Name: בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למדו לבחון חלבונים הקשורים ל-DNA חדש בתאי יונקים באמצעות שיטת BrdU-ChIP-Slot-Western. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מדויק ומהיר של אינטראקציות חלבון-DNA בתהליכי שכפול ותיקון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה בכתב יד זה נתמכה על ידי כספים מחוג לאונקולוגיה הקרינה וצייד מכון הסרטן והמכון הלאומי לבריאות מענק (R01-CA188520) לSB. אני מודה דניאל ג&#39;ונסון וסטיבן בנט במעבדה שלי עבור הוכחה בפרוטוקול ומסביר את היתרונות שלה. אני אסיר תודה לד&quot;ר מאהש Chandrasekharan (צייד מכון הסרטן) להערות ביקורתיות על כתב היד.

1. immunoprecipitation הכרומטין (שבב) הבאים תיוג BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי NIH3T3 תרבות בנוכחות או DMSO או מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי כפי שתואר לעיל 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות טיפול במעכבים סלקטיביים DMSO או HDAC1,2, להוסיף BrdU לתאים בתרבית רקמת מכסה המנוע סטרילי. דגירה 2 x 10 6 NIH3T3 תאים מצופים ב 10 מיליליטר תקשורת NIH3T3 עם 20 מיקרומטר ריכוז סופי של bromodeoxyuridine (BrdU) במשך 60 דקות בתרבית רקמת חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבוני Crosslink תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות לתקשורת והתרבות בריכוז סופי של 1%. דגירה 2 x 10 6 תאי NIH3T3 עם פורמלדהיד ב RT במשך 10 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את הקישור הצולב על ידי התוספת של גליצין לריכוז סופי של 125 מ&quot;מ. לדגור על RT במשך 5 דקות על שייקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה ולאסוף תאים בPBS בצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר. cel ספיןLS 956 בXG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס. שטוף את התא גלולה פעמיים עם PBS קר כקרח. הסר PBS מהצינור. אחסן את התא גלולה צולבים ללא PBS (supernatant) ב -80 ° C עד שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את lysate מהתא גלולה crosslinked על ידי הוספת חיץ FA140 500 μl (50 מ&quot;מ של HEPES KOH 7.5 pH, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגזירה הכרומטין ידי sonicating דוגמאות חמש פעמים ב -35% כוח ועם דופק 15 שניות, 0.9 שניות ובהגדרה 0.1 שניות מ. שמור את הצינורות על קרח לאחר כל סיבוב של sonication כדי למנוע חימום של הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הגז על ג&#39;ל DNA כיעילות הגז תנוע בין sonicators שונה. כדי לבדוק sonication, הפוך crosslink ידי הוספת NaCl בריכוז של 0.16 M ולבצע צעדים 1.17.1. - 1.22. הפעלת eluted 10 DNA μl על ג&#39;ל agarose 1.5% כדי לבדוק אם הגז הואבין 300-700 נקודות בסיס בעוצמה ממוצעת על 500 נקודות בסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות sonication, דגימות צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 17949 XG ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הערכת חלבון באמצעות ערכת assay החלבון המסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. השתמש בכמות שווה של lysate לשבב של שליטה ודגימות ניסוי. בדרך כלל, להשתמש 1 מ&quot;ג של lysate הכולל לכל תגובת שבב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרחיף 50% מ- agarose חלבון באמצעות חיץ FA140 המכיל מעכבי פרוטאז קוקטייל. להוסיף 1/10 נפח של מעכבי פרוטאז הקוקטייל. חשב את הנפח של חרוזים צורך מבוסס על מספר הדגימות בסך הכל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים-agarose חלבון לשטוף עם חיץ FA140 פעמיים כדי להסיר את חיץ האחסון ולהוסיף נפח שווה לחיץ FA140 לחרוזים לעשות slurry 50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר חלבונים שאינם במיוחד לאגד את חרוזים, להוסיף 50 μl של תרחיף 50% מ- agarose חלבון ובcubate הדגימות ב 4 ° C עם רוטציה הסוף-על-קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך דקה. לאסוף את supernatant ולבצע immunoprecipitation על ידי הוספה או נוגדן H4K16ac 8 μl או 5 μl (5 מיקרוגרם) של 1 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדן SMARCA5 לsupernatant. דגירה על 4 מעלות CO / N עם סיבוב קצה על קצה קבוע במיקסר מתקן צלייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסכים 1/10 בתמצית לשליטה &#39;קלט&#39; ולהגדיר אותו כצד ב -20 ° C. הקלט צריך להיות הפוך צולבים יחד עם דגימות ה- IP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות שווה של IgG ארנב (5 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר) כמדגם immunoprecipitation ביקורת השלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף 50 μl של 50% תרחיף-agarose חלבון לתמצית דגירה עבור שעה 1 על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים agarose ידי צנטריפוגה ב956 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C, להסיר את supernatant וwa זהירותsh חרוזים עם המאגרים ברצף הבאים. בהכנות חיץ, להוסיף מעכבי פרוטאז ממש לפני השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח נמוך מורכבת הצפת לשטוף חיסונית (FA140; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 140 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם מלח גבוה קומפלקס הצפת לשטוף חיסונית (FA500; ריכוז