Name: Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למדו לגדל תאי גזע פלוריפוטנטיים ועצביים במערכת תרבית סגורה המבטיחה סטריליות מקסימלית ותנאי אטמוספירה מבוקרים. שיטה זו תומכת במחקר ביולוגיית תאי גזע ובייצור קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לצוות Biospherix על עזרתם ללמוד להשתמש במערכת תרבית תאים סגורים Xvivo, במיוחד מאט פרימן; צוות של חברת בניית Miles &amp; קלי, Inc עבור עבודתם בהקמת תשתית המעבדה, במיוחד ראס יוז; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת אורנג &#39;קאונטי של מתקנים ושירותים תמיכה עבור עבודתם בתיאום לשפץ מעבדה, במיוחד אדם Lukhard ודווין Hugie; הצוות של בית החולים לילדים של מחלקת Orange County של מערכות מידע על עזרתם בהקמת התשתית לניהול נתונים וגישה מרחוק, במיוחד וייט טראן; בית החולים של צוות הניהול הבכיר של מחוז אורנג &#39;של ילדים לתמיכה ארוכת השנים שלהם של הפרויקט, במיוחד ד&quot;ר מריה Minon וברנט Dethlefs. עבודה זו מומנה על ידי בית החולים לילדים של מחוז אורנג &#39;המכון בקליפורניה הרגנרציה רפואהדואר דרך TR3-05476 מענק PHS. כל המחברים תרמו באופן שווה על עבודה זו.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תאים שגודלו בתוך ע.מ. רואים שום שינויים בריכוזים דו חמצן או פחמן, כאשר הם עוברים מן החממה כדי עיבוד בתא עד מיקרוסקופ חדר ובחזרה. זה קריטי, כי תנאים בתא אחד מותאמים בחממה המסוימת שבה התאים נשמרים לפני התאים יוסרו מן החממה. האווירה בתוך המנגנון היא ברציפות HEPA-מסוננת ניתן להתאמה אישית בכל נוגע ריכוזי דו תחמוצת חמצן ופחמן. תאים ניתן לגדל בריכוזי תקן PSCs או NSCs, 5% ו -9%, בהתאמה; או ניתן לבחור ריכוזים חלופיים תאים מסוגים שונים או עבור ניסויים ספציפיים. לפיכך, המנגנון מסופק עם מקורות מתמידים של חמצן כיתה רפואית, פחמן דו חמצני, חנקן (איור 4). כל שלושה גזים אלה מסופקים על ידי מערכות סעפת ספציפית-גז המבטיחות אספקה ​​מתמדת. המנגנון מסופק גם עם תערובת גז כיול מורכבת10% (± 0.01%) פחמן דו חמצני לחמצן. מערכות סעפת שוכנות מחוץ למתקן ייצור תאים והגזים נשמעים ברקע לתוך המתקן דרך התקרה. גז הכיול שוכן בתוך המתקן. המנגנון מסופק גם עם ואקום הבית, גם דרך התקרה. באמצעות מערכת ניטור אלקטרונית ואלחוטי יחידות שליחה, לחצי הפלט של כל הסעפות מנוטרים באופן קבוע. במקרה שכל לחץ נופל מחוץ לטווח, מפעילי מתקן ייצור תאים הם טלפנו באופן אוטומטי הודעה כזו פעולה מתאימה ניתן לקחת. דרישות הכח של המנגנון שלו ממומנות על ידי שישה 120 ייעודי V מעגלים יורדים מהתקרה ומחוברות מחוללי הגיבוי של בית החולים על מנת להבטיח אספקה ​​קבועה. מבצע של המנגנון נשלט באמצעות תוכנה במחשב PC המבוסס מופעל באמצעות אספקת חשמל פסק. הסדרי כוח ומחשב אלהלהבטיח כי פונקציות המערכת ברציפות גם במקרה של כשל במערכת חשמל ציבורי. תוכנת השליטה במנגנון בעלת ממשק גרפי ידידותי למשתמש (איור 1) אשר מאפשר השליטה הריכוזית דו תחמוצת חמצן והפחם וכן טמפרטורה, לחות, ולחצים קאמריים. הערכים של כל הפרמטרים הללו נרשמים באופן רציף על מנת ליצור רשום מצטבר של כל פרמטרי המנגנון. נתונים אלה מגובים על גבי שרת מרוחק מדי לילה כדי להגן על שלמותם. המחשב והתוכנות ניתן לגשת מרחוק על ידי משתמשים מנהליים להעריך ו / או לשנות כל פרמטר. בנוסף, המחשב ותוכנות ניתן לגשת מרחוק, המאפשרים הערכה אינטראקטיבית של פרמטרי מנגנון ופתרון בעיות עם משתמשים מקומיים. יחידת שליחת אזעקה נוספת מחובר למנגנון כזה מפעילי מתקן ייצור תאים