הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן במבחנה

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את השינוי היחסי התלוי במינון של תאי הגידול בתרבית המכילה גם תאים גידוליים וגם תאים שאינם גידולים. שיטה זו מספקת כלי מבוסס גנטיקה להערכת השפעת מבחנה וספציפיות של תרופות אנטי סרטניות. יש לו פוטנציאל יישום בגילוי תרופות ובטיפול מותאם אישית בסרטן.

היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שכאשר נבדקת תרופה אנטי סרטנית בתרבית המכילה גם תאים גידוליים וגם תאים שאינם גידוליים, ניתן להפריד את תגובת תאי הגידול מזו של התאים שאינם גידולים. מי שתדגים את ההליך הזה תהיה אינה, טכנאית מהמעבדה שלי. התחל הליך זה על ידי תרבית תאי גידול ופיברובלסטים במדיום DMA סטנדרטי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני בן לילה.

בתת-מפגש, קצרו את התאים עם 0.05% טריפסין וספרו אותם באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, ערבבו 400 תאי גידול ו-1,600 תאים שאינם גידולים יחד בכל באר של צלחת תרבית של 96 בארות עם 0.2 מ"ל של מדיום והקימו ארבעה שכפולים לכל ריכוז תרופה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך הלילה.

לאחר מכן, הכינו את תמיסות המלאי של נילוטיניב ב-DMSO ב-0, 2, 4 ו -20 מ"מ. לדלל כל אחד מהם פי 200 ב-5 מ"ל של מדיום DMA תוך מתן תמיסות תרופות מרוכזות פי שניים של 0, 10, 20 ו-100 uM. לאחר מכן, הסר 0.1 מ"ל מהמדיום מכל באר.

הוסף 0.1 מ"ל של מדיום המכיל את התרופה והמשיך לדגור על התאים במשך חמישה ימים. בסיום הטיפול יש לבדוק את התאים המחוברים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פנים ולצלם תמונות. שאפו את המדיום ושטפו את תאי ההדבקה ששרדו פעם אחת עם 0.2 מ"ל PBS.

כדי ליז את התאים בשיטת HotSHOT, הוסף 50 uL של תמיסת ליזה אלקליין לכל באר. אוטמים את הבארות בנייר כסף. לאחר מכן דוגרים את הצלחת בחום של 95 מעלות צלזיוס בתנור או על צלחת חימום למשך 30 דקות.

לאחר 30 דקות, בדוק תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו עוד תאים שלמים על פני הבארות. במקרה שהתאים לא הגדילו לחלוטין את זמן החימום או הוסיפו חומר ניקוי. הקפאה פעם אחת ב-20 מעלות צלזיוס משפרת גם את שבירת התאים.

לאחר מכן, הוסף 50 uL של תמיסת הנטרול לכל באר ואז העביר את כל הליזטים לבארות U Form של צלחת PCR וייבש אותם במחזור PCR ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. לאחר מכן, הרכיבו מחדש את הליזטים עם 20 uL של מים מזוקקים. כדי להפיל DNA באמצעות דיאליזה טיפה, חלקו מסנן ממברנה בקוטר 25 מ"מ לארבעה אזורים ומספור את האזורים.

צף את המסננים על מים מזוקקים כשהצד המבריק כלפי מעלה בבאר של צלחת 12 בארות. לאחר מכן Hipot ה-20 uL שיחזר את הליזט בזהירות על המסנן. מכסים את הצלחת ומבצעים דיאליזה במשך 30 עד 60 דקות.

לאחר מכן יש לשאוב את המים מתחת לפילטר מבלי להפוך את המסנן או להפריע לטיפות. העבירו את טיפות הליזאט לבארות של צלחת PCR חדשה. לאחר מכן, יבשו את טיפות ה-DNA על ידי חימום הצלחת ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות במחזור PCR.