סופי של 50 מ&quot;מ של HEPES KOH pH 7.5, 500 מ&quot;מ של NaCl, 1 מ&quot;מ של EDTA (pH 8.0), 1% Triton-X-100 ושל 0.1% deoxycholate נתרן) ל 5 דקות במעלות צלזיוס 4 עם סיבוב קצה על קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם LiCl מורכב הצפת לשטוף חיסונית (ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ של טריס-Cl pH 8.0, 250 מ&quot;מ של LiCl, 0.5% ו -0.5% NP40 deoxycholate נתרן) במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם רוטציה הסוף-על-קצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות שטיפות כפי שתואר לעיל, להוסיף 200 פתרון elution μl (ריכוז סופי של SDS 1% ויקרבונט 100 מ&quot;מ נתרן) וincubatדואר ב RT במשך 15 דקות עם סיבוב קצה על קצה על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין הדגימות ב956 XG ב RT ולהעביר את eluate לצינור 1.5 מיליליטר חדש. חזור על שלב 1.15 עם פתרון elution 200 μl נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 400 μl של eluate, להוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M ומערבבים היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, להוסיף פתרון elution 400 μl 10 קלט μl שלהפריש (שלב 1.11) ולהוסיף NaCl לריכוז של 0.16 M להפוך דגימות קלט crosslink גם כן. הפוך crosslink הדגימות ידי דוגרים באמבט המים C ° 65 במשך 5 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של 100% EtOH לeluate ההפוך-crosslinked. מערבבים היטב דגירה ב -80 ° C 2 - 3 שעות או ב -20 CO ° / N. ספין הדגימות ב17949 XG במשך 15 דקות וזורקי אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 800 אתנול 70% μl ללשטוף את הכדור. ספין ב17949 XG במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס וזורקי אתנול. ספין בקצרה כדי להסיר כל אתנול שיורית. האוויר יבש הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר אתנול שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים DNA ב -90 RNase μl ומים חופשיים DNase ולהוסיף 2 μl 10 מ&quot;ג / מיליליטר RNase ב0.2 מ&quot;ג / מיליליטר ריכוז סופי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl 10x proteinase K הצפת (100 מ&quot;מ טריס pH-Cl 8.0, 50 מ&quot;מ EDTA pH 8.0, 5% SDS). מערבבים היטב ומוסיף μl 1 proteinase ק לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר DNA קלט והשבב באמצעות ערכת טיהור מסחרית PCR על פי הפרוטוקול של היצרן וelute DNA במי 50 μl. DNA החנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. </li></ol> 2. חריץ ניתוח כתם של השבב ה- DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את התשואה של קלט ושבב ה- DNA eluted במי 50 μl כמתואר בשלב 1.22 באמצעות ספקטרופוטומטר ב 280 ננומטר פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שווה (50 μl) של קלט או DNA immunoprecipitated שנמצאים בטווח ליניארי של זיהוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא, אם קלטתשואת DNA היא 1.5 ng / μl, ואז לקחת 30 μl (או 45 ng DNA סך הכל) ולהפוך את נפח 50 μl עם מים. לשבב גורם, לקחת את כל eluate 50 μl משלב 2.1 והמשיכו לשלב 2.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל 50 קלט μl או DNA immunoprecipitated ידי הוספת 2.5 כרכים של 0.4 N NaOH, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות לXG 956 במשך 10 שניות, ולדגור על RT למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את ה- DNA מפוגל ידי הוספת 175 μl של 1 M טריס- HCl, pH 6.8, מערבולת, צנטריפוגות במשך 956 XG במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן דילול סדרתי של קלט וDNA immunoprecipitated עבור assay כתם חריץ כמפורט להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 2.3-2.4 כדי לקבל נפח דגימה כולל של 350 μl (כלומר, 50 קלט μl / השבב ה- DNA, 125 μl 0.4 N NaOH, 175 μl 1 M טריס- HCl, pH 6.8). הערה: הדוגמא האמורה לעיל, 45 ng של DNA הקלט יהיה בסופו .129 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לDNA קלט, תווית שלושה צינורשל 100, 50 ו -25 ולהוסיף 100 μl, 50 μl ו -25 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך את הנפח הסופי 100 μl עם מים nuclease חינם. לשבב ה- DNA, תווית שלושה צינורות 200, 100 ו -50 ולהוסיף 200 μl, 100 μl ו -50 μl של דגימת DNA מפוגל ונוטרלה. הפוך נפח סופי 200 μl עם מים nuclease חינם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום לגודל של מנגנון כתם חריץ. טרום להרטיב את הקרום וניירות סופג ב20x SSC לפני ולפני הוספת ה- DNA. להרכיב אותם למנגנון כתם חריץ על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA Pipet מצעד 2.5.2 לחריצים מתאימים. החל ואקום לאט למשוך את ה- DNA על הממברנה זטה-בדיקה. תפסיק ואקום לאחר כל הדגימות שעברו במנגנון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את המנגנון ולשתק באופן מיידי את ה- DNA על הממברנה באמצעות crosslinker UV. יש צד DNA בcrosslinker UV ולהשתמש autocrosslink ההגדרה בcrosslinker. עקוב הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי BrdU על כתם החריץ על ידי ביצוע מערבי סופג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה עם 5% חלב יבש ללא שומן PBS המכילים 0.1% Tween-20 (PBST) במשך שעה 1 ב RT כדי למנוע שאינו ספציפי המחייב של נוגדנים לממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדן ראשוני נגד BrdU (1: 500 דילול) בדילול מלא בחלב 1% יבשים ללא שומן בPBST דגירה הכתם עם הנוגדן הראשוני עבור 3 שעות ב RT על שייקר. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה הנוגדן הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן המשני אנטי עכבר HRP-מצומדות לכתם (1: דילול 5000) ולדגור על RT עבור שעה 1. לשטוף את הממברנה עם PBST שלוש פעמים לאחר הדגירה נוגדנים משני. הערה: השתמש בנפח מספיק של הנוגדנים כדי לכסות את הקרום במהלך incubations נוגדן הראשוני והמשני לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת ECL ולהוסיף אותו לAC הכתםcording לפרוטוקול של היצרן. דגירה הממברנה עם תערובת ECL במשך 5 דקות על RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום בקלטת רנטגן, לחשוף את הקרום לסרט X-ray ולפתח את הכתם באמצעות הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את האות המתקבל עבור קלט וDNA ChIPed לאחר סריקת הכתמים באמצעות תוכנת J תמונה על פי הפרוטוקול של היצרן. לכימות, להשתמש באות שנמצאת בטווח ליניארי של זיהוי על מנת להבטיח דיוק של מדידה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Podhorecka, M., Skladanowski, A., Bozko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+Phosphorylation%3A+Its+Role+in+DNA+Damage+Response+and+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+nucleic+acids%22%5BJournal%5D)">H2AX Phosphorylation: Its Role in DNA Damage Response and Cancer Therapy.</a> J nucleic acids. , (2010).</li>
<li>Groth, A., Rocha, W., Verreault, A., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+challenges+during+DNA+replication+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin challenges during DNA replication and repair.</a> 128, 721-733 (2007).</li>
<li>Demeret, C., Vassetzky, Y., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+DNA+replication%3A+from+nucleosomes+to+loop+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and DNA replication: from nucleosomes to loop domains.</a> Oncogene. 20, 3086-3093 (2001).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+histone+deacetylase+3+reveals+critical+roles+in+S+phase+progression+and+DNA+damage+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Deletion of histone deacetylase 3 reveals critical roles in S phase progression and DNA damage control.</a> Mol Cell. 30, 61-72 (2008).</li>
<li>Bhaskara, S., Hiebert, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+histone+deacetylase+3+in+maintenance+of+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role for histone deacetylase 3 in maintenance of genome stability.</a> Cell Cycle. 10, 727-728 (2011).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+maintain+S-phase+chromatin+and+DNA+replication+fork+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 maintain S-phase chromatin and DNA replication fork progression.</a> Epigenetics Chromatin. 6, 27(2013).</li>
<li>Bhaskara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hdac3+is+essential+for+the+maintenance+of+chromatin+structure+and+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability.</a> Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).</li>
<li>Johnson, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC1%2C2+inhibition+impairs+EZH2-+and+BBAP-mediated+DNA+repair+to+overcome+chemoresistance+in+EZH2+gain-of-function+mutant+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">HDAC1,2 inhibition impairs EZH2- and BBAP-mediated DNA repair to overcome chemoresistance in EZH2 gain-of-function mutant diffuse large B-cell lymphoma.</a> Oncotarget. 6, 4863-4887 (2015).</li>
<li>Bhaskara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylases+1+and+2+regulate+DNA+replication+and+DNA+repair%3A+potential+targets+for+genome+stability-mechanism-based+therapeutics+for+a+subset+of+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylases 1 and 2 regulate DNA replication and DNA repair: potential targets for genome stability-mechanism-based therapeutics for a subset of cancers.</a> Cell Cycle. 14, 1779-1785 (2015).</li>
<li>Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. B., Turner, B. M., Almouzni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplication+and+maintenance+of+heterochromatin+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Duplication and maintenance of heterochromatin domains.</a> J Cell Biol. 147, 1153-1166 (1999).</li>
<li>Alabert, C., Groth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+replication+and+epigenome+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin replication and epigenome maintenance.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 153-167 (2012).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492, 280-284 (2012).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25, 1320-1327 (2011).</li>
</ol>