מקבלים הודעה על כל out-of-טווח במצב של המנגנון. ג הגישה מרחוקapabilities לאפשר להתחבר והעריך את הפרטים של המצב מחוץ לטווח. המנגנון נועד כמערכת מודולרית הן מאקרו ותחושה מיקרו. מודולים תרבית תאים בודדים, כגון חממות ותאי עיבוד, יכול להיות מותאם אישית בכל הנוגע לממדים ודרישתם וכן בפריסה שלהם ביחס לזה. בנוסף, מרבית הפונקציות השליטות על מודולים הבודדים הם עצמם כאלה מודולרי בוקר גז האטמוספרי פרט, למשל, עשויים להיות מוחלפים בקלות ללא הפרעה משמעותית למערכת. תאי עיבוד מיוחדים, כגון אחד עבור להדמיה מיקרוסקופית ומניפולציה של תרביות תאים, ניתנים להתאמה בקלות למערכת. שני השלב בניגוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי הם בתוך המערכת (איור 6), כך תאים יכולים להיות מוכתם חי, ומושבות יכולות להיות גזורות באותם תנאים אטמוספריים כמו בתוך tהוא אינקובטורים. ניתוב של כבלים דרך grommets חתום הקירות הצדדיים של חדר העיבוד מאפשר ציוד כגון ספקי כוח ומחשבים להישמר מחוץ המנגנון, בדרך כלל על עגלה (איור 6). לתאי העיבוד במתקן ייצור תאים יש דפוס זרימת אוויר שונה מאשר BSCs הקונבנציונלי. בשנת BSCs הקונבנציונלי, זרימת אוויר זורם במורד מתוך פורקן פליטה מרכזי מתפצלת לשני זרמים נפרדים, אשר נלקחים מכן על ידי שני פתחי צריכה שונים בחלק קדימה ומאחור של הרצפה של הארון. לעומת זאת, ע.מ. יש פורקן יחיד בחלק הקדמי של התקרה. האוויר זורם כלפי מטה לכיוון החלק האחורי של החדר, שם הוא נמשך מכן כלפי מעלה לתוך פורקן צריך. למרות ע.מ. הוא מטבעו מאוד נקי, דפוס זרימת אוויר ייחודי זה אומר טכנאים צריכים להתאים את הטכניקה שלהם מעט כדי להפחית את הסיכון לזיהום. כמו עם BSC מקובלת, עובד במעבדהhould להימנע מלהציב את ידיהם נגד זרם של צלחות תרבית תאים פתוחות ובקבוקי תקשורת. עם זאת, כיוון שהוא הזרם השתנה ב ע.מ. המעבדה מתקן ייצור התאים עצמו הוא סטנדרטי למדי ו מגיע מאובזר עם מקפיא -20 ° C, -80 ° C במקפיא, מקרר 4 ° C., בצנטריפוגה, ואמבט מים. המעבדה גם יש כיור עם דוושות מבצע דיבורית נוח. על מנת במעבדה הזאת להפוך למתקן ייצור תאים קליני תפקודי, אולם מספר שינויים נוספים עדיין חייבות להתבצע. ראשית, המנגנון עצמו יש לשדרג כדי לקבל את היכולת לפקח על תרכובות אורגניות נדיפות, חלקיקים, וריכוזים של דו תחמוצת כלור המשמש טיהור. שנית, תא עיבוד המכיל מכונה FACS ניתן שוכן ומחובר שאר המנגנון באמצעות מודול חיץ. זה יאפשר מיון תא וטיהור trאוכלוסיות תאי ansplantable בתנאים הסביבתיים המתאימים. לבסוף, המנגנון כולו צריך להיות שוכן בתוך חדר נקי חומה רכה. זה מספק ארגון התקינה הבינלאומי הסביבה (ISO) בכיתה 8 למנגנון 5. על סטריליות הגבוהה וטבע מבוקרת מחשב של ע.מ. עושים את זה מערכת אידיאלית עבור יישומים עתידיים עם טיפול מבוסס תאים ותהליכי ייצור נאותים. הסיכון של זיהום היא מיתנה מאוד, אבל יותר חשוב, את התנאים של הרחבת התא נרשמות באופן אוטומטי לארכיון על ידי מערכת המחשב. סטיות בריכוזי גז, טמפרטורה, לחות, וכל אירועי גישה למערכת מתועדות בקפדנות. זה יכול לעזור מאוד כאשר חוקר בעיות איכות המוצר. עם זאת, ישנם עדיין מגבלות. השימוש של כל וכל ריאגנטים ואספקה ​​(למשל, רכיבי תקשורת, טפטפות, צלחות) חייב להיות מתועד בנפרד. לְהוֹסִיףitionally, יש שפע של בעיות פוטנציאליות (כולל צורות רבות של טעות אנושה) שיכול להתעורר אשר אינם קשורים זה לזה לחלוטין כדי המשתנים מתועד על ידי מערכת הניטור של CPF. לפיכך, את הצורך צוות מקצועי מהשורה הראשונה ותיעוד מדריך מפורט של משימות נשאר במקום.

