ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH (1R01CA137494, R01CA132115, R01CA086072 ל-R.G.P.), מענק הליבה של מרכז הסרטן של מרכז הסרטן של קימל NIH P30CA056036 (R.G.P.), מענק מהקרן לחקר סרטן השד, מענקים נדיבים מקרן המחקר הרפואי של ד"ר ראלף ומריאן סי פאלק (R.G.P.) ומענק ממשרד הבריאות של פנסילבניה (R.G.P). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של הקרן האמריקאית האיטלקית לסרטן (G.D.) ומשאב משותף להדמיה ביולוגית של מרכז הסרטן סידני קימל (NCI 5, P30, CA-56036). המחלקה מתנערת באופן ספציפי מאחריות לניתוח, פרשנויות או מסקנות. אין ניגודי אינטרסים הקשורים לכתב היד הזה.

1. Electroporation של פיברובלסטים עם שניהם הביטוי וקטורים EYFP-פרקין ו pDsRed2-מיטו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את תאי פיברובלסטים עובריים בעכבר הונצח על 10 סנטימטר צלחת רקמות תרבות באמצעות DMEM (המדיום של הנשר השונה של Dulbecco) בינוני בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / ml פניצילין, ו -100 מ&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין באווירה humidified המכיל 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 80% התא confluency, להשליך את המדיום DMEM מלאה על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסת פוספט חיץ 1x סטרילי (PBS) (80 גרם של NaCl, 2.0 גרם של KCl, 14.4 גרם של Na 2 4 HPO, 2.4 גרם של KH 2 PO 4 ו -1 L מזוקקים H 2 O, PH: 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ&quot;ל של מדיום DMEM מלאה, resuspend התאים ולהוציא 10 _6; l של ההשעיה תא עבור ספירת hemocytometer. הערה: hemocytometer מתוכנן כך שמספר התאים סט אחד של 16 ריבועים בפינה הוא שווה למספר של תאים x 10 4 / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 1 x 10 6 תאים על 10 ס&quot;מ רקמות תרבות מנות 24 שעות לפני תהליך electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את מדיום DMEM המלא על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS סטרילית. בטל PBS על ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין- EDTA. דגירה את הצלחת על 37 ° C עד שהתאים מנותקים (2 - 3 דקות). הוסף 4 מ&quot;ל של מדיום DMEM מלאה ו resuspend התאים בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות באמצעות צנטריפוגות-בקירור (4 מעלות צלזיוס). בטל supernatant ידי יניקה סטרילית resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של PBS סטרילית. ספין התאים למטה ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ידי יניקה סטרילי, ולהוסיף 100 μl of שילוב פתרון electroporation (82 μl של electroporation פתרון V + 18 μl של פתרון משלים 1) אל תא גלולה בעדינות resuspend גלולה ידי pipetting (לפרטים נוספים עיין במדריך למשתמש). הוסף 2 מיקרוגרם של EYFP-פרקין (עירור / פליטה 514/527) ו 1 מיקרוגרם pDsRed2-מיטו (עירור / פליטה 565/620) בבית ההשעיה תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הפתרון כדי קובט סטרילי באמצעות פסטר הפנויה (שני הכלים הם מצורפים לערכה) ו electroporate באמצעות התכנית שנקבע מראש NIH / 3T3 U-030 (דופק יחיד, מתח 200 V, קיבול 960 μF, דופק זמן 20 אלפיות שני דופק, מספר: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר electroporation, להוסיף 500 μl של מדיום DMEM מלאה טרום חימם טרי וזרעי התא על צלחת 6 ס&quot;מ רקמות תרבות חיה הדמיה בדרגה דגירה אותם באווירה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol> 2. מיקרוסקופית זמן לשגות וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; הגדר את הטמפרטורה של תא מיקרוסקופ ב 37 ° C לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, להכין מדיום הדמיה חיה ספציפית כדי להמשיך עם פרוטוקול הניסוי. הכן את המדיום הדמיה לחיות כדלקמן; לערבב בתוספת פנול ללא DMEM עם 10% בסרום שור עוברית, 2 mmol / L L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, ו -100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. טרום