Name: ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו לנטר דינמיקה של חומצות מרה בתאים חיים באמצעות חיישן FRET מקודד גנטית. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר בתאים בודדים ללא צורך בסימון, ומספקת תובנות לגבי מטבוליזם ותהליכים תאיים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי התחלה של ERC (ERC-2011-StG 280255 ו-ERC-2013-StG 337479) ועל ידי הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות (Vidi 91713319).

<ol><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
<li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li>
<li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Stickiness%3A+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo%CC%88rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li>
<li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heteromeric+organic+solute+transporter+%CE%B1-%CE%B2%2C+Ost%CE%B1-Ost%CE%B2%2C+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li>
<li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li>
<li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170(2011).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בחיישן של חומצות מרה רומן מקודדים גנטי מסוגל ניטור דינמיקת spatiotemporal תחבורת חומצות מרה בתאים חיים. biosensor זה מורכב מחלבוני ניאון תכלת וסיטרין שהם התמזגו לFXR-LBD, וכך יוצרים חיישן מבוסס סריג חומצות מרה (BAS). חומצות מרה החיישן הוא יחסית פשוט ונוח בשימוש בעת צורך ניסיון בסיסי עם תרבות תא וFACS או במיקרוסקופ (confocal). עם זאת, כמה היבטים עשויים לדרוש קצת ירי צרות. בעת ש...

העברת פורסטר תהודת אנרגיה (סריג) היא בשימוש נרחב כדי להשיג הבנה טובה יותר של תפקודים תאיים בתאים חיים עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה 1. בסריג, אנרגיה מfluorophore תורם נרגש מועברת לfluorophore acceptor. סריג יעילות הוא תלוי מאוד על המרחק בין התורם fluorophore acceptor והאוריינטציה שלהם, ולכן קריאת נתונים רגישות של שינויי קונפורמציה המשפיעים על שני fluorophores. תופעה זו מנוצלת ליצירת חיישנים מבוססי סריג להדמיה של מולקולות קטנות. שינויים בריכוזם יכולים להיות במעקב עם עלייה / ירידה בשיעור של עוצמת פליטה של acceptor לעומת fluorophore התורם 2. לדוגמא, חיישני סידן מבוססי סריג מאפשרים זיהוי מהיר ויציב של ריכוזי סידן חופשיים בתאים חיים 3. יתרונות אחרים של חיישנים מבוססי סריג הם הדמיה בתאי חיים יחידים, לאיורש אינה הפולשנות, היכולת שלהם להיות ממוקד לסוגי תאים שונים ותאים סלולריים 4. היבטים של דינמיקה של חומצות מרה תאיים רבים עדיין הם הבינו היטב. לדוגמא, מעט מאוד ידוע על בסיס תקנת המנגנון של תחבורת חומצות מרה מצומדות וunconjugated. קיימים טכניקות כדי לפקח על תחבורה זה בעיקר לעשות שימוש בכתבים מבוסס לוציפראז, חומצות מרה רדיואקטיבי, או אנלוגים של חומצות מרה ניאון. האחרון דורש שינוי של חומצות מרה, אולי משפיע על תכונותיהם. יש עיתונאים המבוסס על לוציפראז רזולוציה זמן עני. חוץ מזה, בטכניקות אלה לגרום לאובדן של המדגם ואינם ישימים להדמיה בתאים בודדים. לכן, זה יהיה מועיל להשתמש בשיטות המאפשרות הדמיה תא בודדת חי של פעילות תחבורה באמצעות חיישני סריג, במיוחד משום שהיא כוללת את היתרון של זיהוי 5 ratiometric, 6. בעוד גרסאות של CFP / טופס YFP הנפוץ ביותר בשימוש זוגות סריג, אסטרטגיות חדשות באמצעות Morange וmCherry נושא מוטציות עמותה עצמית-התרמה הובילה להרחבת ארגז הכלים סריג עם חיישני רומן, כוללים חיישן חומצות מרה אדום העביר 7. יצרנו חיישן גנטי מקודד סריג מרה חומצה (BAS), שמורכב מfluorophore תורם (תכלת) וfluorophore acceptor (סיטרין) שהתמזגו עם תחום קולט X farnesoid (FXR) יגנד מחייב בעבר (FXR-LBD) ופפטיד המכיל מוטיב LXXLL 8. מקורבים זה פפטיד עם FXR-LBD באופן חומצה תלויה מרה. עם הפעלת FXR, המרחק בין סיטרין והתכלת ישנה עקב שינוי קונפורמציה. בשורות תאי יונקים, תוצאות FXR הפעלה בעלייה להבחין בבירור בסיטרין / היחס תכלת, בעוד החיישן המטוהר עובד בכיוון ההפוך וגורם ליחס סריג ירד על הפעלת FXR. חיישן זה (CytoBAS)מאפשר ניטור של דינמיקה של חומצות מרה cytosolic. על ידי תוספת carboxyl הטרמינל של מוטיבים מיקוד subcellular, מבנה BAS יכול להיות ממוקד לגרעין (NucleoBAS) וperoxisomes (PeroxiBAS), המאפשר מדידות של ריכוזי חומצות מרה בתאים סלולריים שונים. למרות התוספת של מוטיב מיקוד peroxisomal אינה פוגעת היענותה לחומצות מרה, FXR-ligands החדיר תאים לא לגרום לכל סריג שינויים של PeroxiBAS בתוך peroxisomes 8. כטבעו של פער זה אינו ידוע, הפרוטוקול להלן מתמקד בCytoBAS וNucleoBAS. השימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה הודגם לאחרונה בתאים המכילים את מובילי כבד חומצות מרה Na פוליפפטיד שיתוף הובלה / taurocholate + (NTCP) ואלפא טרנספורטר המומס אורגני / בטא (OSTαβ) 8. NTCP היא היבואנית של חומצת מרה בכבד הקרן וOSTαβ הוא מרה מעיים basolateralטרנספורטר חומצה שיכול לתפקד גם כיבואן ויצואן תלוי בשיפוע של החומצות מרה אלקטרוכימיים הריכוז 9, 10. נתונים אחרונים הראו כי על תחבורת חומצות מרה על ידי NTCP ו / או OSTαβ, ניתן לצפות תגובות חזקות ומהירה ביחס סריג כתוצאה מאינטראקצית יגנד-FXR-LBD. כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים לשיטות למדידת סריג כגון ניתוח confocal מיקרוסקופי ותא מופעל הקרינה מיון (FACS), לסמן את השלבים קריטיים, לטפל בבעיות פוטנציאליות ולדון שיטות חלופיות. שימוש בחיישן סריג מקודדים גנטי זה, אינטראקציה עם חומצות מרה FXR-LBD ניתן לכמת ופיקוח ישיר בתאים חיים ומספקת שיטה מהירה ופשוטה של ​​הדמיה תחבורת חומצות מרה ודינמיקה בזמן אמת. פלסמידים ביטוי יונקים קידוד CytoBAS וNucleoBAS זמינים מסחרי. לכן, biosensor זה יכול עוד לתרום להבנה של מובילי חומצות מרה או תרכובות המפעילות FXR ולספק הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של חומצות מרה ואיתות.