טכניקות תרבית תאי גזע סטנדרטיות סובלות ממספר אילוצים סביבתיים המפעילים לחצים מיותרים על התאים וחושפים את התאים לסיכונים בלתי מתקבלים על הדעת של זיהום. בין הלחצים שהתאים עלולים לסבול בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים הם שינויים תלולים ברמות הפחמן הדו חמצני וריכוזי החמצן3,4. זה קורה כאשר התאים מועברים מהחממה לארון הבטיחות הביולוגית ו/או למיקרוסקופ שאולי לא אופטימלי עבור התאים. מחקרים קודמים אישרו את היתרונות של גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים ועצביים בתנאים היפוקסיים4,11, ולקבלת התוצאות הטובות ביותר, תנאים אלה צריכים להיות רציפים. יתר על כן, הסיכונים לזיהום תאים גבוהים יותר מכיוון שסביבת המעבדה והצוות פוגעים בתאים כמעט בכל שלב של התרבית והמניפולציה שלהם. חדרים נקיים מסורתיים מהווים שיטה יעילה אחת להפחתת סיכוני הזיהום באופן משמעותי, אך הם יקרים, בעלי טביעת רגל גדולה ואינם מטפלים בגורמי לחץ הקשורים לריכוזי פחמן דו חמצני וחמצן. 
מתקן לייצור תאים שיכול לטפל הן בסיכוני זיהום והן בריכוזי גזים ושניתן להסמיך לעמוד בקריטריונים של cGMP9 מספק תאים באיכות גבוהה למחקר מדעי בסיסי כמו גם ליישומים קליניים1,6,7. מתקן ייצור תאים כזה מורכב, לכל הפחות, מהרכיבים הבאים: תא תהליך, המשמש כסביבת עבודה מחוממת להזנה ומניפולציה של תרביות תאים; מכסה מנוע זרימה למינר, לעיקור ראשוני של ריאגנטים, צינורות וכלים; שני תאי נעילת אוויר חוצצים בין מכסה המנוע לתא התהליך; שתי חממות תרבית תאים נגישות מתא התהליך; תא מיקרוסקופ הצמוד לתא התהליך; ולבסוף, תוכנת מחשב להגדרה ולניטור התנאים בתוך מודולים אלה. באמצעות תשתית בסיסית זו, ניתן לבצע מגוון רחב של משימות, כגון הזנה סטנדרטית ומעבר של תאי גזע פלוריפוטנטיים ותאי גזע עצביים רב-פוטנטיים, כמו גם שיטות מיוחדות יותר כמו תכנות מחדש מבוסס וירוס סנדאי, מחקרי נדידה במבחנה והתמיינות של תאי גזע עצביים לאפיון אלקטרופיזיולוגי.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo מערכת</td><td>Biospherix</td><td>בהתאמה אישית</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo תוכנה</td><td>Biospherix</td><td>גרסה i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 סעפת</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO2 סעפת</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 סעפת</td><td>מערבית</td><td>חדשנית CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ עם מצלמת DP21 ופלואורסצנטי</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>נתרן היקלון חוצץ פוספט</td><td></td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסט 2</td><td>מו"פ D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>פרוטיד</td><td>PP1130</td><td></td></tr> טכנולוגיות <tr><td>חיים של דיסוציאציה של תאים מבוססות האנק</td><td></td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמיס</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 תוסף סרום</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>חומרים מתכלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>אולימפוס פלסטיק</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>אולימפוס פלסטיק</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>אולימפוס פלסטיק</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל פיפט סרולוגי</td><td>אולימפוס פלסטיק</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 בארות צלחת</td><td>קורנינג</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 בקבוק</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 בקבוק</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 ומיקרו; l קצות פיפט</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 ומיקרו; l טיפים</td><td>פיפט Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 קצות פיפט</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

