Name: רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: למדו שיטת רזולוציה גבוהה לניתוח הפעלת IRF3 תלוית-זירחון באמצעות SDS-PAGE ו-Native-PAGE עם נוגדנים פוספו-ספציפיים. טכניקה זו מאפשרת הבחנה בין צורות מופעלות שונות של גורם השעתוק IRF3 בתגובת החיסון המולדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברי המעבדה בעבר ובהווה על פיתוח הפרוטוקולים. העבודה נתמכה על ידי מימון מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) [מענק # MOP-130527] וממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה [NSERC-355306-2012]. NG זכתה בקתדרת מחקר Tier II Canada. AR מחזיקה במלגת לימודים מתוכנית ההכשרה של רשת המחקר לבריאות הנשימה מ-Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQS).

<ol><li>Juang, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+activation+of+interferon+A+and+interferon+B+gene+transcription+by+interferon+regulatory+factory-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factory-3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 9837-9842 (1998).</li>
<li>Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+casein+kinase+II+phosphorylation+in+the+regulation+of+IRF-1+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity.</a> Mol Cell Biochem. 191 (1-2), 169-180 (1999).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+interferon+regulatory+factor+3+target+genes%3A+direct+involvement+in+the+regulation+of+interferon-stimulated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of interferon regulatory factor 3 target genes: direct involvement in the regulation of interferon-stimulated genes.</a> J Virol. 76 (11), 5532-5539 (2002).</li>
<li>Thompson, M. R., Kaminski, J. J., Kurt-Jones, E. A., Fitzgerald, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+receptors+and+the+innate+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition receptors and the innate immune response to viral infection.</a> Viruses. 3 (6), 920-940 (2011).</li>
<li>Grandvaux, N., tenOever, B. R., Servant, M. J., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+antiviral+response%3A+from+viral+invasion+to+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The interferon antiviral response: from viral invasion to evasion.</a> Curr Opin Infect Dis. 15 (3), 259-267 (2002).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Distinct+Signaling+Pathways+Leading+to+the+Phosphorylation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Distinct Signaling Pathways Leading to the Phosphorylation of Interferon Regulatory Factor 3.</a> J Biol Chem. 276 (1), 355-363 (2001).</li>
<li>Qin, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+IRF-3+reveals+mechanism+of+autoinhibition+and+virus-induced+phosphoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of IRF-3 reveals mechanism of autoinhibition and virus-induced phosphoactivation.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 913-921 (2003).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+crystal+structure+of+IRF-3+and+its+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray crystal structure of IRF-3 and its functional implications.</a> Nat Struct Biol. 10 (11), 922-927 (2003).</li>
<li>Mori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ser-386+of+interferon+regulatory+factor+3+as+critical+target+for+inducible+phosphorylation+that+determines+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of Ser-386 of interferon regulatory factor 3 as critical target for inducible phosphorylation that determines activation.</a> J Biol Chem. 279 (11), 9698-9702 (2004).</li>
<li>Clement, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+IRF-3+on+Ser+339+generates+a+hyperactive+form+of+IRF-3+through+regulation+of+dimerization+and+CBP+association%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of IRF-3 on Ser 339 generates a hyperactive form of IRF-3 through regulation of dimerization and CBP association.</a> J Virol. 82 (8), 3984-3996 (2008).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+interferon-regulatory+factor+3-dependent+innate+antiviral+response+by+the+prolyl+isomerase+Pin1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of interferon-regulatory factor 3-dependent innate antiviral response by the prolyl isomerase Pin1.</a> Nat Immunol. 7 (6), 598-605 (2006).</li>
<li>Wathelet, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+infection+induces+the+assembly+of+coordinately+activated+transcription+factors+on+the+IFN-beta+enhancer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Virus infection induces the assembly of coordinately activated transcription factors on the IFN-beta enhancer in vivo.</a> Mol Cell. 1 (4), 507-518 (1998).</li>
<li>Karpova, A. Y., Trost, M., Murray, J. M., Cantley, L. C., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-3+is+an+in+vivo+target+of+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-3 is an in vivo target of DNA-PK.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (5), 2818-2823 (2002).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TAK1-JNK+cascade+is+required+for+IRF3+function+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The TAK1-JNK cascade is required for IRF3 function in the innate immune response.</a> Cell Res. 19 (4), 412-428 (2009).</li>
<li>Solis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+TBK1+and+IKKepsilon+in+lipopolysaccharide-induced+activation+of+the+interferon+response+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of TBK1 and IKKepsilon in lipopolysaccharide-induced activation of the interferon response in primary human macrophages.</a> Eur J Immunol. 37 (2), 528-539 (2007).</li>