לחמם את המדיום הדמיה לחיות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המדיום של תאים electroporated ידי יניקה סטרילי ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום הדמיה מחומם מראש חי, באמצעות pipet P1000 דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת דגירת צלחת, זרם 5% CO 2 בתא של מיקרוסקופ כבר בטמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת עם תאי electroporated ההחדרה של מיקרוסקופ הימנעות תנודות משמעותיות או תנודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ממשק התוכנה, להגדיר את המיקרוסקופ כדי לזהות הן fluoreScence אותות מן החלבונים היתוך המקודדים על ידי וקטורים-טרנספקציה שיתוף, EYFP-פרקין (טווח עירור 495 כדי 510 ננומטר ופליטה טווח 520 כדי 550 ננומטר, ירוק) ואת ננומטר pDsRed2-מיטו (558 ננומטר מקסימום עירור ופליטה 583 מקסימום, אָדוֹם). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. בתפריט העליון בחר FITC עבור EYFP-פרקין ו Rhodamine עבור pDsRed2-מיטו. בתפריט העליון בחר את ההגדלה (20X). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ממשק התוכנה, חפש את התא הבודד שמבטא וקטורי שיתוף transfected ולרשום את המיקום. חזור על פעולה זו עד למינימום של 10 תאים נאסף עבור כל תנאי הניסוי (קבוצת הניסוי). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתפריט &quot;Apps&quot; ולחץ על רכישה רבה ממדים. בחלונות רכישת Multi Dimensional לבחור את הפרמטרים הדרושים, כגון מספר רכישות, מרווח הזמן בין כל רכישה ואת המיקום של התא מוקלט. לחץ על &quot;לרכוש&quot;כדי להתחיל את תהליך הרכישה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את רכישת הבסיס של שניהם EYFP-פרקין ו אות ניאון DsRed2-מיטו איסוף תמונות כל 5 דקות למשך פרק כולל של 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מראש חמם בינוני הדמיה לחיות עם ריכוז של FCCP פעמים גבוה יותר ריכוז העבודה הסופי (0.1 - 10 מיקרומטר, סוג תלוי תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריע לתהליך הרכישה ולהוסיף בעדינות 1 מ&quot;ל של מדיום הדמיה לחיות מחומם מראש עם FCCP לתוך צלחת בתוך החדר מיקרוסקופ של באמצעות pipet P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מחדש את תהליך הרכישה כפי שתואר לעיל, לתקופה כוללת של 3 שעות, באמצעות העמדה המוקלטת. שמור את כל התמונות רכשו על מנת לנתח אותם וליצור וידאו של תהליך mitophagic כאשר הרכישה היא מעל. </li></ol> .3 ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התמונות שנרכשו בפורמט &quot;.tiff&quot; במחשב אישי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונות עם גרפיקה רכהכלי ולהגדיר את המרווח הזמני להתרחש החל-שלילת קוטביות מושרה המיטוכונדריה עם FCCP אל התמונה הראשונה מראה את הגיוס של פרקין לתוך קרום המיטוכונדריה (תמונות נרכשות כל 5 דקות). חזור על ניתוח זה עבור כל תא בקבוצת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל התא הראשון של הטור על גיליון אלקטרוני עם שם קבוצת הניסוי. עבור כל קבוצת ניסוי, למדוד את המרווחים הזמניים לגיוס פרקין של מינימום של 10 תאים. תן הממוצע של מרווחי הזמני מחושב לגיוס פרקין ולהגדיר את סטיית התקן עבור כל קבוצת הניסוי (ממוצע ± סטיית תקן, N = 10). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארגן לעמודות מרווחי הזמני המחושבת היחידה. כל עמודה מכילה את n = 10 מדידות של קבוצת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את פונקציית &quot;הממוצע&quot; מהתפריט פורמולה בונה. בחר את הנתונים בעמודה. בחר את פונקציית &quot;סטיית תקן&quot; מהתפריט פורמולה בונה. Sele גודלct הנתונים בעמודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות גישה סטטיסטית, להשוות את קבוצות ניסוי היישום הנתון המתאימים על מנת להגדיר הבדל משמעותי בדינמיקה של mitophagy בין קבוצות ניסוי. (למשל, שתי קבוצות = של סטודנטים מבחן t, שלוש או יותר קבוצות = ANOVA בתוספת מבחן פוסט הוק) </li></ol>