מאמר זה מתאר כיצד להשתמש במערכת תרבית תאים סגורה המיוצרת בהתאמה אישית וזמינה מסחרית למחקר בסיסי ופרה-קליני. ארונות בטיחות ביולוגית (BSCs) וחממות הם זה מכבר הסטנדרט לתרבית והרחבה של קווי תאים למחקר בסיסי ופרה-קליני. עם זאת, ככל שהמיקוד של מעבדות תאי גזע רבות עובר ממחקר בסיסי לתרגום קליני, יש צורך בדרישות נוספות ממערכת תרבית התאים. כל התהליכים חייבים להיות מתועדים היטב ויש להם דרישות יוצאות דופן לסטריליות ושחזור. בחממות מסורתיות, ריכוזי הגז והטמפרטורות משתנים באופן נרחב בכל פעם שהתאים מוסרים לצורך האכלה, מעבר או מניפולציות אחרות. הפרעות כאלה תורמות לסביבה שאינה הסטנדרט להנחיות cGMP ו-GLP. יש למזער את ההפרעות הללו במיוחד כאשר תאים מנוצלים למטרות טיפוליות. המוטיבציה לעבור ממערכת ה-BSC והחממה הסטנדרטית למערכת סגורה היא שהפרעות כאלה יכולות להיות זניחות. מערכות סגורות מספקות מרחב עבודה להזנה ומניפולציה של תרביות תאים ותחזוקתן בסביבה מבוקרת שבה הטמפרטורה וריכוזי הגז עקביים. בדרך זו, תאי גזע פלוריפוטנטיים ומולטיפוטנטיים יכולים להישמר בבריאות אופטימלית מרגע היווצרותם ועד לשימוש הסופי שלהם בטיפול.