<li>Soucy-Faulkner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NOX2+and+reactive+oxygen+species+for+efficient+RIG-I-mediated+antiviral+response+through+regulation+of+MAVS+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Requirement of NOX2 and reactive oxygen species for efficient RIG-I-mediated antiviral response through regulation of MAVS expression.</a> PLoS Pathog. 6 (6), e1000930(2010).</li>
<li>Lin, R., Heylbroeck, C., Pitha, P. M., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-dependent+phosphorylation+of+the+IRF-3+transcription+factor+regulates+nuclear+translocation%2C+transactivation+potential%2C+and+proteasome-mediated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-dependent phosphorylation of the IRF-3 transcription factor regulates nuclear translocation, transactivation potential, and proteasome-mediated degradation.</a> Mol Cell Biol. 18 (5), 2986-2996 (1998).</li>
<li>Yoneyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+triggering+of+the+type+I+interferon+system+by+virus+infection%3A+activation+of+a+transcription+factor+complex+containing+IRF-3+and+CBP%2Fp300%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct triggering of the type I interferon system by virus infection: activation of a transcription factor complex containing IRF-3 and CBP/p300.</a> EMBO J. 17 (4), 1087-1095 (1998).</li>
<li>Servant, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+minimal+phosphoacceptor+site+required+for+in+vivo+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+response+to+virus+and+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the minimal phosphoacceptor site required for in vivo activation of interferon regulatory factor 3 in response to virus and double-stranded RNA.</a> J Biol Chem. 278 (11), 9441-9447 (2003).</li>
<li>Bergstroem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+in+vivo+virus-targeted+phosphorylation+site+in+interferon+regulatory+factor-3+%28IRF3%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel in vivo virus-targeted phosphorylation site in interferon regulatory factor-3 (IRF3).</a> J Biol Chem. 285 (32), 24904-24914 (2010).</li>
<li>Takahasi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ser386+phosphorylation+of+transcription+factor+IRF-3+induces+dimerization+and+association+with+CBP%2Fp300+without+overall+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Ser386 phosphorylation of transcription factor IRF-3 induces dimerization and association with CBP/p300 without overall conformational change.</a> Genes Cells. 15 (8), 901-910 (2010).</li>
<li>Noyce, R. S., Collins, S. E., Mossman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modification+of+interferon+regulatory+factor+3+following+virus+particle+entry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential modification of interferon regulatory factor 3 following virus particle entry.</a> J Virol. 83 (9), 4013-4022 (2009).</li>
<li>McCoy, C. E., Carpenter, S., Palsson-McDermott, E. M., Gearing, L. J., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+inhibit+IRF3+phosphorylation+in+response+to+Toll-like+receptor-3+and+-4+by+targeting+TBK1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids inhibit IRF3 phosphorylation in response to Toll-like receptor-3 and -4 by targeting TBK1 activation.</a> J Biol Chem. 283 (21), 14277-14285 (2008).</li>
<li>Oliere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTLV-1+evades+type+I+interferon+antiviral+signaling+by+inducing+the+suppressor+of+cytokine+signaling+1+%28SOCS1%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HTLV-1 evades type I interferon antiviral signaling by inducing the suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1).</a> PLoS Pathog. 6 (11), e1001177(2010).</li>
<li>Kato, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+involvement+of+RIG-I+in+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response.</a> Immunity. 23 (1), 19-28 (2005).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>tenOever, B. R., Servant, M. J., Grandvaux, N., Lin, R., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+the+measles+virus+nucleocapsid+as+a+mechanism+of+IRF-3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recognition of the measles virus nucleocapsid as a mechanism of IRF-3 activation.</a> J Virol. 76 (8), 3659-3669 (2002).</li>
<li>Bibeau-Poirier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+I%7Bkappa%7DB+Kinase+%28IKK%29-Related+Kinases+Tank-Binding+Kinase+1%2FIKKi+and+Cullin-Based+Ubiquitin+Ligases+in+IFN+Regulatory+Factor-3+Degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of the I{kappa}B Kinase (IKK)-Related Kinases Tank-Binding Kinase 1/IKKi and Cullin-Based Ubiquitin Ligases in IFN Regulatory Factor-3 Degradation.</a> J Immunol. 177 (8), 5059-5067 (2006).</li>
<li>Grandvaux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Activation+of+Interferon+Regulatory+Factor+3+during+Infection+by+Paramyxoviruses+Requires+MDA5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Sustained Activation of Interferon Regulatory Factor 3 during Infection by Paramyxoviruses Requires MDA5.</a> J Innate Immun. 6 (5), 650-662 (2014).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרוטוקול אנו מתארים כאן מורכב משילוב של רזולוציה גבוהה SDS-PAGE וילידים-עמוד מצמידים את השימוש של כמה נוגדני phosphospecific להבחין I-IV monomeric / dimeric וphosphoforms של IRF3. גילוי נאות של מיני IRF3 אלה הוא חיוני לאפיון הפעלת IRF3 באופן מלא בהגדרה ספציפית. לדוגמא, גירוי LPS של מקרופאגים מופעלים מוביל להיווצרות של IRF3 phosphorylated dimeric, Ser396 / 398 המציגה hypophosphorylated (טופס השני), אבל לא hyperphosphorylated (טופס III ו- IV), דפוס בSDS-PAGE 15. באמצעות ...