אין לי אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הוא שיטה מהירה יחסית להפגין הנוכחות של חלבונים או הצורות שונה לאחר translationally על DNA משוכפל או המתהווה חדשים. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת לאדם למדוד את קינטיקה עמותה-הניתוק של חלבון או צורה שונה שלה עם ה- DNA המתהווה. טכניקה זו היא משלימה את טכנולוגית iPOND האלגנטית 13. בטכנולוגית iPOND, DNA מסונתז חדש שכותרתו עם deoxyuridine אתיל (edu). המצומד ביוטין הוא הוסיף לאחר מכן על edu באמצעות הכימיה לחץ. ה- DNA המתהווה מתויג ביוטין אז immunoprecip...

תיקון דנ&quot;א פגום ו / או שכפול ה- DNA הוא אחד גורמים עיקריים לחוסר יציבות הגנום, שיכול לגרום למוות של תאים. הפסקת גדיל בודדת מתוקנת כפולה מספיקה כדי לגרום לתא מוות 1. ארגון הכרומטין משתנה זמני במהלך שני השכפול ולתקן 2,3, ואי-שמירה על מידע אפיגנטיים בתהליכים אלה יביאו לאיום על שלמות הגנום. אובדן HDAC3 או פונקצית HDAC1,2 מעכב התקדמות S-שלב, שכפול הדנ&quot;א ותיקון מוביל ללחץ genotoxic (נזק לדנ&quot;א) ותא מות 4-9. לכן אסטרטגיה מעשית לשימוש במעכבי HDAC סלקטיבית לשבש שכפול, תיקון והכרומטין בתאי סרטן ולגרום נזק לדנ&quot;א, אשר בתורו יכול לעצור את הצמיחה ולגרום למוות של תאים באופן סלקטיבי בתאי הסרטן גדלו במהירות. במהלך שכפול הדנ&quot;א, הכרומטין הוא מפורק במהירות ולאחר מכן מחדש הבא שכפול ה- DNA. חדש סאיH4 היסטון nthesized הוא acetylated בK5 ושאריות K12 (H4K5K12ac) והתצהיר הבא על הכרומטין, הם deacetylated במהירות על ידי deacetylases היסטון (HDACs) 10,11. כישלון של תאים כדי לשמור על שלמות הכרומטין המתהווה ידי deacetylation היסטון יכול להוביל לקריסת מזלג, אשר בתורו יכול לגרום לניזק לדנ&quot;א ומוות של תאים. לאחרונה הראה כי עיכוב סלקטיבי של HDAC1,2 מגביר acetylation היסטון (H4K5ac, H4K12ac וH4K16ac) ומעכב את פעילות remodeler הכרומטין SMARCA5 על הכרומטין המתהווה, שבקורלציה עם התקדמות מזלג שכפול מופחתת, הגדילו את קריסת מזלג והגדילו את הנזק לדנ&quot;א מתח מושרה שכפול 6 . לפיכך, טיפול מעכב HDAC יכול לשנות את מבנה הכרומטין המתהווה כדי לעורר נזק לדנ&quot;א ומוות מהר מאוד בתאי סרטן, כמו מחזור תאים אלה במהירות ועובר פעמים רבות דרך S-השלב. לכן חשוב להבין כיצד HDACs לתפקד להסדיר acetylation היסטון ובינדי החלבוןng לשמור שכפול ה- DNA בתאי יונקים. כמותית למדוד את כמות acetylation היסטון וremodeler הכרומטין SMARCA5 קשורה עם DNA המתהווה בעת שכפול ה- DNA, שהמצאנו assay שבב שונה נקרא טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבית. בעקבות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של שינוי חלבון או היסטון רצוי, כמות ה- DNA המתהווה (שכותרתו באמצעות אנלוגי תימידין, BrdU) במדגם השבב ניתן לאתר באמצעות ניתוח מערבי של שכותרת BrdU השבב ה- DNA מועבר על גבי קרום באמצעות חריץ מנגנון כתם. שימוש בטכניקה זו, הראינו כי בן משפחת ISWI SMARCA5 (רגולטור אקטין תלויה הקשורים מטריצה ​​הקשורות SNF SWI / של הכרומטין) remodeler הכרומטין H4K16ac (סימן המעורב באריזת הכרומטין) וקשורים עם ה- DNA בתאים המתהווה S-שלב 6. מצאנו גם כי סימן H4K16ac המתהווה הוא deacetylated ידי HDAC1,2 במהלך שכפול הדנ&quot;א 6. מעכב H4K16acפעילות remodeler הכרומטין בן משפחת ISWI 12 SMARCA5 של. לפיכך, שימוש בטכניקת BrdU-CHIP-חריץ-מערבי, אנחנו יכולים לחבר את הפונקציות לHDAC1,2 בויסות שיפוץ הכרומטין בעת ​​שכפול ה- DNA. לפיכך, טכניקת BrdU-שבב חריץ-המערבי הכתם היא גישה רבת עוצמה למדידת כמותית דינמיקת העמותה וניתוק של חלבונים או לאחר translational שינוייהם שקשורים ל- DNA המתהווה.