כתב יד זה מתאר בפירוט מתקן ייצור תאים, ואת ההיבטים הייחודיים של תאי culturing בתוך מערכת סגורה. חלק הארי של מתקן ייצור תאים כולל מנגנון תרבות מחוייט, סגור, תא שבו יש טביעת רגל קטנה והוא יכול להיות מאוחסן בקלות בתוך 6 x 7.5 מ &#39;2 חדרים (איור 2). באותו זמן לא הוא התאים בתוך המנגנון חשוף אנשי מעבדה או סביבה. המנגנון מורכב של מספר מודולים: תא תהליך, במנדף זרימה למינרית, 2 תאי airlock חציצה בין מכסה המנוע ואת תא התהליך, שתי חממות תרבית תאים, וחדר מיקרוסקופ סמוך לתא התהליך (איור 3). המערכת נשלטת על ידי תוכנה המאפשרת משתנים סביבתיים להיות מבוקר תחת פיקוח (איור 1). המחשב פועל תוכנה זו היא על-פסק. גזים מוזנים לתוך המערכת דואר על ידי קבוצה של סעפות עבור חמצן, חנקן ופחמן דו חמצני (איור 4). גזים עבור ההתקן מסופקים על ידי מערכות סעפת שיש שתי קבוצות של טנקים כל - סט פעיל ומערכת מילואים. כאשר הערכה הפעילה מופנה כלפי מטה, הסעפת עוברת אוטומטית המילואים להגדיר וצוות הטנקים החלופיים. הכוח נמצא על מערכת גנרטור גיבוי. פלוריפוטנטיים ותאי גזע עצביים ניתן לגדל בתנאי חוסר חמצן במתקן זה באמצעות הפרוטוקולים שפותחו בעבר 9, עם סיבוכים הוסיף אינהרנטי ציוד הרומן. תאי גזע פלוריפוטנטיים ניתן לגזור באמצעות וירוס סנדאי, באמצעות נוגדנים ספציפיים pluripotency לזהות מושבות טרנספקציה מלאה, אשר מבודדות אז והרחיבו. (איור 5 א &#39;וב&#39;), מ iPSCs אלה, תאים ונוירונים גזע עצביים ניתן לגזור באמצעות עיכוב הסמאד כפול, ואת הפנוטיפ שלהם אומת usi<html> ng נוגדנים המל&quot;ל ספציפיים (איור 5 ג ו-ד). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> איור 1. ממשק גרפי את הייצור במתקן הנייד. (א) הייצוג הגרפי של ע.מ. הוא למסך ברירת המחדל ותואם את ציור CAD שמוצג באיור 3. לחיצה על העכבר מעל 1 מודול החוצץ (2F באיור 1) נפתח מסך שליטתה (B) שבו O 2 ערכים מוגדרים כדי להתאים את תא עיבוד (3 באיור 3). באופן דומה, לחיצה על התהליך קאמרי או חממת 1 מעלה מסכי הבקרה שלהם (C ו- D, בהתאמה), שבה ערכים עשויים להשתנות או פיקוח על פי צורך.<html> r קבל = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> איור 2. מתקן ייצור תאים. (א) המערכת כפי שניתן לראות מנקודת מבט ימני קדמי. הערה את חיבורי החשמל והגז בתקרה והעגלה עם אביזרים מיקרוסקופ והמחשב ימינה. (ב) מכסה המנוע זרימה למינרית עם דלתות גישה מודולים חיץ לראות בצד ימין. (C) תא התהליך עם שתי חממות (דלתות שחורות) לראות בחלק האחורי. (ד) מבט דרך הצד הימני של המערכת מראה את המיקרוסקופ ולנטר עם הדלתות לתאי החיץ נראים מרחוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> איור 3. CAD שרטוט של מתקן ייצור תאים. כל הפריטים הזנת המכשיר נמחקים למטה הראשון עם אלכוהול ואוויר מיובש למכסה המנוע זרימה למינרית (1). פריטים מכן יועברו אל האווירה המתאימה במודול החיץ מול (2F) בטרם עבר לתוך מודול UCPC, או תהליך קאמרי (3). הם תאים בתרבית בתוך שתי החממות (4, 5). מכתים תא חי, מושבת קטיף, הערכת מורפולוגיה תאית כללית וניתוח הגירה מתרחשת במודול UPC, או לשכת מיקרוסקופ (6). לבסוף, פסולת יוצאת המערכת באמצעות מודול החיץ האחורי (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> מקורות איור 4. גזי הכח. (א) סעפת 2 CO היא התקנה 4 x 4 כפי שהיא מספקת את כל החממות של המעבדה. (ב) סעפת O 2 היא התקנת 2 x 2 ואספקה ​​למתקן ייצור תאים בלבד. חנקן למערכת נוצרת מאדה (C, ממש מתחת שלט היציאה) מחוברת סעפת חנקן נוזלי (ימינה) כי גם ממלא באופן אוטומטי cryofreezers (למטה משמאל). הסעפת היא התקנה 2 x 2 להיות מסופקת על ידי שני זוגות של טנקי חנקן נוזל 160 L. CO 2, O 2, ו- N 2 מסופקים מהתקרה דרך shutoffs (D). ואקום בית מסופק גם במיקום זה. נראה ממש מאחורי shutoffs גז אספקה ​​הם זוג כבלי חשמל המספקים חשמל למערכת.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> איור 5. תאים פלוריפוטנטיים גזע שמקורם ב היפוקסיה בווירוס סנדאי. (א) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (המינוח נמצא סטובר et al. 9), לעומת שלב 10X. (ב) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs חי מוכתם AF-594 שכותרתו Tra-1-60, 1: 100 דילול בתקשורת. כל iPSCs היו transduced במתקן הייצור תא 5% O 2 עם וירוס סנדאי. (ג) בניגוד שלב של SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 NSCs iPSC נגזר, גדל ב 5% O 2 ב שקופיות קאמריות. התאים היו קבועים אז paraformaldehyde 4% ו מוכתם נוגדן ראשוני אנטי אנושי Nestin, ואלכס-488 נוגדנים משני. כל הברים בקנה המידה נמצאים 1001;. מ &#39; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