<ol><li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 9-14 (2011).</li>
<li>Zhi, X., Zhong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Prime+Rep%22%5BJournal%5D)">Autophagy in cancer.</a> F1000Prime Rep. 7, 18(2015).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biol Chem. 393, 547-564 (2012).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+mitochondrial+autophagy%2C+or+mitophagy%2C+as+a+targeted+defense+against+oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Res%22%5BJournal%5D)">Selective mitochondrial autophagy, or mitophagy, as a targeted defense against oxidative stress, mitochondrial dysfunction, and aging.</a> Rejuvenation Res. 8, 3-5 (2005).</li>
<li>Kissova, I., Deffieu, M., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uth1p+is+involved+in+the+autophagic+degradation+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Uth1p is involved in the autophagic degradation of mitochondria.</a> J Biol Chem. 279, 39068-39074 (2004).</li>
<li>Kubli, D. A., Gustafsson, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitophagy%3A+the+yin+and+yang+of+cell+death+control%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitophagy: the yin and yang of cell death control.</a> Circ Res. 111, 1208-1221 (2012).</li>
<li>Redmann, M., Dodson, M., Boyer-Guittaut, M., Darley-Usmar, V., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+mechanisms+and+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitophagy mechanisms and role in human diseases.</a> Int J Biochem Cell Biol. 53, 127-133 (2014).</li>
<li>Di Sante, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+sirt1+promotes+prostatic+intraepithelial+neoplasia%2C+reduces+mitophagy%2C+and+delays+park2+translocation+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Loss of sirt1 promotes prostatic intraepithelial neoplasia, reduces mitophagy, and delays park2 translocation to mitochondria.</a> Am J Pathol. 185, 266-279 (2015).</li>
<li>Tanaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin-mediated+selective+mitochondrial+autophagy%2C+mitophagy%3A+Parkin+purges+damaged+organelles+from+the+vital+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Parkin-mediated selective mitochondrial autophagy, mitophagy: Parkin purges damaged organelles from the vital mitochondrial network.</a> FEBS Lett. 584, 1386-1392 (2010).</li>
<li>Shiba-Fukushima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-mediated+phosphorylation+of+the+Parkin+ubiquitin-like+domain+primes+mitochondrial+translocation+of+Parkin+and+regulates+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">PINK1-mediated phosphorylation of the Parkin ubiquitin-like domain primes mitochondrial translocation of Parkin and regulates mitophagy.</a> Sci Rep. 2, 1002(2012).</li>
<li>Trinh, J., Farrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+genetics+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advances in the genetics of Parkinson disease.</a> Nat Rev Neurol. 9, 445-454 (2013).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochem J. 417, 1-13 (2009).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochem Biophys Res Commun. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Karan, G., Yang, Z., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+wild+type+and+mutant+ELOVL4+in+cell+culture%3A+subcellular+localization+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of wild type and mutant ELOVL4 in cell culture: subcellular localization and cell viability.</a> Mol Vis. 10, 248-253 (2004).</li>
<li>Jin, S. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1-+and+Parkin-mediated+mitophagy+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">PINK1- and Parkin-mediated mitophagy at a glance.</a> J Cell Sci. 125, 795-799 (2012).</li>
<li>Kerr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+macropinosome+maturation+by+the+recruitment+of+sorting+nexins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Visualisation of macropinosome maturation by the recruitment of sorting nexins.</a> J Cell Sci. 119, 3967-3980 (2006).</li>
<li>Edin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+gel+culture+and+time-lapse+video+microscopy+of+the+human+vestibular+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">3-D gel culture and time-lapse video microscopy of the human vestibular nerve.</a> Acta Otolaryngol. 134, 1211-1218 (2014).</li>
<li>Ramsden, A. E., Mota, L. J., Munter, S., Shorte, S. L., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SPI-2+type+III+secretion+system+restricts+motility+of+Salmonella-containing+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The SPI-2 type III secretion system restricts motility of Salmonella-containing vacuoles.</a> Cell Microbiol. 9, 2517-2529 (2007).</li>
<li>Meseguer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+incubation+and+selection+in+a+time-lapse+monitoring+system+improves+pregnancy+outcome+compared+with+a+standard+incubator%3A+a+retrospective+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study.</a> Fertil Steril. 98, 1481-1489 (2012).</li>
<li>Campbell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+a+risk+classification+of+aneuploidy+in+human+embryos+using+non-invasive+morphokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics.</a> Reprod Biomed Online. 26, 477-485 (2013).</li>
<li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510, 370-375 (2014).</li>
<li>Carroll, R. G., Hollville, E., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+sensitizes+toward+apoptosis+induced+by+mitochondrial+depolarization+through+promoting+degradation+of+Mcl-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Parkin sensitizes toward apoptosis induced by mitochondrial depolarization through promoting degradation of Mcl-1.</a> Cell Rep. 9, 1538-1553 (2014).</li>
<li>Batlevi, Y., La Spada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+autophagy+in+neural+function%2C+neurodegenerative+disease%2C+neuron+cell+death%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial autophagy in neural function, neurodegenerative disease, neuron cell death, and aging.</a> Neurobiol Dis. 43, 46-51 (2011).</li>
<li>Frank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+is+triggered+by+mild+oxidative+stress+in+a+mitochondrial+fission+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitophagy is triggered by mild oxidative stress in a mitochondrial fission dependent manner.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 2297-2310 (2012).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Sugar, I. P., Neumann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+model+for+electric+field-induced+membrane+pores.+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Chem%22%5BJournal%5D)">Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation.</a> Biophys Chem. 19, 211-225 (1984).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variants+of+mitochondrial+autophagy%3A+Types+1+and+2+mitophagy+and+micromitophagy+%28Type+3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Variants of mitochondrial autophagy: Types 1 and 2 mitophagy and micromitophagy (Type 3).</a> Redox Biol. 2, 749-754 (2014).</li>
<li>Aggarwal, B. B., Quintanilha, A. T., Cammack, R., Packer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+to+mitochondrial+electron+transport+and+energy+coupling+by+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light.</a> Biochim Biophys Acta. 502, 367-382 (1978).</li>
<li>Alexandratou, E., Yova, D., Handris, P., Kletsas, D., Loukas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblast+alterations+induced+by+low+power+laser+irradiation+at+the+single+cell+level+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Human fibroblast alterations induced by low power laser irradiation at the single cell level using confocal microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 1, 547-552 (2002).</li>
<li>Kim, I., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+selectively+degrades+individual+damaged+mitochondria+after+photoirradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitophagy selectively degrades individual damaged mitochondria after photoirradiation.</a> Antioxid Redox Signal. 14, 1919-1928 (2011).</li>
<li>Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+processes+by+long-term+live+imaging--historic+problems+and+current+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions.</a> J Cell Sci. 126, 3805-3815 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

