Name: הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: חקור הערכת ספציפיות של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרביות מעורבות של תאי גידול ופיברובלסטים. שיטה זו מאפשרת הפרדת תגובות התאים באמצעות PCR דיגיטלי לניתוח מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

גברת אלסטר, מר Honrath וד&quot;ר ג&#39;יאנג זוכים להערכה לקבלת סיוע טכני יוצא מן הכלל שלהם. כמו כן העריך ד&quot;ר Volz ואת קבוצת המחקר של ד&quot;ר Dandri למתן גישה למכשיר דיגיטלי PCR שלהם.

1. הכנת תרבות מיקס המכילה גם תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאים סרטניים מקו תא הוקם MPNST S462 5. השתמש פיברובלסטים כמו התאים שאינם סרטניים 6,7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים פיברובלסטים תרבות הן הגידול במדיום תקן DMEM עם 10% בסרום שור העובר (BSA), 3 גלוטמין מ&quot;מ, 0.1 מ&quot;מ 2-mercaptoethanol, 500 U / פניצילין מ&quot;ל, 500 גר &#39;/ מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין ו פירובט סודיום 1 מ&quot;מ ב 37 ° C ו -5% CO 2 5-7. At-מפגש משנה, למסוק את התאים עם טריפסין 0.05% ו לספור אותם באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 400 תאים סרטניים ו -1,600 תאים שאינם סרטניים יחד היטב בכל צלחת תרבות 96-היטב 0.2 מ&quot;ל בינוני. בהתחשב צמיחה מהירה יותר של תאים סרטניים לאורך תקופת הטיפול של 5 ימים, חלקם הראשוני של תאים סרטניים נקבע ל 25%. הגדרת 4 משכפל עבור כל ריכוז התרופה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 O / N. </li></ol> 2. דרוטיפול g <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש nilotinib כמו תרופת הבדיקה. הכינו פתרונות המניות של 0, 2, 4 ו -20 מ&quot;מ nilotinib ב DMSO. לדלל כל אחד מהם על ידי 200 של פי 5 מ&quot;ל DMEM בינוני, מתן פתרונות תרופתיים מרוכז פי 2 של 0, 10, 20 ו -100 מיקרומטר 6.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 0.1 מ&quot;ל בינוני מבאר כל ולהוסיף 0.1 מ&quot;ל של המכיל תרופה בינוני. הריכוזים הסופיים הם 0, 5, 10 ו -50 מיקרומטר. המשך דוגרי תאי תרופה המכילה בינונית במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הטיפול, לבדוק התאים המצורפים באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד ולצלם. לשאוב את המדיום משם, לשטוף את התאים דבקים שרד פעם עם 0.2 מיליליטר PBS. </li></ol> 3. הכנת DNA עבור PCR הדיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים באמצעות מאצ 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl פתרון תמוגה אלקליין (25 מ&quot;מ NaOH, 0.2 mM EDTA) זה טוב. חותם את הבארות עם רדיד. דגירה את הצלחת על 95 מעלות צלזיוס בתנור או על צלחת חימום למשך 30 דקות. בדוק תחת microscope לוודא שאף תאים שלמים יותר נשארים על פני השטח של הבארות. במקרה התאים לא lyse לחלוטין, להגדיל את זמן החימום או להוסיף חומר ניקוי. להקפיא אותם פעם ב -20 מעלות צלזיוס גם משפר שביר תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl נטרול פתרון (40 מ&quot;מ טריס-HC, pH 4.0) היטב כל אחד. להעביר את כל lysates לתוך בארות U-בצורת צלחת PCR ויבש בתוך Cycler PCR ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות. מחדש את lysates עם 20 μl מים מזוקקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt באמצעות Drop-דיאליזה 9 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במסנני קרום עם גודל הנקבובי ממוצע 0.025 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Float את המסנן במים מזוקקים עם למעלה בצד מבריק בבארות של צלחת 12-היטב. להרטיב את המסנן במשך 5 דקות. שים לב, כדי למנוע בועות אוויר בין המסנן והמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet את lysates מחדש של כל דגימת משלב 3.1.4 בזהירות על על כל אחת מ -4 תחומי המסנן. מכסים את הצלחת ואת dialyze למשך 30 עד 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצוץ את המים תחת המסנן בלי לדפדף על המסנן ולא להפריע את הטיפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את lysate-טיפות לתוך הבארות של PCR-צלחת חדשה. לייבש את טיפות DNA על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 דקות בתוך Cycler PCR. מחדש את lysates ב 10 מי μl. </li></ol></li></ol> 4. PCR דיגיטלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכיבים קפוא להפשיר כגון DNA, חיץ לערבב assay ב RT, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של כל צנטריפוגות זמין (למשל, VWR מיני צנטריפוגות) ולאחר מכן לשמור אותם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת מאסטר המכיל את כל המרכיבים למעט DNA (טבלה 1). שקול נפח מת ולחשב מאסטר תערובת כ 10% יותר מהסכום הנדרש. הערה: השתמש primers ו בדיקות בשימוש בערכה המסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס את התערובת אב, ספין למטה במשך 10 שניות לעבר כוח מקסימלית של צנטריפוגות כל זמין (למשל, צנטריפוגות מיני VWR) ולחלק 15 μl לכלגם צלחת 96-PCR. הוסף את כל lysate (המכיל DNA) של כל דגימה כדי הבארות המכילות תערובת מאסטר. העברת 20 μl של כל תערובת התגובה לתוך באר בצד מדגם של מחסנית ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 70 μl של שמן גנרטור אגל לבאר כל בצד שמן של מחסנית. סגור את המחסנית עם האטם ולמקם את התפאורה כולה למחולל רביב. התחל דור אגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 40 μl אגל-פתרון לתוך בארות צלחת PCR 96-היטב. חותם את הצלחת עם בנייר כסף ומניחים בצלחת לתוך Cycler PCR. הגדר את הטמפרטורה המכסה ל -105 מעלות צלזיוס, כבש שער ב -2 מעלות צלזיוס / sec. לבצע PCR תוך שימוש בהגדרות בטבלה 2. לאחר PCR, להעביר את הצלחת לקורא אגל ולהתחיל לקרוא. לחלופין, אחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות. </li></ol> 5. חישוב שיעור של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענו את נתוני PCR הדיגיטליים ולבצע analys האוטומטיהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה בתוצאות של כל assay באופן ידני על ידי בוחן את ההתפלגות חד ממדית ו -2 ממדים של הטיפין החיוביות ושליליות, ואת בטוח שהם מופרדים היטב ואת קווי הסף היו בעמדות הנכונות. אל תכלול תוצאות שלא עמדו בקריטריונים, למשל, אין הפרדה ברורה של טיפות חיוביות ושליליות, בניתוחים נוספים. העתק את RPP30 NF1 / יחס שנוצר לתוך גיליון Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבת את חלקם של תאים סרטניים כמו: 2 x (1 NF1 / RPP30). </li></ol> 6. שינוי תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל-ריכוז תרופה, לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן מ -4 המשכפל. מגרש את האמצעים ואת סטיות התקן נגד-ריכוזי התרופה. </li></ol>

<ol><li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li>
<li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li>
<li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li>
<li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li>
<li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography-Methods%22%5BJournal%5D)">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li>
<li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li>
<li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome%3A+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li>
</ol>

ההליך מוגן בפטנט (10 2013 221 452, גרמניה)