להלן פרוטוקול לגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) ותאי גזע עצביים (NSC) במערכת תרבית תאים סגורה המאפשרת סטריליות ושחזור מקסימליים, ומחליפה את ארון הבטיחות הביולוגית והחממה המסורתיים. ציוד זה עומד בהנחיות שיטות ייצור קליניות טובות (cGMP) ושיטות מעבדה קליניות טובות (cGLP).

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

המטרה הכללית של שימוש בציוד זה היא גידול תאי גזע בתנאים אטמוספריים מוגדרים תוך שמירה על סטריליות מקסימלית. כעת נדגים את השימוש במתקן סגור לתרביות תאים, המאפשר בקרה מדויקת על פרמטרי תרבית התאים. במעבדה שלנו, אנו משתמשים במתקן זה לתרבית של תאי גזע רב-פוטנציאליים (multipotent) ותאי גזע פלוריפוטנציאליים (pluripotent).היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שהתאים חשופים לסביבה קבועה ללא קשר למיקומם במהלך העיבוד. בין אם מדובר במניפולציה של התאים, בשהייה באינקובטור או תחת המיקרוסקופ, החשיפה שלהם לחמצן, CO2 ולטמפרטורה נותרת קבועה לאורך כל המחזור. את הפרוצדורה ידגים אלכסנדר סטובר (Alexander Stover), מדען צוות במעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, לחצו על מודול כדי להתאים את ריכוז הגז. בחלון החדש המציג את ההגדרות הנוכחיות, לחצו על ערך נקודת היעד (setpoint) הקיים של החמצן תחת Setpoint והזינו את ריכוז החמצן הנדרש עבור מודול זה. לאחר מכן, לחצו על סימן ה-V הירוק כדי לאשר את נקודת היעד.חזור על שלב זה עבור פחמן דו-חמצני והזן ערך יעד של 5%carbon dioxide עבור כל המודולים, למעט תאיו של הבאפר (buffer chambers) שניתן לכוונן בהם רק את רמת החמצן. לאחר מכן, עקב אחר ריכוזי הגז הנוכחיים, המסומנים כ-Process Values, כדי לוודא שהם מגיעים לערכי היעד החדשים. לבסוף, כוונן את ערכי היעד של הגזים בכל המודולים לערכים המתאימים.השוו את רמות הפחמן הדו-חמצני והחמצן של התאים שייחשפו זה לזה. לדוגמה, כוון את תא העיבוד ל-5%oxygen לפני פתיחת אינקובטור המגדל תאים ב-5%oxygen. כוון באופן דומה את תא המקשר (buffer chamber), המשמש להכנסת פריטים לתא העיבוד, ל-5%oxygen.בשלב הבא, הגדירו את הטמפרטורה של תא העיבוד ל-37 degrees celsius באמצעות אותו מסך להתאמות הגזים. לאחר מכן, הגדירו את טמפרטורת רצפת תא העיבוד ל-37 degrees celsius. לחצו על מאגרי מודול האינקובציה שמתחת לכל אינקובטור והתאימו את טמפרטורת המאגרים ל-37 degrees celsius.בתוך מuתנפח הזרימה הלמינרית, רססו את כל החומרים המוכנסים למערכת ב-70%ethanol והמתינו לייבושם. נגבו בעדינות כל בקבוק או צלחת תאים באמצעות ספוג גזה סטרילי הספוג ב-70%ethanol. לאחר מכן, ודאו ששתי הדלתות, החיצונית והפנימית, של תא הבאפר סגורות היטב, פתחו את הדלת החיצונית והניחו את הפריטים בפנים לפני סגירתה.באמצעות התוכנה, בחרו את מודול הבאפר (buffer module) ולחצו על הלשונית Dilution Factor. הזינו את הערך 1 בתיבת ה-Log Factor ולאחר מכן לחצו על start. לאחר שהממשק הגרפי יפסיק להבהב את הכיתוב Dilution Factor, פתחו את הדלת הפנימית של תא הבאפר והעבירו את החומרים לתא העיבוד (process chamber).