<html> גורם השעתוק הביע כל מקום בגוף וconstitutively אינטרפרון פקטור תקינה 3 (IFN) (IRF3) הוא קריטי עבור קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות הגיוס של IFNβ, אלא גם באמצעות הגיוס של chemokine (מוטיב CC) יגנד 5 (CCL5 ) וכמה חלבונים אנטי כוללים חלבון הנוצר על-IFN עם tetratricopeptide חוזר IFIT1 / 2/3 1-3. הפעלת IRF3 דווחה הזיהום הבא עם וירוסים רבים, או חשיפה לחומצת polyinosinic-polycytidylic (פולי אני: C) או lipopolysaccharide (LPS) 4. חשוב לציין, הווירוסים הנחקרים ביותר התפתחו מנגנונים להתחמק התגובה בתיווך IRF3, ובכך להימלט מארח ההגנה חיסונית מולדת 5. לפיכך, ניטור הפעלת IRF3 הוא בעל חשיבות רבה להבנת המנגנונים המולקולריים של ההגנה אנטי המארח המולדת, אלא גם לזהות את האסטרטגיה בשימוש על ידי וירוסים כדי לנטרל את התגובה הזאת. אף אוזן גרון &quot;&gt; דיווחים שפורסמו רבים זאת לספק ניתוח מוגבל של הפעלת IRF3 מבוצעת על ידי הניטור של אינדוקציה גן IRF3-היעד (IFNB1 וIFIT1) ו / או assay גן הכתב בלוציפראז מצמידים ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן ברזולוציה נמוך (SDS- עמוד) ניתוח של IRF3. עם זאת, מחקרים ביוכימיים רבים, ניתוח של ההתנהגות של מוטציות IRF3 שונות והבהרה של מבנה הגבישי IRF3 6-11 תרמו להקמת IRF3 שהוא נתון למערכת מורכבת של שינויים לאחר translational רציפים על ידי זרחון ב אתרים מרובים. הקבוצה של זירחון המעורב בהפעלת IRF3 מופיע להיות תלוי בגירוי וסביר להניח בסוג התא. בתאים נגוע, IRF3 מתקיים כמינים לא-פוספורילציה וhypophosphorylated מכילים phosphoresidues, כולל Thr135 וSer173, ב1 אזור -198 aa N-מסוף 6,12-14. הצטברות של f hypophosphorylated זהORM של IRF3 מושרה על ידי מעוררי מתח, גורמי גדילה וסוכנים הפוגע ב- DNA 6. זירחון של שאריות Ser / Thr באזור C-terminal של IRF3 מכיל תחום transactivation מופעל לאחר הפעלה על ידי וירוסים, פולי אני: C או LPS בתא מסוג אופן תלוי 15-17. זירחון C-מסוף של IRF3 כרוך לא פחות מ -7 אתרי phosphoacceptor שונים מאורגנים בשני אשכולות עיקריים, Ser385 / Ser386 וSer396 / Ser398 / Ser402 / Thr404 / Ser405, שכל אחד יתרום להפעלת IRF3 דרך dimerization, הצטברות גרעינית, בשיתוף עם CREB חלבון -binding (CBP) / coactivators P300, DNA מחייב IFN אלמנט תגובה רגיש (ISRE) רצפי קונסנסוס וtransactivation של גני המטרה 9,10,17-19. זירחון של Thr390 הוא חשב גם לתרום להפעלת IRF3 המושרית-וירוס 20. ספקטרומטר מסת מנתח של IRF3 הוכיח כי שאריות Ser386, Thr390, Ser396 וSer402 ישירות phosphorylatאד על ידי מעכבי קינאז של ε κB (IKKε) / קינאז מחייב טנקי 1 (TBK1) קינאז 9,10. זירחון בשאריות C-המסוף נדרש גם להפסקת הפעלת IRF3 דרך polyubiquitination והשפלה בתיווך פרוטאזום 10. תהליך זה תלוי גם בזירחון בSer339, אשר הכרחי לגיוס של isomerase propyl PIN1 10,11. מיני IRF3 מכילים לפחות phospho-Ser339 / 386/396 שאריות נחשבים צורות hyperphosphorylated. הרצף והתפקוד המדויק של כל אתר נשאר עניין של דיון 10,21. עכשיו זה ברור שIRF3 הופעל אינו מייצג מדינה הומוגנית, אבל שמינים שונים מופעלים מציגים מאפייני זרחון או dimerization שונים קיימים 10,22. כדי לספק הבנה של הפעלת IRF3 שלמה בתגובה לפתוגנים ספציפיים, זה כך צורך CHaracterize שמהמינים מופעלים מושרים. אינדוקציה של גני מטרת IRF3, IFNB1 וIFIT1, הוכיחה לספק קריאה מתוך אמינה להפעלת IRF3. עם זאת, ניטור ביטוי של גנים אלה אינם מבחינים בין מדינות הפעלה השונות של IRF3. ניתוח מקיף של מדינות הפעלת IRF3 בהגדרה מסוימת מסתמך על האפיון מפורט של זירחון וdimerization מעמדו 10. Unphosphorylated (אני צורה), hypophosphorylated (טופס השני) וhyperphosphorylated (צורות III ו- IV) צורות IRF3 6,18,23 ניתן לפתור בהצלחה על ידי ניידות מופחתת בניתוח SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה. מיני IRF3 monomeric וdimeric ניתן לזהות ביעילות על ידי ניתוח ילידים-עמוד. גישות אלה השתפרו מאוד כאשר משתמשים בשילוב עם נוגדני phosphospecific המכוונים נגד אתרי phosphoacceptor IRF3 מובחנים. פרוטוקולים סטנדרטיים מאפשרים רזולוציה נמוכה שלחלבונים שאינו מאפשרים הפרדה יעילה של צורות phosphorylated IRF3 המובחנת. כאן, אנו מתארים בפירוט הליך כדי להשיג את הרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לפקח על הגיוס של מיני IRF3 שונים המופעל באמצעות וירוס SDS-PAGE מצמידים את ילידים-עמוד בשילוב עם immunoblot באמצעות נוגדנים כולל וphosphospecific. אפליה בvivo בין שונה מופעל צורות של IRF3 מתבצעת על בסיס משמרות הניידות שלהם נצפו על SDS-PAGE. בנוסף, מונומר IRF3 ודימר ניתן להבחין על ידי אלקטרופורזה denaturing שאינו. השילוב של שתי טכניקות משלימות אלה עם immunoblot מוכיח להיות גישה סביר ורגישה לרכוש את כל המידע הדרוש לניתוח של הפעלה בתיווך זירחון של IRF3 מלא.