<table><tbody><tr><td>אנטי-BrdU (מערבונים)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-H4K16ac</td><td>מוטיב פעיל</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT ממברנה</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>פישר</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A אגרוז</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG& נ.ב.פ;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>דקון מעבדות</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>מים מטופלים DEPC</td><td>סיגמא</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>טריס</td><td>פישר</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>אמביון</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>מלינקרודט GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>מעבדת חלב יבש ללא שומן</td><td>Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>סרט רנטגן</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>מפתח</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>ברנסון סוניפייר&nbsp; משבש תאים אולטרסאונד דיגיטלי</td><td>דגם: 450</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>דגם: אמבט מים 5810R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק איזוטמפ</td><td>דגם: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoScientific</td><td>דגם: 1000</td><td></td></tr><tr><td>Slot Blot Trainer&nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>חממת תרבית רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 חממות</td><td></td> CO2 עם מעטפת מים</tr></tbody></table>

בדיקה של החלבונים bound לינוקא dna בתאי יונקים באמצעות טכניקת brdu-שבב חריץ-מערבי

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

deacetylases היסטון 1 ו -2 (HDAC1,2) בתרגום לאתרים של שכפול הדנ&quot;א. במחקר הקודם, באמצעות מערכת מציאה גנטית מעכב וסלקטיבי, הראינו פונקציות חדשניות לHDAC1,2 בהתקדמות מזלג שכפול ותחזוקת הכרומטין המתהווה בתאי יונקים. בנוסף, השתמשנו בטכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי המשלבת immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של bromo-deoxyuridine DNA -labeled (BrdU) עם כתם חריץ ומערבי מנתחת למדוד כמותית חלבונים או שינוי היסטון קשור עם DNA המתהווה. פעיל טופלו תאי החלוקה עם מעכב סלקטיבי HDAC1,2 או transfected עם siRNAs נגד Hdac1 וHdac2 ולאחר מכן DNA מסונתז חדש תויג עם bromodeoxyuridine האנלוגי תימידין (BrdU). תיוג BrdU נעשה בנקודת זמן שבו לא הייתה עצירת מחזור התא משמעותית או אפופטוזיס עקב האובדן של פונקציות HDAC1,2. l הבאabeling של תאים עם BrdU, immunoprecipitation הכרומטין (שבב) של סימני acetylation היסטון או הכרומטין-remodeler בוצע עם נוגדנים ספציפיים. ה- DNA הקלט שכותרת BrdU וimmunoprecipitated (או ChIPed) DNA אז הבחינו על קרום באמצעות טכניקת כתם חריץ ומשותק באמצעות UV. כמות ה- DNA המתהווה בכל חריץ אז כמותית הוערכה באמצעות ניתוח מערבי עם נוגדן אנטי BrdU. ההשפעה של אובדן של פונקציות HDAC1,2 ברמות של סימנים מסונתזים חדש הקשורים DNA היסטון acetylation וremodeler הכרומטין הייתה אז נקבעה על ידי נרמול אות BrdU-השבב המתקבלת מהדגימות שטופלו על דגימות השליטה.

כדי לקבוע את הספציפיות של מעכבי HDAC1,2 סלקטיבי, תאי fibrosarcoma Hdac1,2 פלורידה / פלורידה וHdac3 פלורידה / פלורידה היו בשימוש. recombinase Cre (Ad-Cre) המכיל אדנווירוס שימש למחוק Hdac1,2 וHdac3 בתאים אלה. זיהום Ad-Cre הבא של Hdac1,2 פלורידה / פלורידה תאים, עלייה חזקה בH4K5ac נצפו. טיפול בתאי נוקאאוט Hdac1,2 עם 233 או 898 לא לגרום לעלייה נו...