<table><tbody><tr><td>ציטובאס&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagles Media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>גלוקוז גבוה ללא L-גלוטמין</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (פי 10)</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25 בקבוק תרבית תאים</td><td>VWR בינלאומי</td><td>392-0253</td><td>למינין מצופה</td></tr><tr><td>T-175 בקבוק תרבית תאים</td><td>VWR בינלאומי</td><td>392-0238</td><td>למינין מצופה</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>VWR international</td><td>734-0229</td><td>פולי-L-ליזין ולמינין מצופה</td></tr><tr><td>10 ס"מ צלחת</td><td>VWR בינלאומית</td><td>392-0243</td><td>למינין מצופה</td></tr><tr><td>דיאתילאמינואתיל (DEAE) - דקסטרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילנימין (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (גנטיצין) 50 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, 50 מ"ג/מ"ל</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>גליל שיבוט (6 x 8 מ"מ)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Leibovitz תרבית בינונית</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>ללא פנול אדום</td></tr><tr><td>פוליסטירן צינור תחתון עגול (5 מ"ל) צינור Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>ללא מכסה, לא סטרילי</td></tr><tr><td>Falcon 2,063 שפופרות (5 מ"ל)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>מכסה הצמד, סטרילי</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek 8 באר כיסוי זכוכית</td><td>תרמו מדעי</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי מסוננת פחם FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>כימיקלים אחרים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>נ.ו.ט.</td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) הפך לכלי רב עוצמה לניטור קיפול חלבונים, אינטראקציה ולוקליזציה בתאים בודדים. חיישנים ביולוגיים המסתמכים על עקרון ה-FRET אפשרו הדמיה בזמן אמת של אירועי איתות תת-תאיים בתאים חיים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה. כאן, אנו מתארים את היישום של חיישן חומצת מרה מקודד גנטית (BAS) המורכב משני פלואורופורים המאוחים לתחום הקישור של ליגנד קולטן X פרנזואיד (FXR-LBD), ובכך יוצרים חיישן חומצת מרה שניתן להפעיל על ידי מספר רב של מיני חומצות מרה וליגנדים FXR (סינתטיים) אחרים. חיישן זה יכול להיות ממוקד לתאים תאיים שונים כולל הגרעין (NucleoBAS) והציטוזול (CytoBAS) כדי למדוד ריכוזי חומצות מרה באופן מקומי. הוא מאפשר כימות מהיר ופשוט של זרם חומצות מרה תאי, פליטה והפצה תת-תאית של חומצות מרה אנדוגניות ללא צורך בתיוג עם תגים פלואורסצנטיים או גרעיני רדיו. יתר על כן, חיישני BAS FRET יכולים להיות שימושיים עבור ניטור קשירת ליגנד FXR. לבסוף, אנו מראים שניתן לשלב את החיישן הביולוגי FRET הזה עם הדמיה של פלואורופורים אחרים מובחנים ספקטרלית. זה מאפשר ניתוח משולב של דינמיקת חומצות מרה תוך תאיות ו-i) לוקליזציה ו/או שפע של חלבונים מעניינים, או ii) איתות תוך תאי בתא בודד.