<table><tbody><tr><td>F12/Ham</td><td>Life Technologies</td><td>11765-054</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבטיה לפני השימוש.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td>לתרבית תאים.</td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>וירוס סנדאי זן קנטל</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר</td><td>600503</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Bioshop</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Bioshop</td><td>SOD001.5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>ביושופ</td><td>GLY001.1</td><td>חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא עבה מאוד.</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7771</td><td>סימן מסחרי רשום המתאים לחומר ניקוי אוקטילפנוקסי פולי (אתילנאוקסי) אתנול (Nonidet P-40)</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bioshop</td><td>LEU001</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bioshop</td><td>APR600.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>201154</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט</td><td>MP ביומדיקל</td><td>159664</td><td>הפעלת נתרן אורתוואנדאט 0.2 מ': 1) הזן את ה-pH ל-10.0 באמצעות 1 N NaOH או 1 N HCl. ה-pH ההתחלתי של תמיסת הנתרן אורתוטוונדאט עשוי להשתנות עם הרבה כימיקלים. 2) התמיסה צהובה ב-pH 10.0. 3) מרתיחים עד חסר צבע. 4) מצננים ל-RT. 5) מכווצים מחדש את ה-pH ל-10.0 וחוזרים על שלבים 3-4 עד שהתמיסה נשארת חסרת צבע ומתייצבת על 10.0. אחסן את הנתרן אורתובנאדט המופעל בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>p-ניטרופניל פוספט, דיסודיום מלח הקסהידרט</td>, <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1585</td><td></td></tr>, <tr><td>בטא-גליצרופוספט</td>, <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G6376&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מגיב לבדיקת חלבון Bio-Rad&nbsp;</td><td>ביו-רד</td><td>500-0006&nbsp;</td><td>ציטוטוקסי</td></tr><tr><td>אקרילאמיד/ביס-אקרילאמיד (37.5 : 1) 40%</td> <td>Bioshop</td><td>ACR005&nbsp;</td><td>ציטוטוקסי</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Bioshop</td><td>DEO701</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>LabChem</td><td>LC15320-4&nbsp;</td><td>עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל ומגרה.</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>ביושופ</td><td>SDS001.1&nbsp;</td><td>מרגיז.</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td>רעיל ומגרה.</td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M6250</td><td>עבוד מתחת למכסה המנוע. רעיל למערכת העצבים, ריריות. עלול להיות רעיל לדרכי הנשימה העליונות, לעיניים ולמערכת העצבים המרכזית.</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>ביושופ</td><td>GLN001.5</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' D6750</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>ביושופ</td><td>SHY700&nbsp;</td><td>מרגיז.</td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוזה (0.45 מ"מ)</td> <td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Bioshop</td><td>ACE222.4</td><td>עבודה מתחת למכסה המנוע. רעיל, מגרה ודליק.</td></tr><tr><td>פונסו אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911&nbsp;</td><td>להרכב PBS עבור אימונובלוט.</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Bioshop</td><td>SPD307.5</td><td>להרכב PBS עבור אימונובלוט.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662&nbsp;</td><td>להרכב PBS עבור אימונובלוט.</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>להרכב PBS-T-BSA לאימונובלוט.</td></tr><tr><td>חלב יבש ללא שומן</td><td>ציפורן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פולי סורבט 20 (טווין)</td><td>MP ביומדיקל</td><td>103168</td><td>חותכים את קצה הקצה והפיפט לאט מכיוון שהוא סמיך מאוד.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser386</td><td>IBL-America</td><td>18783</td><td>חנות מצוטטת ב -20 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser396</td><td>תוצרת בית19</td><td></td><td>Store מצוטט ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.</td></tr><tr><td>Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4947s</td><td>חנות ב-20 oC.</td></tr><tr><td>Anti-IRF-3-P-Ser398</td><td>תוצרת בית15</td><td></td><td>Store נקוב ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.</td></tr><tr><td>אנטי-IRF-3</td><td>מוטיב אקטיף</td><td>באורך מלא 39033</td><td>חנות מצוטטת ב-80 oC. הימנע מהקפאה/הפשרה.</td></tr><tr><td>חנות Anti-IRF3-NES</td><td>IBL-America</td><td>18781</td><td>מצוטטת ב-20 oC.</td></tr><tr><td>Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus</td><td>Perkin-Elmer Life Sciences</td><td>NEL104001EA</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מצלמת CCD LAS4000mini תקני</td> משקל מולקולרי <td>של GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE, Broad Range</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0317</td><td>Store מצוטט ב -20 oC.</td></tr></tbody></table>