זמן לשגות מיקרוסקופי יכול להיות מוגדר כ הטכניקה המשתרע הדמית תא חי מתוך התבוננות יחידה בזמן כדי התצפית של דינמיקה הסלולר על פני תקופות זמן ארוכות. מתודולוגיה זו להבדיל confocal פשוטה או במיקרוסקופ תא החי משום שהוא מאפשר לצופה לזהות בזמן אמת חלבון יחיד ניאון מתויג אחרי הדינמי שלה בתוך תא חי בודד. למעשה, מיקרוסקופיה confocal יכולה בקלות מזהה חלבונים שכותרתו חיסוניים באמצעות נוגדן פלורסנט, אך היא אינה מאפשרת התבוננות התא והאירוע המולקולרי החייה בסביבה שלה. <p class="jove_content"...

אוטופגיה מאקרו היא תהליך תוך-תאי הכרוך בפירוק קטבולי של רכיבים תאיים פגומים ולא מתפקדים, כגון אברונים וחלבונים לצורך מיחזור או ייצור אנרגיה. כדי ליזום תהליך מטבולי זה, התא בולע את מרכיבי התא הפגועים למבנה ממברנה כפולה, המכונה אוטופאגוזום, המתמזג עם ליזוזום ותכולתו מתפרקת וממוחזרת 1,2. ישנם שני סוגים עיקריים של אוטופגיה, לא סלקטיבי וסלקטיבי. תהליך האוטופגיה הלא סלקטיבי מתרחש כאשר התא נמצא בתנאי מחסור בחומרים מזינים וצריך לחפש חומרים מזינים חיוניים ואנרגיה. עם זאת, אוטופגיה סלקטיבית מתרחשת כדי לתווך את ההסרה של אברונים לא מתפקדים/פגומים וחלבונים שאחרת עלולים להיות רעילים. אחד מתהליכי האוטופגיה הסלקטיביים הנחקרים ביותר הוא הסרת מיטוכונדריה, המכונה מיטופגיה 1,3-5.
מיטוכונדריה הם האברונים המרכזיים לחילוף החומרים של התאים והמקור העיקרי לאדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני דרך שרשרת הובלת האלקטרונים, חמצון חומצות שומן ומחזור חומצה טריקרבוקסילית (TCA). יתר על כן, המיטוכונדריה מווסתת את ייצור מיני החמצן התגובתי (ROS) ומשחררת חלבונים המשתתפים במסלולי מוות תאי 6-8.
PTEN המושרה על ידי קינאז 1 (PINK1) ופרקין RBR E3 יוביקוויטין ליגאז (פרקין) הם חלבוני המפתח המעורבים בתהליך המיטופגיה. פרקין יכול להגן מפני מוות תאים על ידי שמירה על בריאות התאים באמצעות בקרת איכות מיטוכונדריאלית9. עם אובדן פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית, פרקין ציטוזולי מגויס למיטוכונדריה על ידי PINK1. גיוס זה מעורר את האירועים הרציפים של מיטופגיה 10. יש מגוון רחב של ראיות לכך שמיטופאגיה היא תהליך בקרת איכות מיטוכונדריה בסיסי וחריגות בתהליך זה מניעות את המחלה 7. לדוגמה, מחלת פרקינסון אוטוזומלית רצסיבית נקשרה למוטציות בגנים המקודדים לפרקין ו-PINK1 (PARK2 ו-PINK1, בהתאמה) 11. בקרת האיכות של בריאות המיטוכונדריה חיונית להסרת מיטוכונדריה התורמים להצטברות ROS12. נוכחות מוגזמת של ROS תוך-תאי עלולה להוביל לנזק הן ל-DNA הגרעיני והן ל-DNA המיטוכונדריאלי (DNA ו-mt DNA, בהתאמה).