לאחר מכן הרכיבו מחדש את הליזטים ב -10 uL מים. לאחר מכן הכן את תערובת המאסטר להכיל את כל הרכיבים למעט DNA עבור תגובת ה-PCR הדיגיטלית של בדיקת הדו-קרב. מערבולת וסובב את תערובת המאסטר למשך 10 שניות בכוח מקסימלי בצנטריפוגה ומוציאים 15 uL מהתערובת בכל באר של צלחת 96 PCR.

הוסף את הליזט של כל דגימה לבארות המכילות את תערובת המאסטר. מעבירים 20 uL מכל תערובת תגובה לבאר בצד הדגימה של מחסנית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוצא 70 uL של שמן מחולל טיפות לכל באר בצד השמן של מחסנית.

סגור את המחסנית עם אטם והנח את כל ההגדרה בגנרטור טיפות לפני תחילת יצירת הטיפות. לאחר מכן העבירו 40 uL של תמיסת טיפות לכל באר של צלחת PCR של 96 בארות. אטום את הצלחת עם יריעת נייר כסף והנח את הצלחת במחזור PCR.

לאחר מכן, הגדר את טמפרטורת המכסה על 105 מעלות צלזיוס ואת קצב הרמפה על 2 מעלות צלזיוס לשנייה. בסיום, העבירו את הצלחת לקורא טיפות והתחילו לקרוא. לחלופין, אחסן את הצלחת בחום של 4 מעלות צלזיוס עד 24 שעות.

כעת טען את נתוני ה-PCR הדיגיטליים ובצע ניתוח אוטומטי. בדוק את הדגימות באופן ידני כדי לוודא שהטיפות החיוביות והשליליות מופרדות היטב. אל תכלול את הדגימות ללא הפרדה ברורה של טיפות חיוביות ושליליות מניתוח נוסף.

העתק את היחס המתקבל בין NF1 ל- RPP30 לגיליון Excel. לאחר מכן, חשב את שיעור תאי הגידול. עבור כל ריכוז תרופה, חשב את הממוצע וסטיית התקן מארבעת השכפולים ולאחר מכן שרטט את הממוצעים ואת סטיות התקן מול ריכוזי התרופות.

מוצגת כאן ההפחתה התלויה במינון של התאים החיוניים הנראים לעין. שיעור תאי הגידול שחושב מהיחס בין NF1 ל-RPP30 ירד בטווח של 0 עד 10 uM. במינון הגבוה ביותר של 50 uM נותרו מעט תאים חיוניים, ככל הנראה בגלל השפעה רעילה על כל התאים.

ניתן למדוד את הכדאיות וההתפשטות של סך התאים באמצעות מבחנים קונבנציונליים, אך ניתן לקבוע את שיעור תאי הגידול באמצעות ההליך שהודגם במחקר הנוכחי. באמצעות שני הפרמטרים ניתן לחלק את תגובת התא הכוללת לתרופה בתרבית מעורבת לתגובת תאי הגידול ותגובת התא הלא-גידולית. ניתן לבצע את כל הליך הבדיקה בשבוע אחד כולל תקופת הטיפול של חמישה ימים.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שהיחס בין גן המטרה לגן ההיפוך משתנה. אנו רואים טווח צר מאוד שהוא בין 0 ל-1 ולכן דיוק הוא חיוני. יש להפחית ככל האפשר את ההערכה בין הדגימות ובטיפול.

לאחר הליך זה ניתן להשתמש גם בתרביות ראשוניות המכילות גם תאי גידול וגם תאים שאינם גידולים כדי לבחון את ההשפעה והספציפיות של תרופות אנטי סרטניות. יתר על כן, ניתן להעריך באופן ספציפי את ההשפעה של תרופה על תת-אוכלוסייה מסוימת של תאים עם שינוי גנטי מוגדר. אני מקווה שהסרטון הזה יעזור לכם להבין כיצד להשתמש בתכונה גנטית כדי לקבוע את שיעור תאי הגידול בדגימה או בתרבית המכילה גם תאי גידול וגם תאים שאינם גידולים.