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של irf3

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

גורם השעתוק IRF3 הוא קריטי לקו ההגנה הראשון מפני פתוגנים בעיקר באמצעות β אינטרפרון וביטוי גנים אנטי-ויראלי. ניתוח מפורט של הפעלת IRF3 חיוני כדי להבין כיצד פתוגנים גורמים או מתחמקים מהתגובה האנטי-ויראלית המולדת. ניתן להבחין בין צורות מופעלות מובחנות של IRF3 על סמך הזרחן ומצב המונומר לעומת הדימר שלהן. ניתן להשיג אפליה in vivo בין המינים המופעלים השונים של IRF3 באמצעות הפרדה של צורות זרחניות IRF3 על סמך שינויי הניידות שלהם ב-SDS-PAGE. בנוסף, ניתן לנטר את רמות המונומר והדימר IRF3 באמצעות אלקטרופורזה שאינה דנטוריזה. כאן, אנו מפרטים נוהל כדי להגיע לרזולוציה הגבוהה ביותר כדי לקבל את מירב המידע לגבי מצב ההפעלה של IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-PAGE מקורי בשילוב עם אימונובלוט באמצעות מספר נוגדנים טוטאליים ופוספוספציפיים. אסטרטגיה ניסיונית זו מהווה גישה משתלמת ורגישה לרכישת כל המידע הדרוש לניתוח מלא של ההפעלה בתיווך זרחון של IRF3.