צעד מפתח כלי genetic- ו מבוסס תא זו להערכת סגוליות תרופה במבחנה הוא קביעת שיעור של תאים סרטניים באמצעות אחד או יותר מאפיינים גנטיים ספציפי גידול. בניגוד לתכונות פנוטיפי קונבנציונליות 7, מאפיינים גנטיים ספציפיים, יציבים וקלים לכמת. לדוגמא, וריאצית מספר מוטציה או עותק ספציפי גידול קיימת אך ורק בתאים הסרטניים אך לא בתאים שאינם סרטניים. כזה הסטיגמה גנטי ניתן באופן מהימן ומדויק לכמת, למשל, באמצעות PCR הדיגיטלי כפי שמודגם במחקר זה. לקבלה הדיגיטלי PCR, טוהר גבוה של DNA אינו הכרחי. עם זאת, Desalting והסרת מולקולות מעכבות נחוצים אשר יכולה להיות מושגת על ידי א-דיאליזה ירידה באמצעות מסנן מתאים. תמוגה בשילוב טיפה-הדיאליזה היא פשוט ומהירה, לא דורשת מכשירים מיוחדים ולכן יכולה להתבצע בכל מעבדה סטנדרטית. אם התאים אינם בריk היטב, יכול להיחשב טיפול נוסף כגון הקפאת התאים ב -20 ° C, הוספת חומר ניקוי ו / או באמצעות פרוטאז. במחקר הנוכחי, את המחיקה הטרוזיגוטיים של גן NF1 שמשה תכונה מסוימת גידולים עבור כימות. באופן דומה, מחיקות של גנים או לוקוסים אחרים יכולות לשמש גם. יתר על כן, מוטציות יכולות לשמש גם לכימות תאים סרטניים. במקרה כזה, מבחני PCR דיגיטליים עבור המוטציה ואת אללים הנורמלי צריכים להיות מאומתים נרחב כדי להבטיח הספציפיות שלהם עבור כל אחד מהם. תלוי מינון פרופורציה של תאים סרטניים מספקת אינדיקציה-סגולי סמים או סלקטיביות. יתר על כן, הוא גם מאפשר בתגובה לחילוץ של תאים סרטניים מן התגובה של תאים כוללים של תרבות מעורבת לתרופה (איור 4). מיצוי אסטרטגיה זו מספקת פתרון עבור הבעיה הטכנית באמצעות תרבויות עיקריות (המכיל הוא גידול ולאn-גידול תאים) עבור בדיקות סמים. Genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה הראה במחקר הנוכחי עשויים ולכן יש פוטנציאל יישום (1) ב-גילוי תרופות שבה היא מספקת פלטפורמה להערכה סגולי סמים או סלקטיביות במבחנה (2) בטיפול בסרטן אישית איפה זה מאפשר תרופות בדיקות בתרבויות עיקריות וכתוצאה מכך עשוי לתרום בחירת התרופה אדג&#39;ובנט כימותרפיה 4. יתר על כן, מנגנון תרופתי של תרופה ניתן ללמוד באמצעות הכלי הזה, מאז שינוי גנטי מסוים או שינויים גנטיים מרובים ניתן בעקבות במהלך-הטיפול התרופתי. קושי בשימוש תרבויות עיקריות אישיות הוא חוסר תכונה גנטית אוניברסלית עבור כימות של התאים הסרטניים. עם זאת, עם מקדמה בשיעור היום רצף שלם של הגנום, הגנים ואזורים שינו בתדירות הגבוהה ביותר ידועים גידולים נפוצים. לדוגמה, בין הראש והצווארגידולים, 71%, 23% ו -22% יש מוטציות TP53, FAT1 וגנים CDKN2A, ו -60%, 34% ו -26% יש מחיקות באזורי הגן של CDKN2A, STK11 ו PTEN, בהתאמה 10. הקרנת 5 עד 10 גנים או / ואזורים כגון באמצעות-רצף ממוקד ו / או דיגיטלי PCR יהיה ולכן סביר לזהות אחד או יותר שינויים גנטיים אשר ניתן להשתמש בהם עבור כימות של תאים סרטניים בתרבות העיקרי נגזר. מגבלה נוספת היא הכמות המספיקה של גידולי כריתה להקמת תרבויות עיקריות. למרות תכונות יתרון ופוטנציאל יישום מבטיח של genetic- ותא מבוסס בכלי במבחנה, מגבלותיו צריכים להישמר נפש שלה בטבע במבחנה יודגש. לדוגמא, ההשפעות השונות או הרעיל של תרופה על תאים סרטניים רשאי למדי בשל הבדל בסוגי תאים (פיברובלסטים לעומת בתאי שוואן) או שלהםמקורות שונים (מאנשים שונים). ההשפעה החזקה יותר של תרופה על תאים סרטניים מאשר תאים שאינם סרטניים עשויה גם להיות מוסברת על ידי העובדה כי לשעבר לגדול מהר יותר מאשר האחרון. והחשוב מכל, תאים בהתנהגות במבחנה שונה מאשר תאים בגוף האדם וכתוצאה מכך, תוצאות הערכה במבחנה לעתים קרובות לא או רק חלקית לשקף את המצב קליני האמיתי. לכן, יעילה, cytotoxicity וספציפית של תרופות שהתקבלו עבור תאים בתרבית הם די טבע סמן ביולוגי, אך אין להם את האמינות של יעילות preclinically הנמדד של אנטיביוטיקה. אף על פי כן, נע שורות תאים לתרבויות מעורבות ו / או תרבויות עיקריות הוא צעד קדימה בהערכה ותוצאת תרופה וספציפית / סלקטיביות במבחנה. עם מאמצים רבים, בתנאים במבחנה ניתן למצוא האפשר מתאם סביר של נתונים במבחנה עם תגובות אמיתיות של חולים, לפחות עבור חלק מתרופות.