כאן, אנו מראים גישת מיקרוסקופ וידאו בהילוך מהיר כדי לעקוב אחר הצטברות פרקין לאחר השראת מיטופגיה בתיווך פרקין בפיברובלסטים עובריים של עכברים אימורטליים באמצעות מתן מבחנה של קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)-פנילהידרזון (FCCP), חומר ניתוק. FCCP משבש את סינתזת ה-ATP על ידי קצר חשמלי של פרוטונים על פני קרום המיטוכונדריה החיצוני ומכאן ניתוק זרחון חמצוני משרשרת הובלת האלקטרונים 13. הפעלת הדפולריזציה של הממברנה המיטוכונדריאלית מובילה לשיבוש המיטוכונדריה ולהסרה סלקטיבית התלויה בפרקין. לכן, טרנספיקציה של התאים המעניינים עם וקטור ביטוי המקודד פרקין התמזג עם סמן פלואורסצנטי (חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר, EYFP) יכולה לשמש כתג פלואורסצנטי כדי לעקוב אחר גיוס פרקין במהלך התהליך המיטופגי. על מנת לדמיין את המיטוכונדריה, ביצענו במשותף pDsRed2-Mito, המקודד חלבון פלואורסצנטי אדום (DsRed2) המכיל רצף מיקוד מיטוכונדריאלי של תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז (Mito). pDsRed2-Mito מיועד לתיוג פלורסנט של מיטוכונדריה14. ניתן למדוד את הזמן הנדרש לטרנסלוקציה של פרקין לקרום המיטוכונדריה, והוא נותן מדד עקיף לבריאות התאים. לדוגמה, אנו יכולים לומר שאם קו תאים שנפגע עבור גן מסוים מעניין מראה גיוס מהיר או איטי יותר של פרקין לאחר השראת מיטופגיה על ידי FCCP, תוצר הגן הזה יהיה שחקן מפתח על מנת לשמור על קצב חילוף החומרים של התא במצב הפיזיולוגי ולמנוע התפתחות של מחלות. לכן, מיקרוסקופ הווידיאו Time-lapse מספק כלי רב עוצמה ליישומי מחקר בסיסיים וקליניים כאחד במעקב אחר הדינמיקה של חלבונים מסומנים במהלך התהליכים המולקולריים שלהם והבנת האופן שבו תהליכים אלה מושפעים במהלך מצב פתולוגי.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning Life Science</td><td>10-013-CV</td><td>טרום חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>DMEM ללא פנול</td><td>Corning Life Science</td><td>17-205-CV</td><td>טרם חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td>טרם חימום ב-37 & #176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td>יש לחמם מראש ב-37 &#176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Corning Life Science</td><td>30-002-CI</td><td>טרום חימום ב-37 &#176; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>וקטור ביטוי EYFP-PARKIN</td><td>Addgene</td><td>23955</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed2-Mito וקטור ביטוי</td><td>Clontech</td><td>632421</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2B מכשיר</td><td>LONZA</td><td>AAD-1001S</td><td></td></tr><tr><td>נוקלאופקטור לערכה R NIH/3T3</td><td>LONZA</td><td>VCA-1001</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS AXIOVERT 200M מיקרוסקופ הפוך</td><td>CARL ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרבוניל ציאניד 4-(טריפלואורומטוקסי)-פנילהידרזון (FCCP)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>בונה</td><td></td>ניסויים</tr><tr><td>ImageJ</td><td>בונה</td><td></td> ניסויים <td>של המכון הלאומי לבריאות</td></tr></tbody></table>

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת eyfp-פרקין aggregation כסמן לסלולאריות mitophagy