איור 2 מציג תמונת immunoblot טיפוסית של IRF3 המזוהה עם נוגדני IRF3 כולל ונוגדני IRF3-phosphospecific נגד Ser396 וSer398 לאחר ההחלטה של WCE ידי רזולוציה גבוהה SDS-PAGE. בתאי A549 unstimulated, IRF3 מזוהה כשתי להקות בגיל 50 ו -53 kDa על SDS-PAGE המתאים (אני טופס)-phosphorylated אינו וhypophosphorylated (הטופס השני) מינים של IRF3. חשיפה של תאי A549 לsev ל3-9 שעות בתוצאות שינוי תלוי זמן להעברה לאט צורות hyperphosphorylated III ו- IV, ש...

כאן אנו מתארים הליך המאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. זה מושג באמצעות שילוב של SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה ו-native-PAGE בשילוב עם אימונובלוט באמצעות נוגדנים מרובים של פוספו-ספציפיות.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח מפורט של ההפעלה התלויה בזרחון של גורם השעתוק IRF3. לכן שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לתגובה החיסונית המולדת המתווכת אינטרפרון. כגון פתוגן מפעיל או פולש לביטוי בטא של אינטרפרון תלוי IRF3.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה גישה משתלמת ורגישה להבחין בין הצורה המופעלת השונה של IRF3 שעלולה להיווצר בעקבות גירויים שונים. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי זיהום וירוסים של תאים אנושיים, ניתן ליישם אותה גם על רקמות עכבר או אדם הנתונים לפתוגנים אחרים או לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגנים. ידגימו את ההליך אלכסה רוביטייל ומליסה מריאני, שתי מומחיות Simulink תאים מהמעבדה שלי.תאי A549 המשמשים בהליך זה נשמרים בתרבית בצלחת של 15 סנטימטר ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני במדיום F-12K Ham שלם. עשרים וארבע שעות לפני ההדבקה, נסו את התאים כמתואר בטקסט הפרוטוקול והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה בטמפרטורה של 350 x G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בשמונה מיליליטר של מדיום F-12K Ham שלם כדי לקבל תרחיף הומוגני של תא בודד. לאחר ספירת התאים באמצעות המוקטיומטר, זרעו את התאים בצפיפות של אחד כפול עשירית עד שישית תאים לכל צלחת של 60 מילימטר, וארבעה מיליליטר של מדיום F-12K Ham שלם שחומם מראש. דגירה במשך 20 עד 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני.לאחר 20 עד 24 שעות התאים צריכים ליצור שכבה חד-שכבתית של 90%. הסר את המדיום ושטוף את התאים עם שני מיליליטר מדיום F-12K Ham ללא סרום, או SFM. הוסף שני מיליליטר SFM טרי לכל צלחת של 60 מילימטר.יש לדלל לכמות מופשרת של נגיף סנדאי ב-SFM שחומם מראש כדי לקבל 60 יחידות המגלוטינציה, או HAU, לכל 100 מיקרוליטר. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה בעדינות, ולאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטר של נגיף מדולל טיפה אחר טיפה לכל צלחת כדי לבצע את ההדבקה ב-40 HAU לכל 10 עד התאים השישיים. אין להוסיף וירוס בלוחית הבקרה הלא נגועה.דגרו על התאים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזים פחמן דו חמצני. במהלך השעה הראשונה של ההדבקה, ערבבו את הצלחות ביד שלוש או ארבע פעמים. שעתיים לאחר ההדבקה יש להוסיף שני מיליליטר של מדיום F-12K Ham המכיל 20% חום ו-FDS מופעל, כדי לקבל ריכוז סופי של 10% חום ו-FDS מופעל.דגרו על התאים באינקובטור למשך שעה, ארבע ושבע שעות נוספות כדי להגיע לזמני הדבקה כוללים של שלוש, שש ותשע שעות בהתאמה. תאים ייקצרו בכל אחת מנקודות הזמן הללו להכנת תמציות תאים שלמים כפי שמודגם בקטע הווידיאו הבא. התחל הליך זה על ידי הסרת מדיום הזיהום.קצרו את התאים על ידי גירוד מיליליטר אחד של DPBS קר כקרח. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה מקורר מראש של 1.5 מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב-16,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות.ולנקות בזהירות את כל עקבות ה-DPBS. השעו מחדש את גלולת התא ב-70 מיקרוליטר של מאגר ליזה. דגירה על קרח למשך 20 דקות.הקפיא את הליזאט על ידי דגירה באמבט חנקן נוזלי למשך 15 שניות. לאחר מכן מפשירים את הליזאט בטמפרטורת החדר עד שהוא נמס לחלוטין. מערבולת למשך עשר שניות.חזור על מחזור הקפאה-הפשרה-מערבולת שלוש פעמים. צנטריפוגה ב 16, 000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו את הסופרנטנט, שהוא תמצית התא כולו, לצינור צנטריפוגה חדש מקורר מראש של 1.5 מיליליטר.