צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות בו זמנית אניונים של תחמוצת החנקן התוך-תאית וסופר-אוקסיד באמצעות צבע הקרינה DAF-2DA ו-DHE באבי העורקים השלמים של עכברים מבודדים טריים. שיטה זו יכולה לסייע בשחזור מעבדה של מקרה של חוקר בתחום הפיזיולוגיה הקרדיווסקולרית כגון תפקוד לקוי של האנדותל וניתוק eNOS. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק שיטה פשוטה ומדויקת לזיהוי והדמיה ישירה ex vivo של אניון תחמוצת החנקן וסופראוקסיד בו זמנית בכלי דם שלמים.

עבור פרוטוקול זה, בנה מערכת אמבט איברים הניתנת לחימום ל -37 מעלות צלזיוס ולאוורר עם 95% חמצן, 5% גז פחמן דו חמצני ממיכל גז פחמן. כדי להתחיל, הכינו מספיק מאגר ביקרבונט טרי של Krebs-Ringer לפי הצורך כדי לרחוץ את הרקמות המעניינות. לדוגמא, יש צורך ב -200 מיליליטר עבור אבי העורקים בניסוי אחד.

הפעל את מערכת אמבט האיברים והתאם את בקרת החום ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת התאים עם מאגר קרבס-רינגר, הוסף חמישה מיליליטר של מאגר קרבס-רינגר ביקרבונט לכל תא והפעל את הגז כדי לאוורר אותו עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. שמור על התאים מכוסים.

כמו כן, הכינו בקבוק של מאגר קרקרבונט קר כקרח עם אוורור. לאחר כריתת אבי העורקים החזי, טבלו מיד את כל הרקמה בכלי עם בופר קרבס-רינגר קר כקרח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר את הלב וקשת אבי העורקים תוך שמירה על מקטע אבי העורקים החזי במאגר.

לאחר מכן, נתח את אבי העורקים ללא הדבקה של רקמה פריוסקולרית באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את קצה הרקמה ולשטוף בעדינות את הדם מלומן כלי הדם באמצעות מאגר קרבס-רינגר קר כקרח המועבר ממזרק. יש לשטוף את קרישי הדם בלומן כלי הדם מכיוון שהם עלולים לגרום לאותות מלאכותיים ולהפריע לאותות הפלואורסצנטיים ובמקביל, יש לשלוט בחוזק השטיפה כדי לא לפגוע בשכבת האנדותל.

כעת, חותכים את טבעות אבי העורקים הנקיות למקטעים באורך שלושה מילימטרים. לאחר הכנת טבעות אבי העורקים המנוקות יש להכתים אותן. נגיעה רק בצד האדוונטיאלי של טבעות אבי העורקים עם מלקחיים, מבלי להדק את כלי הדם, העבירו את מקטעי אבי העורקים הנקיים לתאי אמבט האיברים המוכנים.

תן לעורקים להתייצב במאגר למשך 30 דקות. לאחר חצי שעה, הוסף אצטילכולין לאמבטיית האיברים כדי לתת ריכוז סופי של מיקרוטולר אחד ודגר את העורקים למשך 10 דקות עם האצטילכולין. בינתיים, בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, הכינו מיליליטר של תמיסת מכתים עם מאגר קרבס מחומם מראש.

לאחר מכן, עטפו את הצינור בנייר כסף כדי למזער את החשיפה לאור ולשמור אותו על 37 מעלות צלזיוס. לאחר גירוי האצטילכולין, העבירו את טבעות אבי העורקים מאמבט האיברים לצינור תמיסת הצביעה ותנו להן לדגור במשך 30 דקות בחושך עם אוורור. כל השלבים מנקודה זו והלאה צריכים להיעשות עם חשיפה מינימלית לאור.

לאחר מכן, העבירו את טבעות אבי העורקים לצינור חדש מלא במאגר קרבס למשך דקה. בצע את שלב הכביסה הזה שלוש פעמים. לאחר מכן, יש לתקן את טבעות אבי העורקים באמבטיה של תמיסת 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר שלב הקיבוע, העבירו את הטבעות לתמיסת DAPI למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי למרוח את הכתם הנגדי. לאחר מכן, שטפו את טבעות אבי העורקים עם PBS שלוש פעמים למשך דקה אחת לכל שטיפה. היו תמיד רגישים לשבריריות רקמת האנדותל בעת הזזת הטבעות.