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

ניתן להגדיר מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת של תאים חיים. טכניקה זו מסתמכת על איסוף תמונות בנקודות זמן שונות. ניתן להגדיר מרווחי זמן באמצעות ממשק מחשב השולט במצלמה המשולבת במיקרוסקופ. סוג זה של מיקרוסקופיה דורש הן את היכולת לרכוש אירועים מהירים מאוד והן את האות שנוצר על ידי המבנה התאי הנצפה במהלך אירועים אלה. לאחר איסוף התמונות, מורכב סרט של הניסוי כולו כדי להראות את הדינמיקה של האירועים המולקולריים המעניינים. למיקרוסקופ וידאו Time-lapse יש מגוון רחב של יישומים בתחום המחקר הביו-רפואי ומהווה כלי רב עוצמה וייחודי למעקב אחר הדינמיקה של האירועים התאיים בזמן אמת. באמצעות טכניקה זו, אנו יכולים להעריך אירועים תאיים כגון נדידה, חלוקה, העברת אותות, גדילה ומוות. יתר על כן, באמצעות בדיקות מולקולריות פלואורסצנטיות אנו מסוגלים לסמן מולקולות ספציפיות, כגון DNA, RNA או חלבונים ולעקוב אחריהן במסלולים ובתפקודים המולקולריים שלהן. למיקרוסקופ וידאו Time-lapse יתרונות מרובים, העיקרי שבהם הוא היכולת לאסוף נתונים ברמת התא הבודד, מה שהופך אותו לטכנולוגיה ייחודית לחקירה בתחום הביולוגיה של התא. עם זאת, למיקרוסקופ וידאו זמן-lapse יש מגבלות שעלולות להפריע לרכישת תמונות באיכות גבוהה. תמונות יכולות להיפגע על ידי שני גורמים חיצוניים; תנודות טמפרטורה, רעידות, לחות וגורמים פנימיים; pH, תנועתיות תאים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לרכישה דינמית של חלבון ספציפי, פרקין, המשולב עם החלבון הפלואורסצנטי הצהוב המשופר (EYFP) על מנת לעקוב אחר הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה, באמצעות גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse.

<html> בזאת, אנו מראים כיצד מיקרוסקופיה וידאו זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה, שניתן להשתמש בהם כדי לעקוב אחרי האירועים המולקולריים של חלבונים fluorescently-tagged בתא בודד. תוצאות הנציג גם להראות כיצד טכניקה זו מאפשרת לרכישת תמונות באיכות גבוהה. כאשר תמונות של תהליך מולקולארי, מתקבלים, יש לנו הזדמנות לנתח אותם בדרכים שונות. כאן, אנו מנתחים את מרווח הזמן בין תחילת תהליך mitophagy המושרה, המהווה את תהליך מולקולארי חיוני לשמור על הומאוסטזיס הסלולר סלקט...

כאן, אנו מתארים בפירוט גישת מיקרוסקופ וידאו זמן-lapse למדידת הגיוס הזמני של EYFP-Parkin במהלך הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה. תהליך דינמי זה של הסרה תלויה ב-EYFP-Parkin של מיטוכונדריה פגומה יכול לשמש כאינדיקטור לבריאות התא בתנאי ניסוי שונים.