חיישן סריג-BAS מוצג מבוסס על יגנד המחייב תחום של FXR (LBD-FXR) מחובר לשני fluorophores סיטרין ותכלת) ומוטיב LXXLL. חיישן זה מאפשר חקירות תחבורת חומצות מרה בתאים חיים עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה (איור 1). מוטציות בתכלת וסיטרין יושמו כדי לקדם את הקמתו של מתחם intramolecular (איור 1 B). חומצות מרה וligands FXR האחר להיקשר לFXR ובכך לשנות את המרחק בין סיטרין ותכלת על ...

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקר דינמיקת חומצות המרה בתאים חיים באמצעות חיישן BAS FRET מקודד גנטית. חיישן חומצת מרה זה מייצג כלי ייחודי לחקר (ויסות של) הובלת חומצת מרה והפעלת FXR במגוון רחב של סוגי תאים.

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בחיישן חומצת מרה FRET מקודד גנטית כדי לדמיין בקלות הובלה ודינמיקה של חומצת מרה ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. חיישן זה יכול לענות על שאלות מטבוליות מרכזיות, כגון הקשר בין מרה ודינמיקה לגלוקוז, שומנים ומטבוליזם אנרגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שכעת ניתן לנטר ישירות את הובלת חומצות המרה לתאים חיים בודדים ללא צורך בסימון חומצות מרה.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הובלה ודינמיקה של תאים וחומצות מרה. זה יכול לשמש גם כדי להמחיש השפעות או הפעלה ותאים חיים בודדים, או לשלב הדמיה של לוקליזציה של חלבונים והובלת חומצות מרה. חיישן חומצת המרה המקודד גנטית, מעתה והלאה, החיישן, מורכב מפלואורופור סרוליאן תורם, ולמעט פלואורופור ציטרין.שני הפלואורופורים מקושרים על ידי תחום קשירת הליגנד של קולטן חומצת המרה הגרעינית FXR, המאוחה לקו-פקטור FXR, פפטיד. שני שינויים מהונדסים בחומצות אמינו בשני הפלואורופורים מקדמים אינטראקציות בין-מולקולריות בין הצרולאן לציטרין. נעשה שימוש בשני מבנים שונים הנושאים את החיישן.במבנה אחד, החיישן מכיל את אות הלוקליזציה הגרעינית c-terminal, ולכן מצטבר בגרעין. במבנה השני, החיישן חסר כל רצף מטרה, ולכן מתמקם בציטופלזמה. פרוטוקול הווידאו הבא מתמקד כיצד לדמות את החיישן בתאים חיים.פרוטוקול הטקסט מכסה כיצד להנדס תאים המבטאים את החיישן וכיצד לנתח אותם עוד יותר על ידי עובדות. כהכנה להדמיית התאים, צלחו את התאים המבטאים את החיישן בצפיפות הרצויה בשקופית תא תחתון סטרילית עם שמונה בארות במצע תרבית שלם. כאשר התאים גדלו ל-60 t0 70 אחוז מפגש המשך בניסוי.שטפו את התאים המודבקים לשקופית החדר פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של 1x PBS או מדיום תרבית Leibovitz L-15. לאחר מכן, שאפו את התמיסה והחליפו אותה ב-300 מיקרוליטר של מדיום תרבית לייבוביץ L-15 כך שלא יהיה צורך בבקרת CO2. אם נעשה שימוש ב-DMEM עם פנול אדום, במקום לייבוביץ L-15, תכנן לעקוב אחר ה-PH במהלך איסוף הנתונים, מכיוון שהחיישן רגיש ל-PH. לאחר מכן, הכינו דילולים של התרכובות שישמשו בניסוי בתרכיזים של פי 3 עד פי 5, כולל GW4064 ו-TCDCA.התכוננו להוסיף כמויות של 50 עד 100 מיקרוליטר במהלך ההדמיה, כך שהתמיסות יתערבבו במהירות בתא השקופיות. כעת, הפעל את תוכנת ההדמיה של מיקרוסקופ קונפוקלי, והפעל את הלייזר. המיקרוסקופ חייב להיות מצויד במטרת שמן פי 63, תא דגירה של 37 מעלות צלזיוס ולייזר סגול 405 ננומטר.