זמן לשגות מיקרוסקופית וידאו עבור הערכת EYFP-פרקין Aggregation כסמן לסלולאריות Mitophagy

המטרה הכללית של מיקרוסקופיית וידאו בשיטת Time-Lapse זו היא לעקוב אחר הסרה סלקטיבית של מיטוכונדריה פגומה המתווכת על ידי Parkin במהלך תהליך המיטופגיה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המטבוליזם המולקולרי, כגון כיצד המיטופגיה משפיעה על מצבים פתולוגיים מתמשכים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי חזק מאוד למעקב אחר הדינמיקה של חלבונים מסומנים במהלך תהליכים מולקולריים.

שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מחזור החיים של המיטוכונדריה. ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון תרביות תאים ראשוניות, מחקרי אמבריולוגיה וחיזוי עדיפות. פיברובלסטים עובריים של עכבר מומיטליים ששימשו במחקר זה גודלו במצע DMEM מלא בצלחת תרבית רקמות של 10 ס"מ בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% פחמן דו-חמצני.

כאשר התאים מגיעים ל-80% התמזגות (confluency), יש להסיר את המצע באמצעות שאיבה סטרילית ולהוסיף ten milliliters של PBS סטרילי. יש להסיר את ה-PBS ולהוסיף one milliliter של 0.25% Trypsin EDTA. יש לדגור את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך שתיים עד שלוש דקות, עד שהתאים ניתקים.

הוסיפו 4 mL של מצע DMEM מלא, ושחזרו את התרחיף התאי. העבירו 10 µL מתרחיף התאים לצורך ספירה באמצעות המוציטומטר. זרעו 1×10⁶ תאים בצלחת תרבית רקמה בקוטר 10 cm, והדגירו למשך 24 שעות.

ביום למחרת, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS ונתקו את התאים באמצעות טריפסינציה, כפי שהודגם קודם לכן. הוסיפו ארבעה מיליליטרים של מצע DMEM מלא, השעיקו את התאים והעבירו את תרחיף התאים לפקעת של 15 מיליליטר. סובבו את התאים ב-250 gs ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע (pellet) במיליליטר אחד של PBS סטרילי. סובבו את התאים שוב בצנטריפוגה. שפכו את הנוזל העליון לאחר הסבב השני.

הוסיפו 100 µL מתערובת התמיסות לאלקטרופורציה למשקע התאים וערבבו בעדינות את המשקע מחדש באמצעות פיפטור. לאחר מכן, הוסיפו לת сусפנזיית התאים 2 µg של פלסמיד ביטוי EYFP Parkin ו-1 µg של פלסמיד ביטוי DsRed2 Mito. השתמשו בפיפטת פסטור חד-פעמית כדי להעביר את התמיסה לקובטה סטרילית.

בצעו אלקטרופורציה לתאים באמצעות תוכנית הגדרה מראש. מיד לאחר האלקטרופורציה, הוסיפו לתאים 500 µL של מצע DMEM מלא, טרי ומחומם מראש, וזרעו את התאים בצלחת תרבית רקמה של 6 ס"מ המיועדת לדימות חי (live-imaging).

דגרו את התאים באטמוספירה לחית המכילה 5% פחמן דו-חמצני בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. לפני תחילת הליך זה, הגדירו את טמפרטורת תא המיקרוסקופ ל-37 °C. לאחר מכן, הכינו מצע ספציפי לדימוי חי על ידי ערבוב של הרכיבים הבאים: DMEM נטול פנול בתוספת 10% FBS, 2 mM/L של L-Glutamine, 100 U/mL פניצילין ו-100 mg/mL סטרפטומייצין.