השפעות טיפוליות של תרופות אנטי-סרטניות על תאי גידול קשורות להשפעות רעילות שונות ובלתי רצויות על תאים שאינם גידולים. קשה להעריך השפעות רעילות במעבדה, בעיקר בגלל היעדר כלים מתאימים1. תרביות תאים המכילות תאים גידוליים ולא גידוליים יספקו משאב פוטנציאלי במבחנה להערכת ספציפיות או סלקטיביות של תרופה שעשויה לשפוך אור על רעילות קלינית. עם זאת, בדיקות מבחנה קונבנציונליות כגון מבחני שגשוג או כדאיות מודדות את ההשפעה של תרופה על סך התאים, אך אינן יכולות לחלק את ההשפעה לחלק על תאי הגידול ולחלק על תאים שאינם גידולים. לדוגמה, הפחתה של 50% ממספר התאים הכולל בתרבית המורכבת מ-50% תאי גידול ו-50% תאים שאינם גידול יכולה לרמוז על מוות של כל תאי הגידול, מוות של כל התאים שאינם גידול או, סביר יותר, מוות של חלקים משניהם ביחסים שונים. 
גם בגלל בעיה טכנית זו, תרביות ראשוניות המכילות תאי סטרומה של גידול ותאי סטרומה שאינם גידולים לרוב אינן מתאימות לבדיקת תרופות. מצד שני, בגלל ההטרוגניות התאית הזו, תרביות ראשוניות דומות לגידולים המקוריים שלהן הרבה יותר מאשר לתאים משובטים בשורות תאים מבוססות2. חשוב מכך, תרביות ראשוניות הן ספציפיות למטופל ועשויות לאפשר בדיקת סמים פרטנית2-4.
נושא מהותי הוא אפוא פיתוח שיטה לקביעת שיעור תאי הגידול בתרביות מעורבות כולל תרביות ראשוניות. לקראת אתגר זה, נהגה פתרון גנטי המבוסס על קביעת היחס הכמותי של תכונה גנטית ספציפית לגידול לרצף ייחוס אוניברסלי. מיחס זה ניתן לחשב את שיעור תאי הגידול בתרבית מעורבת. 
מחקר זה ממחיש את ההליך של הכלי הגנטי ומבוסס התאים להערכת הספציפיות של תרופות אנטי-סרטניות, כולל (1) הכנת תרבית מעורבת מתאי גידול מקו מבוסס ופיברובלסטים שאינם גידולים, (2) טיפול בתרבית המעורבת עם תרופת בדיקה, (3) הכנת DNA ל-PCR דיגיטלי, (4) קביעת היחס בין מחיקה הטרוזיגוטית ספציפית לגידול לרצף ייחוס באמצעות בדיקת PCR דיגיטלית של טיפת בדיקה כפולה, (5) חישוב פרופורציות של תאי גידול בכל ריכוז תרופה ו-(6) עריכת שינוי תלוי מינון של פרופורציה של תאי הגידול.