לאחר מכן, התאם את הגדרות המיקרוסקופ. הגדר את מצב הרכישה ל-XYT להדמיית זמן-lapse של מישור מוקד יחיד. קבעו את קצב רכישת התמונה למרווחים של 20 שניות, כך שניתן יהיה להוסיף תרכובות במהלך ההפסקות.כמו כן, הקפד להגדיר טווח ספקטרלי לגילוי משימה. התמקדו בתאים באמצעות טרנסהאור. לאחר מכן, בפקד התוכנה, צייר עיגולים כדי להגדיר את אזורי העניין.בחר תאים בעלי עוצמות תפרחת דומות וגודל וצורה תקינים. אין למשוך קרוב להיקף התא. לאחר מכן, התחל לבצע מדידות.שימו לב לערכם, והמשיכו לבצע מדידות עד שהפריחה הסרולינית והסיטרין תתייצב. לאחר שהושגה יציבות התפרחת, הוסף 50 עד 100 מיקרוליטר של חומצות מרה או תרכובות אחרות בנקודות זמן נבחרות במהלך המדידה. הימנע מקצה החדר בעת פיפטינג, והוסף את הנוזל לאט.ביצוע נכון של שלב זה הוא קריטי לניסוי. שוב, תן לתפרחת להתייצב לפני שתמשיך. סיים את הניסוי על ידי הוספה זהירה של 100 מיקרוליטר של GW4064 לריכוז של 5 עד 10 מיקרומולר.ממשיכים להקליט עד שהפריחה מתייצבת שוב. לאחר מכן, שמור את הניסוי וייצא את הנתונים כקובץ avi. פתח את קבצי ה-avi השמורים בתמונה J על ידי בחירת תוספים, אוספים, מחסנית interleaver.לאחר מכן, לחץ על ערוך, בחירה והוסף למנהל כדי לפתוח את חלון מנהל RLI. לאחר מכן, החלף את האפשרות, הצג הכל. בעזרת כלי הבחירה הסגלגלה, צייר כמה החזר ROI המכסים תאים ספציפיים.אל תתקרבו להיקפי התאים מכיוון שסביר להניח שהתאים יעברו סחיפה או נדידה מוקדית כלשהי. כמו כן, צייר עיגול אחד באזור מחוץ לתאים כדי לקבוע את אות הרקע. ניתן להשתמש גם באזור בתוך תא שאינו מבטא את החיישן.כעת, בחר החזר ROI אחד, ולחץ על תוספים, ולאחר מכן על פרופיל יחס. שלושה מסכים יופיעו. פרופיל RAW, יחס ויחס.חלון ה-RAW מראה את העלייה בעוצמת הסיטרין כקו כחול, וירידה בסרוליאן כקו אדום, אם יש FRET. חלון היחס מציג מידע על יחס הסיטרין לסרוליאן, שיגדל עם עלייה ב-FRET. חלון פרופיל היחס מציג ערכים עבור מדידות עוצמת הפריחה בשני הערוצים.אם נעשה שימוש בקובצי הגדרה ספציפיים למיקרוסקופ, סדר הערוצים עשוי להיראות הפוך. כעת, העתק את הנתונים מחלון פרופיל היחס לגיליון אלקטרוני לניתוח סטטיסטי. לאחר מכן, המשך לעשות את אותו הדבר עבור כל שאר החזר ה-ROI שנבחר כמו גם את החזר ה-ROI ברקע.ניסוי FRET מבוסס עוצמה כמותית של תאים חיים בוצע על תאי U2OS המבטאים את החיישן, וחסרים מובילי חומצות מרה אנדוגניים. התאים טופלו ב-TCDCA. זה לא הביא לשינויים ב-FRET.כאשר התאים טופלו ב-GW4064, היחס הממוצע בין ציטרין לסרוליאן גדל בצורה מדהימה. כדי להדגים שניתן לשלב את החיישן עם חלבונים אחרים, תוכננו תאי U2OS המבטאים את החיישן יחד עם NTCP ו-OST אלפא-בטא. הם הראו עלייה ברורה ביחס סיטרין/סרוליאן עם הוספה ל-TCDCA ו-GW4064.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח דינמיקה של חומצת מרה באמצעות חיישן חומצת המרה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה. ניתן להרחיב הליך זה בקלות כך שיכלול מידע הדמיה נוסף, כגון לוקליזציה תת-תאית של החלבון המעניין שלך.כל עוד אורך הגל של חלבון זה שונה מהחיישן. כדי למנוע פוטוהלבנה, חשוב לשמור על החיישן המבטא תאים בחושך ככל האפשר.

