RNAi טריגר משלוח לתוך

המטרה הכללית של שיטה זו היא הובלת טריגרים של RNA interference ב-Anopheles gambiae כדי להוביל להשתקת גנים (gene knockdowns) המתחילה במהלך שלב הגולם של ההתפתחות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הווקטורים ולחשוף גנים הממלאים תפקיד במהלך שלבי התפתחות טרום-בגירה או שלבי בגרות מוקדמים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת לחוקרים הזדמנות לבצע מחקרים גנומיים תפקודיים מהירים, תוך התחלת השתקת הגנים במהלך המרווח ההתפתחותי של שלב הגולם, שבו פרוטוקולים של הזרקת RNA interference לא יושמו בעבר.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי ההזרקה עשויים להיות קשים לשליטה בשל הדיוק הנדרש והאופי הרגיש של הבובאות בשלב התפתחותי זה. לאחר בחירת הגן המבוקש, זהו אזור של 200 עד 800 זוגות בסיסים שצפוי שלא יגרום להשפעות לא רצויות (off target effects), ובצע הגברה בשיטת PCR סטנדרטית כדי להשיג תבנית לסנתזה של RNA דו-גדילי המוקפת ברצף פרומוטור של T7. לאחר מכן, סנתז את ה-RNA הדו-גדילי ונקה את התוצרים באמצעות ערכה מסחרית לביצוע in vitro.

כווננו את ריכוז ה-RNA הסופי לשלושה מיקרוגרם למיקרוליטר. לאחר מכן, השתמשו בג'ל agarose סטנדרטי בריכוז 2% כדי להשוות חצי מיקרוליטר של ה-RNA דו-גדילי עם ה-DNA התבנית וסממנים סטנדרטיים. עם סיום ההרצה, בדקו את איכות ואורך פס ה-RNA דו-גדילי.

אין להראות תוצרים לא ספציפיים. ה-RNA דו-גדילי ינדוד לאט יותר מה-DNA התבנית. לצורך אחסון, הכין מנות (aliquots) של RNA דו-גדילי, ושמור אותן בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

התחילו בהכנת צבע ה-Fast Green FCF. ראשית, דללו את הצבע לריכוז של 0.1% נפח לנפח במים נקיים מ-RNase. לאחר מכן, העבירו נפחים של מיקרוליטר אחד מהתמיכה שהוכן לפרועות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

חממו את המבחנות הטעונות בטמפרטורה של 65 °C למשך כשלוש שעות כדי לאדות את המים. לאחר מכן, קררו את המבחנות למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש במוצקי הצבע. בשלב הבא, הכינו מחטי הזרקה מזכוכית משוכה משפופרות זכוכית בורוסיליקט.

כוון את שובך המשיכה של המחט לקוטר קצה של 10 עד 30 מיקרון. עבור שובך קפילרי של NARISHIGE, כוון את המחמם הראשון ל-100 ואת המחמם השני ל-70. לאחר מכן, קבע את המחט הקפילרית בתפסן והמשך בתהליך המשיכה.

כעת, הכינו את תחנת ההזרקה. בחרו פלטפורמה שניתן להזיזה בקלות תחת המיקרוסקופ. על הפלטפורמה, הדביקו תחילה בעזרת סרט דבק נייר סינון עבה.

לאחר מכן, הדביקו בעזרת סרט דביק נייר סינון דק אחד על גבי נייר הסינון העבה. בשלב הבא, הוסיפו למבחנות צבע המוצק 10 µL מכל RNA דו-גדילי המיועד להזרקה, ותלה את הצבע. שמרו מבחנות אלו על קרח.

כעת, אספו את הגלגולים להזרקה. מלאו צלחת פטרי בניצב של 60 מילימטר ב-10 מיליליטר של מים דה-יונזיים (deionized water), והעבירו כ-50 גלגולים בעלי צבע בהיר אל הצלחת, באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק. השתמשו אך ורק בגלגולים בעלי פיגמנטציה קלה, שכן גלגולים שכבר הגיעו לרמות השחמה בינוניות עד כהות יסבלו מנזק לקוטיקולה, ושיעורי ההישרדות שלהם יהיו נמוכים.

השלב הראשון במיקרו-הזרקה הוא פתיחת המחט. תחת המיקרוסקופ, שברו את הקצה הדיסטלי ביותר של המחט באמצעות פינצטה עדינה. לאחר מכן, מלאו את המחט בשמן מינרלי באמצעות מזרק ומחט בכילוי (gauge) 30.

לאחר המילוי, הוצא את עודפי השמן באמצעות המיקרו-מזרק. הגדר את המיקרו-מזרק לשאיבת נפחים של 69 nanoliter. לאחר מכן, מלא את קצה המחט ב-RNA להזרקה שהוכן.

בדקו את חלוקת ה-double-stranded RNA כדי לוודא שאין תקלות. חסימה בקצה הטיפ ומחטים שאינן מקובעות כראוי הם מקורות התקלות העיקריים. לאחר שהמזרק מוכן, בחרו אחת עד שלוש בובות והעבירו אותן לשלב של נייר הסינון.

בעזרת מכחול, כוון את הגולם כך שהקוטיקולה הגבנית (dorsal cuticle) תהיה נגישה. לחיצה על הנייר תספוג את עודפי המים מהגולמים. תוך קיבוע הגולם בעזרת מכחול רטוב, השתמש בתנועה מקדימה לאחור כדי להחדיר את המחט אל תוך הקוטיקולה הגבנית שלו, בין הבטן לחזה, בזווית של כ-30 מעלות.