כדי להוציא פריטים מתא העיבוד, ודאו תחילה שתא המאזן עבר גורם דילול (Dilution Factor). לאחר מכן, פתחו את הדלת הפנימית, הניחו בתוכה את הפריטים להוצאה וסגרו אותה. לאחר מכן, פתחו את הדלת החיצונית והוציאו את הפריטים.הניחו שלוש צלחות פטרי בתבנית המים בבסיסו של כל אינקובטור. מלאו צלחות אלה במים סטריליים ושמרו על מפלס המים בהן, שכן הן קריטיות לשמירה על נקודת היעד של הלחות היחסית באינקובטור. בממשק הגרפי, לחצו על incubator.לאחר מכן, לחצו על הערך הקיים עבור הלחות היחסית תחת נקודת העיגון (setpoint) והזינו 85%. לאחר מכן, לחצו על סימן האישור הירוק כדי לקבל ערך זה. בשלב הבא, כווננו את תאי הבאפר, את תא התהליך ואת האינקובטור לנקודות העיגון של הגז הנדרשות עבור סוג התאים המוחדרים. נקו את פני השטח של תא התהליך באמצעות גזה סטרילית וחומר חיטוי שאינו דליק, כגון מוצר המבוסס על benzalkonium chloride.לאחר מכן, נקה את הכפפות ואת המשטחים שבהם נגיעה שכיחה, כגון ידיות דלתות. בהמשך, נקה את פניו של מטאס הכביסה (Laminar Flow Hood) ואת תא הדחף באמצעות 70% ethanol והמתן לייבוש. לאחר מכן, הנח את הבקבוק או את צלחת התאים במטאס ונגב קצרות את פניו החיצוניים באמצעות ספוג גזה סטרילי הספוג ב-ethanol.לאחר מכן, הניחו את הבקבוק או את הפלטה בתא הבאפר והפעילו Dilution Factor. עם הסיום, העבירו מיד את הבקבוק או את הפלטה לאינקובטור המתאים. מכיוון שהאינקובטור נמצא בחלקו האחורי של תא התהליך, משכו מדף אל תוך תא התהליך לצורך הנחת התאים, והימנעו מפתיחת דלתות האינקובטור ללא צורך למשך פרקי זמן ממושכים.בשלב זה, הכינו את מצע גידול התאים. אפשרו למצע להגיע לשיווי משקל עם רמות הפחמן הדו-חמצני והחמצן במערכת על ידי השארת מיכל המצע פתוח חלקית למשך 20 דקות. לאחר מכן, הסירו את המצע הישן מהבארות.עבור תאי גזע פלוריפוטנטיים, יש להסיר כמעט את כל המצע הישן, כאשר כמות קטנה של המצע הישן נשארת כדי למנוע התייבשות במהלך תהליך ההאכלה. עבור תאי גזע עצביים, יש להסיר מחצית מהמצע הישן. לאחר מכן, יש להוסיף מצע טרי לצלחות תרבית התאים ולהחזיר את הצלחות לאינקובטור הייעודי שלהן.כאן מוצגת תמונה של ה-iPSCs. אלו הם iPSCs שצבעו בשיטה חיה באמצעות Trial 160 המסומן ב-AF594 בדילול של 1:100 במצע. כל ה-iPSCs הועברו טרנסדוקציה במתקן לייצור תאים ב-5% oxygen באמצעות נגיף Sendai.וכאן תמונת ניגודיות פאזה של תאי גזע עצביים המופקים מ-iPSC, שגודלו ב-5% oxygen בשקופיות תא (chamber slides). התאים קובעו ב-4% paraformaldehyde ונצבעו עם נוגדן ראשוני Anti-Human Nestin ונוגדן משני Alexa Fluor 488. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע סדרת טכניקות זו בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגדיר נכון את ריכוזי הגזים לפני התחלת העבודה. לאחר ביצוע ההליך, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון תכנות מחדש (reprogramming) ודיפרנציאציה, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון השפעת היפוקסיה על פלוריפוטנציה או מולטיפוטנציה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של תאי גזע לבחון ייצור תאים קליני לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות בילדים.