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה חדשה של BrdU-ChIP-Slot-Western לבחינת חלבונים ושינויים בהיסטונים הקשורים ל-DNA חדש או מתהווה.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון במהירות חלבונים הקשורים ל-DNA המתהווה בדיוק באמצעות תיוג BrdU ומשקעי כרומטין. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בשכפול, תיקון בשדה הכרומטין, כגון, אילו חלבונים קשורים ל-DNA המתהווה במהלך שכפול ה-DNA ואילו חלבוני תיקון קשורים ל-DNA המתהווה במהלך מתח שכפול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה מהירה יחסית לאיתור חלבונים הקשורים ל-DNA המתהווה בצורה כמותית ביותר.כדי להתחיל, הקימו תרביות של שני מיליון תאי NIH 3T3 ב-10 מיליליטר מדיה עם DMSO או מעכבים. כמו כן, הוסף BrdU לריכוז סופי של 20 מיקרומולר. לאחר הציפוי, דגרו על התאים למשך 60 דקות.לאחר שעה, יש לקשר את החלבונים התוך תאיים ל- DNA על ידי הוספת פורמלדהיד ישירות למדיום התרבות לריכוז של 1% בנפח. לאחר מכן, תנו לתאים לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם תסיסה. לאחר 10 דקות, הרוו את התגובה על ידי הוספת גליצין למדיה ל-125 מילימולר והמשיכו את הדגירה למשך חמש דקות נוספות.לאחר מכן, אספו את התאים ב-PBS ושטפו אותם פעמיים עם PBS באמצעות צנטריפוגה. ניתן להקפיא את הגלולה ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון אם רוצים. כעת, הכינו את הליזאט מהתאים המקושרים, הוסיפו 500 מיקרוליטר של מאגר FA140 בתוספת קוקטייל מעכב הפרוטאז לגלולה וגזזו את הכרומטין באמצעות חמישה פולסים של 15 שניות של סוניקציה.שמור על התאים צוננים בין הפולסים. לאחר מכן, הפעל 10 מיקרוליטר של דגימה על ג'ל של 1.5% כדי לאבחן את יעילות הגזירה. לאחר הגזירה, צנטריפוגה את הדגימות למשך 10 דקות, והעבירו את הסופרנטנט לצינור חדש.לאחר מכן, העריכו את ריכוז החלבון בסופרנטנט באמצעות ערכה. לאחר מכן, הכינו תרחיץ של 50% של חרוזי אגרוז חלבון A עם חוצץ FA140 המכיל מעכב פרוטאז. הוסף 50 מיקרוליטר של התרחיץ לכל דגימה ודגר את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב קבוע מקצה לקצה למשך 30 דקות.לאחר חצי שעה, סובבו את הדגימות למשך דקה בסביבות 1000 גרם בצנטריפוגה מקוררת. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את הכרומטין המסומן. לפני שתמשיך, שמור 1/10 מהתמצית ב-20 מעלות צלזיוס כדי לשמש מאוחר יותר כבקרת הקלט.כדי לזרז את הכרומטין, הוסף שמונה מיקרוליטרים של נוגדן H4K16ac או חמישה מיקרוגרם של נוגדן SMARCA5 לסופרנטנטים. כמו כן, הוסף חמישה מיקרוגרם של IgG מהיר לתמצית המשמשת כדגימת הבקרה השלילית. דגרו את הכרומטין בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה על מערבל רוטיסרי.למחרת, הוסיפו 50 מיקרוליטר מתמיסת אגרוז המוכנה 50% חלבון A למשקעים החיסוניים ודגרו על התערובות למשך שעה בחום של 4 מעלות צלזיוס בסיבוב. לאחר שעה, גלו את חרוזי האגרוז והשליכו בזהירות את הסופרנטנט. כעת, שטפו את החרוזים באמצעות סיבובים מקצה לקצה ב-4 מעלות צלזיוס בשלושה חוצצים עוקבים.ראשית, השתמש במאגר שטיפה חיסוני טרי דל מלח למשך חמש דקות. שנית, השתמש במאגר שטיפה חיסוני טרי ועשיר במלח למשך חמש דקות. שלישית, השתמש במאגר שטיפה טרי של קומפלקס חיסוני ליתיום כלוריד למשך חמש דקות.