תחת מיקרוסקופ, חותכים את טבעות אבי העורקים לאורך בעזרת מספריים מיקרוכירורגיים על שקופית. לאחר מכן, הסירו את כל הנוזלים העודפים על אבי העורקים תוך שמירה על רטובות. כפה את אבי העורקים המגולגלים שטוחים כנגד מגלשה כשהאנדותל פונה כלפי מטה על מגלשת הזכוכית באמצעות שני מלקחיים מיקרו-כירורגיים.

בתהליך זה, אין להזיז את אבי העורקים קדימה ואחורה. שלב זה הוא קריטי מאוד, אך לא קל לתפעול. עדיף להתאמן הרבה לפני הניסוי הפורמלי.

לאחר מכן, זרוק את אמצעי ההרכבה על אבי העורקים. מכסים את השקופית ואוטמים אותה בלק. לאחר ייבוש באוויר בחושך, דמיין את השקופיות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

השתמש במהירות סריקה של 200 הרץ, ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים ובגודל z-stack של רבע מיקרון. כדי לצפות ב-DAF-2DA, השתמש בלייזר ארגון, הגדר את הקרינה ההתרגשות ל-488 ננומטר ואת זיהוי הפליטה ל-515 ננומטר. כדי לצפות ב-DHE, הגדר את הקרינה המעוררת ל-514 ננומטר והגדר את הזיהוי ל-605 ננומטר.

לאחר התמקדות בהגדלות פי 10, התאם את המטרה להגדלות של פי 40. כעת, הגדירו את טווח שכבת האנדותל על ידי התאמת מיקום z בלוח הבקרה, תוך שימוש בגרעינים המוכתמים ב-DAPI כציוני דרך. לאחר מכן, סרקו משכבת האנדותל על גבול הלומן דרך העובי המלא של שכבת האנדותל והקליטו את התמונות.

סרוק לפחות שלושה שדות ראייה שונים עבור כל דוגמה. עכברי C57 שחורים צעירים 6 נעשו שמנים על ידי האכלת תזונה עתירת שומן במשך 14 שבועות. הביקורת הוזנה בצ'או רגיל.

לאחר 14 שבועות נבדקו עורקי בית החזה שלהם. לפני הצביעה, הרקמות נחשפו למעכב ה-eNOS L-NAME למשך שעה בננו-טוחנת אחת. האות מ-DAF-2T, הנראה בירוק, מומר מ-DAF-2 שאינו פלואורסצנטי על ידי תחמוצת החנקן.

אז, צביעה מרמזת על נוכחות תחמוצת החנקן בתא. באופן דומה, כאשר מתחמצן על ידי סופראוקסיד, DHE משדר אות פלואורסצנטי אדום. לכן, בדגימות שמציגות יותר צבע אדום יש יותר סופראוקסיד בתאים.

כימות תמונות הקרינה הקונפוקלית חשף ירידה בייצור תחמוצת החנקן ועלייה בייצור סופר אוקסיד רגיש ל-L-NAME בשכבת האנדותל של אבי העורקים של העכברים שניזונו מהתזונה עתירת השומן. נתונים אלה תומכים ברעיון שניתוק eNOS מתרחש עם השמנת יתר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות תחמוצת החנקן ואניוני הסופראוקסיד, והשימוש בצבעים פלואורסצנטיים בכלי דם שלמים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שכבת האנדותל בטקט במהלך כל הליך הניתוח. ותמיד לטבול את כלי הדם במאגר קרבס-רינגר כדי לשמור על תאי האנדותל בחיים לפני שלב הקיבוע.

בשילוב עם הליך זה ניתן לבצע אמצעים אחרים כמו ניתוח תגובות כלי דם של כלי דם על מנת לענות על שאלות נוספות כמו תפקוד פיזיולוגי של תאי אנדותל בוויסות טונוס כלי הדם.