חשוב לשמור את כל תמציות התאים על קרח כל הזמן. כדי לפתור את כל תמציות התאים על ידי SDS-PAGE ברזולוציה גבוהה, הכינו שלושה ג'לים לאלקטרופורזה לדנטורציה, שני ג'לים של 16 סנטימטר לזיהוי צורות IRF3 וג'ל אחד של 8.5 סנטימטר לזיהוי חלבוני נגיף סנדאי. טען 14 מיקרוליטר של תקן משקל מולקולרי בבאר אחת מכל ג'ל 16 סנטימטר.לאחר מכן טען 30 מיקרוגרם של תמצית תאים שלמים מפורקת, לכל באר של שני הג'לים של 16 סנטימטר. טען שבעה מיקרוליטרים של תקן משקל מולקולרי בבאר אחת של הג'ל 8.5 סנטימטר. טען שמונה עד עשרה מיקרוגרם של תמצית תאים שלמים מפורקת, לכל באר של הג'ל בגודל 8.5 סנטימטר.הפעל את הג'לים בזרם קבוע של 30 מיליאמפר עד שחזית הנדידה מגיעה לתחתית הג'ל. מבחינה טכנית, הנדידה נמשכת כשלוש שעות עבור ג'ל של 16 סנטימטרים, ו-45 דקות עבור ג'ל של 8.5 סנטימטרים. התחל בניתוח זה על ידי הכנת ג'ל ממיס שאינו דנטורציה באורך של 8.5 סנטימטרים לפחות, בהתאם להליך בטקסט הפרוטוקול.לחץ את המנגנון הרץ לקרח בערך עד לגובה מאגר האלקטרופורזה של החדר התחתון, אך וודא שהג'ל אינו בקרח. הפעל מראש את הג'ל בזרם קבוע של 40 מיליאמפר למשך 30 דקות על קרח. במהלך הריצה המוקדמת, ערבבו את כל תמציות התאים שנשמרו על קרח אחד לאחד עם מאגר הטעינה של Two-X Native-PAGE.מיד בתום הריצה המוקדמת, טען שמונה עד עשרה מיקרוגרם של תמצית תאים שלמים על הג'ל. חשוב להעמיס את הדגימות קרוב לתחתית הבאר כדי שהרצועות לא יופרעו. הפעל את הג'ל בזרם קבוע של 25 מיליאמפר על הקרח כפי שהודגם להפעלה המוקדמת עד שחזית הנדידה מגיעה לתחתית הג'ל.זה ייקח בערך 40 דקות. בסיום כל ריצות הג'ל, החלבונים מועברים לממברנות ניטרו-תאית ומתקבעים. הליך ההעברה מתואר בטקסט הפרוטוקול הנלווה.שלושת ממברנות SDS-PAGE, אך לא ממברנת Native-PAGE, מוכתמות בתמיסת Ponceau אדומה כדי לזהות את סמני המשקל המולקולרי. לאחר דגירה של כל ארבעת הממברנות מ-SDS-PAGE ו-Native-PAGE בתמיסה חוסמת, דגרו את הממברנות עם הנוגדנים העיקריים לפי הסדר הרציף המוצג בתרשים זה. הממברנות חייבות לעבור חמש שטיפות של חמש דקות ב-PBS-T לפני הדגירה עם הנוגדנים המשניים המצומדים המתאימים של חזרת פרוקסידאז.לאחר הסרת עקבות של טווין עם PBS, דגרו את הממברנות למשך דקה אחת בנפח של מגיב כימילומינסנציה משופר המספיק כדי לכסות את הממברנות במלואן. השתמש בנייר סינון כדי לייבש את הממברנות ולאחר מכן הנח אותן במנתח התמונה הזוהר כדי לדמיין את הרצועות התגובתיות החיסונית. לפני הדגירה עם הנוגדנים הראשוניים הבאים, שטפו את הממברנות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בכל פעם.כאשר נדרשת הפשטה בין נוגדנים, דגרו את הממברנות בתמיסת הפשטה מחוממת מראש ב-50 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בערבוב רגיל. פרטים על ניתוח הכתמים החיסוניים ניתן למצוא בטקסט הפרוטוקול הנלווה. מוצגת כאן תמונה טיפוסית של כתם חיסוני של IRF3 שזוהתה עם נוגדנים כוללים IRF3 ונוגדנים זרחניים IRF3 כנגד Ser396 ו-Ser398, לאחר רזולוציה גבוהה של תמציות תאים שלמים.בתאים לא מגורים, IRF3 מזוהה כשתי רצועות המתאימות למין הלא-זרחני, ולמין ההיפופוספוריל של IRF3. חשיפת תאים לנגיף סנדאי גורמת למעבר תלוי זמן לצורות היפר-זרחניות הנודדות באיטיות שלוש וארבע, שגם הן מזוהות באופן ספציפי באמצעות נוגדנים ספציפיים לפוספו-ספציפי כנגד Ser396 ו-Ser398. האיור הבא מציג פרופיל של זיהוי IRF3 המתקבל מתמציות תאים שלמים שנפתרו על ידי PAGE מקורי, ואחריו אימונובלוט באמצעות נוגדנים נגד IRF3 NES, ונוגדנים ספציפיים לזרחן נגד Ser386.בתאים לא מגורים, IRF3 מזוהה כרצועה אחת המתאימה לצורה המומרית. עם הדבקה בנגיף סנדאי, רמות המונומר IRF3 יורדות עם הצטברות נלווית של פס נודד לאט התואם את הצורה הדימרית של IRF3, שגם היא מזוהה באופן ספציפי באמצעות נוגדנים פוספו-ספציפיים כנגד Ser386. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שההרכב והאורך של הג'לים השונים הם קריטיים להשגת רזולוציה מתאימה של הפוספופורמים IRF3.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו קשירת DNA או חומצות מדווחות גנים על מנת להעריך את פעילות IRF3. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד להבחין בין הצורות הפעילות השונות של IRF3. אל תשכח שעבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ויש לבצע מניפולציות בהתאם להנחיות הבטיחות הביולוגית של המוסד המארח שלך.