לאחר השטיפות, הוסף תמיסת פליטה לדגימות כמתואר בטקסט. סובב את הדגימות והעביר את הפליטה לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. כעת, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות כדי להפוך את הקישור הצולב.מאוחר יותר, זרז את ה- DNA. הוסף מיליליטר אחד של 100% אתנול לדגימות וערבב היטב. לאחר מכן, דגרו אותם בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעתיים-שלוש או למשך הלילה ב-20 מעלות צלזיוס.לאחר המשקעים, הסר את האתנול עם ceintrifugation של 15 דקות ב-18000 G. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הטקסט, שטפו את הגלולה, טפלו בדגימות ב-RNase, לאחר מכן Proteinase K, טהרו את ה-DNA כמתואר בטקסט, ולבסוף, אחסנו ב-20 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, מדוד את תפוקת הקלט וה-DNA של ChIP בספקטרופוטומטר.לאחר מכן, דנטורציה של הדגימות. הוסף 2.5 נפחים של 0.4 נתרן הידרוקסיד רגיל, מערבולת וצנטריפוגה בקצרה ודגר את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, נטרל את ה-DNA המפורק על ידי הוספת 175 מיקרוליטר של Tris hydochloride pH 6.8 טוחנת אחת.מערבולת, צנטריפוגה, ומניחים את הדגימות על קרח. כעת, הכינו דילולים סדרתיים של הקלט וה-DNA המשקע החיסוני והמשיכו בבדיקת כתם החריץ כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שה-DNA על הכתם היה משותק UV, זהה את ה-BrdU על כתם החריץ באמצעות כתמים מערביים.ראשית, יש לחסום את הממברנה עם חלב יבש ללא שומן 5% ב-PBST למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית. לאחר מכן, הכינו אמבטיה של חלב יבש דל שומן 1% ב-PBST בתוספת נוגדן מדולל 1:500 נגד BrdU. דגרו את הכתם באמבטיה זו למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר על שייקר.לאחר מכן, שטפו את הממברנה עם PBST שלוש פעמים. לאחר מכן, טבלו את הכתם בדילול של 1:5000 של נוגדן משני מצומד נגד עכבר HRP ב-PBST. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול.השתמש בשלוש שטיפות עם PBST כדי להסיר את המשני ולנתח את התוצאה. הטכניקה המערבית של חריץ BrdU H4K16ac ChIP שימשה לקביעת כמות ה-H4K16ac הקשורה ל-DNA המתהווה. העשרה חזקה ב-H4K16ac הקשורה ל-DNA המתהווה נצפתה בהשוואה לבקרת IgG מהירה.בעקבות עיכוב של HDAC1/2 עם תרכובת 233, נצפתה עלייה ב-H4K16ac הקשור ל-DNA המתהווה. אותה תוצאה הושגה באמצעות תרכובת 898. לבסוף, רמת SMARCA5 כרומטין מחדש על DNA מתהווה נקבעה באמצעות הטכניקה המערבית של חריץ BrdU SMARCA5 ChIP.ואכן, SMARCA5 הקשורים לדנ"א המתהווה ולתרכובת 898 לא שינו את רמות SMARCA5. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב את השינויים המתרחשים בכרומטין ובאנזימים משני כרומטין במהלך שכפול DNA בתאי יונקים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השכפול לחקור שינויים בכרומטין ב-DNA המתהווה, כמו גם דינמיקה של חלבוני תיקון DNA ב-DNA המתהווה.בעתיד, טכניקה זו תוכל לשמש גם לחקר הדינמיקה של תגובת נזק ה-DNA וחלבוני תיקון ה-DNA במזלג התקוע בנוסף לחקר השינויים בהיסטון ואנזימים משני כרומטין במזלג.