culturing-human-pluripotent-neural-stem-cells-an-enclosed-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

הסרטון מתאר את הנוהל לשמירה על סביבה מבוקרת בתחנת עבודה של תרבית תאים לגידול ותחזוקה של תאי גזע עצביים. נהלים אלה כרוכים בקביעת תנאי החדר, פרוטוקולי ניקוי והכנת מדיה, ובכך שמירה על סטריליות ושחזור מרביים והחלפת השיטות המסורתיות.

טיפול בתרביות תאי גזע עצביים במתקן לייצור תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה להפצת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות מדיה מותנית בלבד שמקורה בשליה האנושית בצלחת מצופה ג'לטין ללא תוספת אקסוגנית נוספת או שכבות סינתטיות ספציפיות ל-hPSC.

תרבות דגם חדשני לpluripotent אדם תאי גזע רביה בטין במדיה מזגן שליה

פרוטוקול זה, אנו שואפים לתאר שיטה ישימה עבור שילוב הפומבית pluripotent אנושיים לתאי גזע נגזר נוירונים, האסטרוציטים יחד לתוך 3D כדור cocultures, שמירה על אלה התחומים בתנאים צף חינם, ולאחר מכן מדידת פעילות סינפטית מעגל הכדורים עם immunoanalysis והקלטות מערך multielectrode.

Microcircuit סינפטית דוגמנות עם Cocultures 3D האסטרוציטים ו נוירונים מתאי גזע Pluripotent אנושי

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

אנו מראים את האוטומציה של תרבויות תאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSC) הנגרמים על ידי בני אדם ובדיונים עצביים התואמים להדמיה וניתוח אוטומטיים.

ייצור אוטומטי של נוירונים קורטיים קורטיים ודופאמין נגזר תאי גזע המושרה על ידי תאי גזע אנושיים עם ניטור משולב של תאים חיים

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאי עצב פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע אנושיים בביוריאקטור תרחיף תלת-ממדי של ספסל.

ייצור נוירוגנין אנושי 2-Inducible Neurons בביוריאקטור תרחיף תלת ממדי

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למערכת תרבית תאים אוטומטית. מערכת תרבית אוטומטית זו מפחיתה את העבודה ומועילה למשתמשים, כולל חוקרים שאינם בקיאים בטיפול בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), החל מתחזוקה של תאי iPS ועד התמיינות לסוגים שונים של תאים.

מערכת תרבית אוטומטית לשמירה והתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

למדו לגדל תאי גזע פלוריפוטנטיים ועצביים במערכת תרבית סגורה המבטיחה סטריליות מקסימלית ותנאי אטמוספירה מבוקרים. שיטה זו תומכת במחקר ביולוגיית תאי גזע ובייצור קליני.

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

גלה סרטונים נוספים