Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

המטרה הכוללת של השימוש בציוד זה היא לגדל תאי גזע בתנאים אטמוספריים מוגדרים עם סטריליות מקסימלית. מה שאנחנו הולכים להדגים היום הוא השימוש במתקן תרבית תאים סגור המאפשר שליטה מעולה על פרמטרים של תרבית תאים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים במתקן זה לתרבית של תאי גזע רב-פוטנטיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהתאים נחשפים לסביבה קבועה לא משנה היכן הם נמצאים בזמן שאתה מעבד אותם. בין אם מדובר במניפולציה של התאים או באינקובטור או במיקרוסקופ, החשיפה שלהם לחמצן CO2 בטמפרטורות קבועות לאורך כל המחזור. מי שידגים את ההליך יהיה אלכסנדר סטובר, מדען צוות במעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, לחץ על מודול כדי להתאים את ריכוז הגז. בחלון החדש המציג את ההגדרות הנוכחיות, לחץ על ערך נקודת ההגדרה הקיים של החמצן מתחת ל-Setpoint והזן את ריכוז החמצן הנדרש עבור מודול זה. לאחר מכן, לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לאשר את נקודת ההגדרה.

חזור על מצב זה עבור פחמן דו חמצני והזן נקודת הגדרה של 5% פחמן דו חמצני עבור כל המודולים למעט תאי החיץ הניתנים להתאמה רק לחמצן. לאחר מכן, עקוב אחר ריכוזי הגז הנוכחיים המסומנים כערכי תהליך כדי לוודא שהם מגיעים לנקודות ההגדרה החדשות. לאחר מכן, התאם את נקודות הגז של כל המודולים לערכים המתאימים.

התאימו את רמות הפחמן הדו חמצני והחמצן של התאים שייחשפו זה לזה. לדוגמה, התאם את תא התהליך ל-5% חמצן לפני פתיחת אינקובטור המגדל תאים ב-5% חמצן. כוונן גם את תא החיץ המשמש להוספת פריטים לתא התהליך ל-5% חמצן.

לאחר מכן, הגדר את הטמפרטורה של תא התהליך ל -37 מעלות צלזיוס באמצעות אותו מסך להתאמות גז. לאחר מכן, הגדר את טמפרטורת רצפת תא התהליך ל -37 מעלות צלזיוס. לחץ על גדות מודול הדגירה מתחת לכל חממה והתאם את טמפרטורת הגדות ל-37 מעלות צלזיוס.

במכסה המנוע הלמינארי יש לרסס את כל החומרים הנכנסים למערכת באתנול 70% ולאפשר להם להתייבש. נגב בעדינות כל צלוחיות או צלחות תאים בעזרת ספוג גזה סטרילי רווי 70% אתנול. לאחר מכן, ודא שגם הדלתות החיצוניות וגם הפנימיות של תא החיץ סגורות היטב, ולאחר מכן פתח את הדלת החיצונית והנח את הפריטים בפנים לפני סגירתה.

באמצעות התוכנה, בחר את מודול המאגר ולחץ על הכרטיסייה גורם דילול. הזן אחד בתיבה גורם יומן ואחריו לחץ על התחל. לאחר שהממשק הגרפי הפסיק להבהב גורם דילול, פתח את הדלת הפנימית של תא החיץ והעבר את החומרים לתא התהליך.

על מנת להסיר פריטים מתא התהליך, ודא תחילה שתא החיץ עבר גורם דילול. לאחר מכן, פתח את הדלת הפנימית, הנח את הפריטים להסרה בפנים וסגור אותה. לאחר מכן, פתח את הדלת החיצונית והסר את הפריטים.

מניחים שלוש צלחות פטרי בתבנית המים בבסיס כל חממה. מלאו את הכלים הללו במים סטריליים ושמרו על מפלס המים בכלים אלה מכיוון שהם קריטיים לשמירה על נקודת הלחות היחסית באינקובטור. בתוך הממשק הגרפי, לחץ על החממה.

לאחר מכן, לחץ על הערך הקיים עבור לחות יחסית מתחת לנקודת ההגדרה והזן 85%לאחר מכן, לחץ על סימן הביקורת הירוק כדי לקבל ערך זה. לאחר מכן, התאם את תאי החיץ, תא התהליך והחממה לנקודות הגדרת הגז הנדרשות לסוג התאים המוצגים. נקו את פני תא התהליך עם גזה סטרילית וחומר חיטוי שאינו דליק כגון מוצר מבוסס בנזלקוניום כלוריד.

לאחר מכן, נקה את הכפפות והמשטחים שנוגעים בהם בדרך כלל כגון ידיות דלתות. לאחר מכן, נקו את פני השטח של מכסה המנוע ותא החיץ עם 70% אתנול והניחו לו להתייבש. לאחר מכן, הניחו את הבקבוק או צלחת התאים במכסה המנוע ונגבו בקצרה את המשטח החיצוני שלו עם ספוג גזה סטרילי רווי אתנול.

לאחר מכן, הכניסו את הבקבוק או הצלחת לתא החיץ והפעילו גורם דילול. בסיום, העבירו מיד את הבקבוק או הצלחת לחממה המתאימה. מכיוון שהחממה נמצאת בחלק האחורי של תא התהליך, משוך מדף החוצה לתוך תא התהליך למיקום התאים והימנע מפתיחת דלתות החממה שלא לצורך לפרקי זמן ממושכים.

בשלב זה, הכינו את מדיום תרבית התאים. אפשר למדיום להתייצב עם רמות הפחמן הדו חמצני והחמצן הקיימות במערכת על ידי השארת מיכל המדיה מעט לא מכוסה למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסר את המדיום הישן מהבארות.

עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים, הסר כמעט את כל המדיום הישן עם כמות קטנה של המדיום הישן שנותרה כדי למנוע התייבשות במהלך תהליך ההאכלה. עבור תאי גזע עצביים, הסר מחצית מהמדיום הישן. לאחר מכן, הוסיפו מדיום טרי לצלחות תרבית התאים והניחו את הצלחות בחזרה לחממה המיועדת להן.

מוצגת כאן תמונה של תאי ה-iPSC. להלן תאי ה-iPSC המוכתמים בשידור חי ב-AF594 שכותרתו Trial 160 עם דילול של 1 עד 100 במדיה. כל ה-iPSCs הומרו במתקן ייצור התאים ב-5% חמצן עם נגיף סנדאי.

והנה תמונת ניגוד הפאזה של תאי גזע עצביים שמקורם ב-iPSC שגודלו ב-5% חמצן בשקופיות תא. לאחר מכן התקבעו התאים ב-4% פרפורמלדהיד ונצבעו בנוגדנים ראשוניים אנטי-אנושיים נסטין ונוגדנים משניים Alexa Fluor 488. לאחר שליטה, ניתן לבצע סט טכניקות זה תוך שעתיים אם הוא מבוצע כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר נכון את ריכוזי הגז לפני שמתחילים. לאחר ההליך, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו תכנות מחדש ובידול על מנת לענות על שאלות נוספות כגון השפעת היפוקסיה על פלוריפוטנטיות או מולטיפוטנטיות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לחקור ייצור תאים קליניים לטיפול בהפרעות ניווניות בילדים.