examination-proteins-bound-to-nascent-dna-mammalian-cells-using-brdu

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

קביעת המיקום של מחזור התא אוכלוסייה של תאים, או להבין כיצד להשפיע על התפשטות אותות, ניתן למדוד בקלות על ידי זרימת cytometry בפרוטוקול זה. אנו מדווחים על גישה ניסויית פשוטה מכתים תאים לכימות עמדתם מחזור התא.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לצביעת BrdU immunofluorescence. הטכניקה מאפשרת זיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדנים מאפשרת ניתוח מפורט של גורל תאי שלב S בזמנים מאוחרים יותר.

BrdU Immunofluorescence Staining: טכניקה לזיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים כיצד לדמיין כריתת קצה דו-גדילית של דנ"א במהלך שלב S/G2 של מחזור התא באמצעות שיטה מבוססת אימונופלואורסצנטיות.

הערכה של כריתת קצה כפולת גדילים של DNA גלובלי באמצעות תיוג BrdU-DNA בשילוב עם הדמיית אפליה במחזור התא

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

הפרוטוקול הבא מציג זיהוי של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא תוך שימוש בסנכרון מחזור התא ואחריו צביעה אימונופלואורסצנטית RPA2.

הדמיה של מוקדי DNA חד-גדיליים בשלב G1 של מחזור התא

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

הפרעות למינופתיה מובילות לעתים קרובות לשינויים במעטפת הגרעין, מה שעלול לגרום לבליבינג גרעיני ודליפה. מחקר זה מציג שיטה אימונופלואורסצנטית להדמיית הלמינה הגרעינית יחד עם DNA דו-גדילי (dsDNA), המספקת אמצעי להערכת מבנה ושלמות גרעין בתאי יונקים.

איתור בלב גרעיני ודליפת DNA בתאי יונקים על ידי אימונופלואורסצנציה

למדו לבחון חלבונים הקשורים ל-DNA חדש בתאי יונקים באמצעות שיטת BrdU-ChIP-Slot-Western. טכניקה זו מאפשרת זיהוי מדויק ומהיר של אינטראקציות חלבון-DNA בתהליכי שכפול ותיקון.

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

גלה סרטונים נוספים