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

המטרה הכללית של מיקרוסקופיית וידאו בשיטת Time-Lapse זו היא לעקוב אחר הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה המתווכת על ידי Parkin במהלך תהליך המיטופגיה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המטבוליזם המולקולרי, כגון כיצד המיטופגיה משפיעה על מצבים פתולוגיים מתמשכים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי חזק מאוד למעקב אחר הדינמיקה של חלבונים מסומנים במהלך תהליכים מולקולריים.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחזור החיים של המיטוכונדריה. ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון תרביות תאים ראשוניות, מחקרי אמבריולוגיה וחיזוי עדיפות. פיברובלסטים עובריים של עכבר מומיטליים ששימשו במחקר זה גודלו במצע DMEM מלא בצלחת תרבית רקמות של 10 ס"מ בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% פחמן דו-חמצני.כאשר התאים מגיעים ל-80% התמזגות (confluency), יש להסיר את המצע באמצעות שאיבה סטרילית ולהוסיף ten milliliters של PBS סטרילי. יש להסיר את ה-PBS ולהוסיף one milliliter של 0.25% Trypsin EDTA. יש לדגור את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך שתיים עד שלוש דקות, עד שהתאים ניתקים.הוסיפו 4 mL של מצע DMEM מלא, ושחזרו את התרחיף התאי. העבירו 10 µL מתרחיף התאים לצורך ספירה באמצעות המוציטומטר. זרעו 1×10⁶ תאים בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 cm, והדגירו למשך 24 שעות.ביום למחרת, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ונתקו את התאים באמצעות טריפסינציה, כפי שהודגם קודם לכן. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע DMEM מלא, השעיקו את התאים והעבירו את תרחיף התאים לפקעת של 15 מיליליטר. סובבו את התאים ב-250 gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) במיליליטר אחד של PBS סטרילי. סובבו את התאים שוב בצנטריפוגה. שפכו את הנוזל העליון לאחר הסבב השני.הוסיפו 100 µL מתערובת התמיסות לאלקטרופורציה למשקע התאים וערבבו בעדינות את המשקע מחדש באמצעות פיפטור. לאחר מכן, הוסיפו לת сусפנזיית התאים 2 µg של פלסמיד ביטוי EYFP Parkin ו-1 µg של פלסמיד ביטוי DsRed2 Mito. השתמשו בפיפטת פסטור חד-פעמית כדי להעביר את התמיסה לקובטה סטרילית.בצעו אלקטרופורציה לתאים באמצעות תוכנית הגדרה מראש. מיד לאחר האלקטרופורציה, הוסיפו לתאים 500 µL של מצע DMEM מלא, טרי ומחומם מראש, וזרעו את התאים בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ המיועדת לדימות חי (live-imaging).דגרו את התאים באטמוספירה לחית המכילה 5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. לפני תחילת הליך זה, הגדירו את טמפרטורת תא המיקרוסקופ ל-37 °C. לאחר מכן, הכינו מצע ספציפי לדימוי חי על ידי ערבוב של הרכיבים הבאים: DMEM נטול פנול בתוספת 10% FBS, 2 mM/L של L-Glutamine, 100 U/mL פניצילין ו-100 mg/mL סטרפטומייצין.חממו מראש את המצע בטמפרטורה של 37 °C באמבט מים. הסירו את המצע של התאים שעברו אלקטרופורציה באמצעות שאיבה סטרילית והוסיפו 1 mL של מצע לדימוי חי שחומם מראש. דגרו את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.לאחר אישור של טמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס בתא המיקרוסקופ, הזרים 5% פחמן דו-חמצני (CO2) אל התא. באופן 조יר, וללא תנועות משמעותיות או רעידות, הנח את הפלטה עם התאים שעברו אלקטרופורציה לתוך תא המיקרוסקופ.באמצעות ממשק התוכנה, הגדירו את המיקרוסקופ לזיהוי אותות פלואורסצנציה מהחלבונים המאוחדים המקודדים על ידי וקטורי הביטוי EYFP Parkin ו-DsRed2 Mito. פתחו את תוכנת מיקרוסקופיית הווידאו בשיטת time lapse. בתפריט העליון, בחרו ב-FITC עבור EYFP Parkin וב-Rhodamine עבור DsRed2 Mito.בחרו הגדלה של 20X. באמצעות ממשק התוכנה, חפשו תא בודד המבטא את שני הווקטורים שעברו טרנספקציה משותפת ורשמו את המיקום. בצעו זאת עבור לפחות 10 תאים בכל תנאי ניסויי.בחרו בתפריט Apps ולחצו על Multi Dimensional Acquisition. בחלון ה-Multi Dimensional Acquisition, בחרו את הפרמטרים הדרושים, כגון מספר הרכישות, מרווח הזמן בין כל רכישה ומיקום התא המוקלט. לחצו על Acquire כדי להתחיל את הרכישה הבסיסית של שני האותים הפלואורסצנטיים.אספו תמונות בכל חמש דקות למשך פרק זמן כולל של ארבע עשרה דקות. בזמן רכישת התמונות, הכינו תּוּך דגימה לדימיוג חי מחומם מראש המכיל Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone, או FCCP, בריכוז כפול מריכוז העבודה הסופי. הפסיקו את תהליך הרכישה, והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של תוך הדגימה לדימיוג חי המחומם מראש עם FCCP אל הצלחת בתוך תא המיקרוסקופ.לאחר הוספת FCCP, חשוב לבצע מיקוד מחדש של המיקרוסקופ לפני הפעלת רכישת התמונות מחדש. הפעל מחדש את תהליך הרכישה כפי שתואר בעבר, ואסוף תמונות למשך תקופה כוללת של שלוש שעות תוך שימוש במיקום שנשמר. עם השלמת רכישת התמונות, שמור את כל התמונות שנרכשו לצורך ניתוח מאוחר יותר.מוצגות כאן תמונות מסדרת צילומי זמן של אותות פלואורסצנטיים של EYFP-Parkin ו-DsRED2-Mito בפיברובלסטים לפני מתן FCCP. המלבנים הלבנים מייצגים את האזורים המוגדלים בפנלים המתאימים מצד ימין. במהלך נקודות הזמן הבסיסיות, EYFP-Parkin, המדומיין בירוק, מפוזר באופן הומוגני בכל התא.רשת המיטוכונדריה, המופיעה בצבע אדום, נראית כמקושרת היטב, כפי שמסומן על ידי החצים הלבנים. לאחר מתן FCCP, נצפית פרגמנטציה של המיטוכונדריה כתוצאה דה-פולריזציה של הממברנה בחלוף חמש דקות. עם זאת, EYFP-Parkin עדיין מפוזר באופן הומוגני ברחבי הציטופלזמה.ב-55 דקות לאחר מתן FCCP, חלבון EYFP-Parkin מגויס לממברנות המיטוכונדריה הפגומות כדי להפעיל את תהליך המיטופגיה. תנועת ה-EYFP-Parkin לממברנה המיטוכונדרית בעקבות מתן FCCP מוצגת בסרטון time lapse מייצג זה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטופגיה לבחון מיחזור מיטוכונדריאלי. היא מאפשרת לחקור את תהליך המיטופגיה כמנגנון לבקרת איכות מיטוכונדריאלית בתאים.