לאחר מכן, הזרקו פולס אחד עד שניים של RNA דו-גדילי לתוך ההמולימפה. פיזור הצבע ברחבי הגוף אמור להיות נראה לעין אם ההזרקה הצליחה. במהלך ההזרקה לגולם, קריטי שהמחט תנקב אך ורק את הקוטיקולה הגבית.

אם דקיקת המחט חודרת דרך הקוטיקולה הגחונית, הצטברות של נוזל מסומן בצבע תהיה ניכרת בחלק החיצוני של הגולם, או שהצבע יעבור לנייר המסנן. במקרים אלו, יש להשליך את הגולם. אם הצבע אינו מתפזר ברחבי ההמולימפה, סביר להניח שקצה המחט חסום.

הזז את הראש מעט וקבע אם התרחש שחרור של RNA וצבע. אם אין אינדיקציה לשחרור של צבע, השליך את הגולה. לאחר מכן, העריך את ראש המחט ובצע הזרקה נוספת בגולה חדשה.

לאחר הזרקה מוצלחת של בובה, השתמשו במברשת צבע רטובה כדי לשחרר אותה בעדינות מהמחט, והעבירו אותה לצלוחית עם מים שבה היא תשלים את התפתחותה. הניחו את צלוחית הבובות המוזרקות בתוך כלוב פיתוחי או מיכל ליתושים בתנאי גידול רגילים. כמקור מזון לבוגרים, ספקו גלוקוז בתמיסה של 10% weight by volume שספוגה בכדור צמר.

לאחר שהבוגרים בקעו, השווה אותם לקבוצות הביקורת. לדוגמה, יש לבחון מדי יום חרקים עם SRPN2 דו-גדילי כדי לזהות היווצרות של פסאודו-גידולים. לצורך כך, קרר את הבוגרים למשך שתי עד שלוש דקות בטמפרטורה של 20- °C, והעבר אותם לפלטה קרה בטמפרטורה של 2 °C לצורך תצפית.

לאחר בחינת הבוגרים, החזירו אותם לאזור הגידול במחסום החרקים. לאחר שליטה בטכניקה, בופאות שהוזרקו בקעו בתדירות של כ-70%. בתת-קבוצה של הבופאות שהוזרקו, התרחשה בקעה חלקית מתוך נורית הבופה, שהובילה ליתושים שאינם ברי-הישרדות. לא נצפה עיכוב בשיעורי הבקיעה בין היתושים שהוזרקו לאלו שלא הוזרקו, והשפעות ההזרקה לא השתנו לפי מין.

עשרה ימים לאחר הבקיעה, לא נצפה שינוי ניכר בשיעור ההישרדות של היתושים שהוזרקו בהשוואה לבקרי הביקורה שלא הוזרקו. מעכב סרין פרוטאיז, SRPN2, שימש כביקורת חיובית, ו-LacZ דו-גדילי שימש כביקורת שלילית להזרקות של RNA דו-גדילי. שלושה ימים לאחר הבקיעה, פסאודו-גידולים בבוגרים שהוזרקו SRPN2 דו-גדילי היו גלויים באמצעות מיקרוסקופיה של אור.

לאחר שמונה ימים, פסאודו-גידולים (pseudotumors) היו בולטים מאוד. ביתושים בשלב בוגר, ניתן היה להבחין בפסאודו-גידולים מלנוטיים דרך הקוטיקולה של מרבית החיות שהוזרקו להן SRPN2 דו-גדילי, בעוד שבביקורות לא נצפו פסאודו-גידולים. חמישה ימים לאחר ההזרקה, רמות חלבון SRPN2 היו נמוכות משמעותית ביתושים שהוזרקו להם SRPN2 דו-גדילי, בהשוואה לביקורות שהוזרקו להן LacZ דו-גדילי ולביקורות שלא הוזרקו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הובלת טריגר להשתקת RNA (RNA interference) לתוך בובנאות של Anopheles gambiae, באמצעות פרוטוקול ההזרקה שפותח לאחרונה. בדרך כלל, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו יתקשרו בשל התנועה הבלתי צפויה של הבובנאית. עם זאת, תרגול של המיקום הנכון וייצוב הבובנאית משפרים במידה ניכרת את שיעור ההזרקות המוצלחות, כמו גם את איכות ההזרקה.

לאחר השליטה בטכניקה, הזרקות אלו דורשות כ-30 שניות לכל בובנאי. באמצעות פיתוח טכניקה זו, סללנו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של הווקטורים לחקור ולהעריך תפקוד גנים במהלך שלבי התפתחות טרום-בוגרים ובוגרים מוקדמים בווקטור המלריה Anopheles gambiae. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אנליזת Western blot או quantitative PCR כדי לקבוע את מידת השתיקה (knockdown) של הגן המטרה ברמת ביטוי החלבון או התמלול, בהתאמה.

בסופו של דבר, טכניקה זו יכולה לסייע בזיהוי גנים הקריטיים להעברת טפילים על ידי יתושים, וגישה זו תסייע לנו לזהות מטרות חדשות ולספק תובנות חדשות לגבי האופן שבו נוכל ליצור אסטרטגיות יעילות יותר לבקרת וקטורים.