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

מאמר זה ידגים כיצד לעקוב אחר דינמיקת גלוטמין בתאים חיים באמצעות סריג. חיישני מקודדים גנטי מאפשרים ניטור בזמן אמת של מולקולות ביולוגיות ברזולוציה subcellular. עיצוב ניסיוני, פרטים טכניים של ההגדרות הניסיוניות, ושיקולים לניתוחים שלאחר ניסוי יידונו לחיישני גלוטמין מקודד גנטי.

גלוטמין שטף הדמיה באמצעות חיישני מקודדים גנטיים

כלים לאבחן ספיגה של חומצות מרה למדוד תחבורה חומצות מרה in vivo מוגבלים. גישה חדשנית בבעלי חיים מתוארת אשר מנצלת פרוטון משולב (1 H) בתוספת פלואור (19 F) תהודה מגנטית; יש שיטה חדשנית זו פוטנציאל translational למסך ספיגה של חומצות מרה בפרקטיקה הקלינית.

שימוש רב-פלואור מרת חומצות<em&gt; In vivo</em&gt; דימות תהודה מגנטית כדי למדוד חומצות מרה התחבורה

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לניתוח אותות סידן בצמחים שנוצר על ידי האכלה חרקים hemipteran, כגון כנימות. תודרנית לבנה טרנספורמציה עם החיישן סידן GFP GCaMP3 מאפשרים בזמן אמת אין ויוו ההדמיה של סידן דינמיקה עם רזולוציה טמפורלית, מרחבית גבוהה.

בזמן אמת In Vivo הקלטה של תודרנית סידן אותות שהאכילה חרקים באמצעות ביוסנסור פלורסנט

ההפעלה של סר/ת'ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

פרוטוקול זה מציג תהליך סינון סטנדרטי עם תפוקה גבוהה עבור מיקרואורגניזמים תעשייתיים. הוא כולל בניית ספריית מוטנטים באמצעות מוטגנזה של ARTP, ביצוע סקר חיובי לטיפות באמצעות מיקרופלואידיקה אוטומטית, ולאחר מכן אימות התוצאות. אמינות זרימת העבודה אושרה על ידי סינון זני B. coagulans בעלי תפוקה גבוהה.

סקר מהיר של מוטנטים של חיידקים קואגולנס המופרזים בחומצה L-לקטית באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית של טיפות

בפרוטוקול וידאו זה אנו עוקבים - במהירות גבוהה ובתלת מימד - אחר ליזוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית בתוך תאים חיים, תוך שימוש בשיטת המעקב המסלולי במיקרוסקופ דו-פוטוני שונה.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

מאמר זה מתאר ניטור בזמן אמת של אבלציה של HIFU בכבד כלבים עם הדמיית אולטרסאונד בקצב פריימים גבוה באמצעות הדמיית גל מתפצל ומישור. הדמיית תנועה הרמונית לאולטרסאונד ממוקד משמשת להדמיית הירידה בתזוזה הנגרמת על ידי כוח קרינה אקוסטית באזור המנותק.

ניטור של עצימות גבוהות בזמן אמת אולטרסאונד ממוקד (HIFU) אבלציה של<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדי כלבי שימוש הרמוני Motion הדמיה לאולטראסאונד הממוקד (HMIFU)

למדו לנטר דינמיקה של חומצות מרה בתאים חיים באמצעות חיישן FRET מקודד גנטית. שיטה זו מאפשרת מעקב ישיר בתאים בודדים ללא צורך בסימון, ומספקת תובנות לגבי מטבוליזם ותהליכים תאיים בזמן אמת.

ניטור בזמן אמת של תאיים חומצות מרה Dynamics שימוש חומצות מרה חיישן מבוסס סריג גנטי מקודד

גלה סרטונים נוספים