a-high-resolution-method-to-monitor-phosphorylation-dependent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

סרטון זה מדגים טכניקת כימות רגישה של זרחן חלבונים באמצעות בדיקה של מולקולה אחת הנפתחת כלפי מטה. הפונקציונליות של פוליאתילן גליקול-ביוטין והשימוש בנוגדנים מסומנים מגבירה את הזיהוי של טירוזין פוספורילציה עם ספציפיות.

בדיקת משיכה של מולקולה יחידה לניתוח זרחן חלבונים: טכניקת תפוקה גבוהה לכימות זרחן חלבונים בליזט התא

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

המחקר הנוכחי מתאר שיטה פשוטה של גילוי רמות אנדוגני של זרחון Rab10 על ידי לאוצין-עשיר אני חוזר קינאז 2.

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

שיטת כתמי האבן המערבית המקומית לניתוח מקדם אינטרפרון הרגולציה האנדוגניים מהווה 5 דימרזציה בשורת התא הדנדריאיד של CAL-1 מתוארת. ניתן להחיל פרוטוקול זה גם על קווי תאים אחרים.

מקורי פוליאקרילאמיד ג'ל לטיפול חיסוני כתמי באנליזה של אנדודוגני IRF5 דימרזציה

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

ההפעלה של סר/ת'ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.

בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנת דגימה וניתוח נתונים לכימות זרחון חלבונים באמצעות מבחן משיכה משופר של מולקולה בודדת כלפי מטה (SiMPull).

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

למדו שיטת רזולוציה גבוהה לניתוח הפעלת IRF3 תלוית-זירחון באמצעות SDS-PAGE ו-Native-PAGE עם נוגדנים פוספו-ספציפיים. טכניקה זו מאפשרת הבחנה בין צורות מופעלות שונות של גורם השעתוק IRF3 בתגובת החיסון המולדת.

רזולוציה גבוהה שיטה למעקב אחר הפעלת זירחון תלויה של IRF3

גלה סרטונים נוספים