסטנטלי או זיהום, כדי לחקור אינטראקציות נוספות עם הסביבה.