time-lapse-video-microscopy-for-assessment-eyfp-parkin-aggregation-as

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היתוך מיטוכונדריאלי נמדד על ידי מעקב אחר איזון של ה-GFP מטריקס במיקוד photoconverted ברשת המיטוכונדריה לאורך זמן. עד כה, רק תא אחד יכול להיות חשוף ניתוח שעה ארוכה קינטית בכל פעם. אנו מציגים שיטה מודד בו זמנית מספר תאים, ובכך להאיץ את תהליך איסוף הנתונים.

מהר יותר, ברזולוציה גבוהה, mtpa-GFP מבוססי Fusion Assay מיטוכונדריאלי רכישת נתונים הקינטית של מספר תאים במקביל באמצעות מיקרוסקופ Confocal

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח כמותי של היווצרות חלבון mitophagy במיוחד בתאי ביתא מדגימות איון האנושי העיקרי. טכניקה זו ובכך מאפשרת ניתוח של mitophagy מתוך חומר ביולוגי מוגבל, אשר חיוניים בדגימות יקרות של תא הלבלב האנושי.

ויזואליזציה של מתחמי מיטוגניים אנדוגני באתרו בתאי בטא הלבלב האנושי ניצול שיטת סמיכות הקירבה

מיטופגיה היא המנגנון העיקרי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית. עם זאת, ההערכה של mitophagy in vivo הוא הפריע על ידי היעדר בדיקות כמותיות אמין. מוצג כאן פרוטוקול לתצפית על מיטופגיה בתאים חיים באמצעות צבע מיטוכונדריה ירוק-פלואורסצנטי המיועד לתאים וצבע ליזוזום אדום-פלואורסצנטי.

הדמיה של מיטופגיה עם צבעים פלואורסצנטיים למיטוכונדריה וליזוזום

בהתבסס על ניסויים במבחנה , מחקר זה חשף את המנגנון של קרוצטין בתיקון נזקי עקה חמצונית של קרדיומיוציטים על ידי השפעה על מיטופגיה, שבה מסלול האיתות PINK1/Parkin ממלא תפקיד חשוב.

הגנה על תאי שריר הלב H9c2 מפני עקה חמצונית על ידי קרוצטין באמצעות מיטופגיה בתיווך מסלול PINK1/Parkin

טכניקה זו מתארת זרימת עבודה יעילה כדי להמחיש ולמדוד כמותית את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ואת רמות הסופראוקסיד בתוך תאי HeLa באמצעות הדמיה חיה מבוססת פלואורסצנטיות.

כימות מבוסס פלואורסצנטיות של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ורמות הסופראוקסיד באמצעות הדמיה חיה בתאי HeLa

מחקר זה מציג שיטה לניתוח המורפולוגיה של המיטוכונדריה בהתבסס על אימונוסטיין וניתוח תמונה ברקמת מוח עכבר באתרה. הוא גם מתאר כיצד זה מאפשר לזהות שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית הנגרמים על ידי צבירת חלבונים במודלים של מחלת פרקינסון.

בדיקה היסטולוגית של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במודל מחלת פרקינסון

חקור את דינמיקת EYFP-Parkin במיטופאגיה תוך שימוש במיקרוסקופיית וידאו טווח-זמן בתאי פיברובלסט עובריים ממושבתים של עכבר. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר סילוק מיטוכונדריות פגומות ומספקת כלי עוצמתי לחקר בריאות תאית ומחלות מיטוכונדריות.

זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

גלה סרטונים נוספים