חממו מראש את המצע בטמפרטורה של 37 °C באמבט מים. הסירו את המצע של התאים שעברו אלקטרופורציה באמצעות שאיבה סטרילית והוסיפו 1 mL של מצע לדימוי חי שחומם מראש. דגרו את הצלחת למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר אישור של טמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס בתא המיקרוסקופ, הזרים 5% פחמן דו-חמצני (CO2) אל התא. באופן 조יר, וללא תנועות משמעותיות או רעידות, הנח את הפלטה עם התאים שעברו אלקטרופורציה לתוך תא המיקרוסקופ.

באמצעות ממשק התוכנה, הגדירו את המיקרוסקופ לזיהוי אותות פלואורסצנציה מהחלבונים המאוחדים המקודדים על ידי וקטורי הביטוי EYFP Parkin ו-DsRed2 Mito. פתחו את תוכנת מיקרוסקופיית הווידאו בשיטת time lapse. בתפריט העליון, בחרו ב-FITC עבור EYFP Parkin וב-Rhodamine עבור DsRed2 Mito.

בחרו הגדלה של 20X. באמצעות ממשק התוכנה, חפשו תא בודד המבטא את שני הווקטורים שעברו טרנספקציה משותפת ורשמו את המיקום. בצעו זאת עבור לפחות 10 תאים בכל תנאי ניסויי.

בחרו בתפריט Apps ולחצו על Multi Dimensional Acquisition. בחלון ה-Multi Dimensional Acquisition, בחרו את הפרמטרים הדרושים, כגון מספר הרכישות, מרווח הזמן בין כל רכישה ומיקום התא המוקלט. לחצו על Acquire כדי להתחיל את הרכישה הבסיסית של שני האותים הפלואורסצנטיים.

אספו תמונות בכל חמש דקות למשך פרק זמן כולל של ארבע עשרה דקות. בזמן רכישת התמונות, הכינו תּוּך דגימה לדימיוג חי מחומם מראש המכיל Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone, או FCCP, בריכוז כפול מריכוז העבודה הסופי. הפסיקו את תהליך הרכישה, והוסיפו בעדינות מיליליטר אחד של תוך הדגימה לדימיוג חי המחומם מראש עם FCCP אל הצלחת בתוך תא המיקרוסקופ.

לאחר הוספת FCCP, חשוב לבצע מיקוד מחדש של המיקרוסקופ לפני הפעלת רכישת התמונות מחדש. הפעל מחדש את תהליך הרכישה כפי שתואר בעבר, ואסוף תמונות למשך תקופה כוללת של שלוש שעות תוך שימוש במיקום שנשמר. עם השלמת רכישת התמונות, שמור את כל התמונות שנרכשו לצורך ניתוח מאוחר יותר.

מוצגות כאן תמונות מסדרת צילומי זמן של אותות פלואורסצנטיים של EYFP-Parkin ו-DsRED2-Mito בפיברובלסטים לפני מתן FCCP. המלבנים הלבנים מייצגים את האזורים המוגדלים בפנלים המתאימים מצד ימין. במהלך נקודות הזמן הבסיסיות, EYFP-Parkin, המדומיין בירוק, מפוזר באופן הומוגני בכל התא.

רשת המיטוכונדריה, המופיעה בצבע אדום, נראית כמקושרת היטב, כפי שמסומן על ידי החצים הלבנים. לאחר מתן FCCP, נצפית פרגמנטציה של המיטוכונדריה כתוצאה דה-פולריזציה של הממברנה בחלוף חמש דקות. עם זאת, EYFP-Parkin עדיין מפוזר באופן הומוגני ברחבי הציטופלזמה.

ב-55 דקות לאחר מתן FCCP, חלבון EYFP-Parkin מגויס לממברנות המיטוכונדריה הפגומות כדי להפעיל את תהליך המיטופגיה. תנועת ה-EYFP-Parkin לממברנה המיטוכונדרית בעקבות מתן FCCP מוצגת בסרטון time lapse מייצג זה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעתיים, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האוטופגיה לבחון מיחזור מיטוכונדריאלי. היא מאפשרת לחקור את תהליך המיטופגיה כמנגנון לבקרת איכות מיטוכונדריאלית בתאים.