<table><tbody><tr><td>מסנן ממברנה בקוטר 25 מ"מ</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td> לבדיקת ddPCR <td>לדיאליזה</td></tr><tr><td>עבור NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td> בדיקת ddPCR <td>עם תווית FAM</td></tr><tr><td>עבור RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td></td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>הגרסה הקודמת QX שימשה במחקר, שאינה זמינה יותר. התחליף הוא שמן טיפות QX200</td></tr><tr><td></td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>אטמים</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק Cartrige</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>רדיד פירסבל</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן<em&gt; במבחנה</em

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

הליך להערכה ספציפי של תרופות נגד הסרטן במבחנה באמצעות תרביות המכילות גם תאים סרטניים ולא-סרטניים מודגם. אלמנט המפתח הוא נחישות כמותי של שינוי גנטי ספציפי גידול ביחס רצף אוניוורסלי באמצעות assay PCR דיגיטלי כפולה חללית לבין חישוב בדיעבד של הפרופורציה של תאים סרטניים. את assay מתבצעת על תרבות המכילה תאים סרטניים של קו הוקם ומשובץ-בתאים שאינם סרטניים. התרבות המעורבת מטופל בתרופת מבחן בריכוזים שונים. לאחר הטיפול, ה- DNA הוא מוכן ישירות מתאי הדבק שרדו בבארות של צלחות 96-היטב באמצעות שיטה פשוטה וזולה, ועברתי assay PCR הדיגיטלי כפולה בדיקת למדידת שינוי גנטי ספציפי גידול רצף ייחוס אוניוורסלי . בהפגנה הנוכחית, במחיקה הטרוזיגוטיים של הגן NF1 משמש שינוי גנטי ספציפי הגידולגן RPP30 כמו גן ההתייחסות. באמצעות יחס NF1 / RPP30, חלקם של תאים סרטניים חושב. מאז השינוי תלוי במינון של הפרופורציה של תאים סרטניים מספק אינדיקציה במבחנה עבור סגוליות של התרופה, גנטי מבוסס תאים זה assay במבחנה סביר להניח כי יש פוטנציאל יישום של גילוי תרופות. יתר על כן, עבור סרטן טיפול אישית, כלי genetic- ו מבוסס תאים זה עשוי לתרום לאופטימיזציה של כימותרפיה אדג&#39;ובנטי באמצעות יעילויות בדיקות וספציפיות של תרופות מועמדות באמצעות תרבויות עיקריות של גידולים בודדים.

איכות DNA הוכן באמצעות מאצ משולב / Drop-דיאליזה מספיקה עבור PCR דיגיטלי משביע רצון (איור 1B). עבור 2,000 פיברובלסטים, כ -3,000 ± 500 טיפות חיוביות התקבלו, המקביל ל 75% של 4,000 עותקים הצפויים (שני עותקים בתא אחד). במחקר זה, התאים הסרטניים היו מקו הוקם MPNST S462 אשר ידוע כבעלי מחיקת heterozygotic של גן NF1 5. 50% זה הפחתת מינון הגן זוהתה בבירור על ידי assay PCR הדיגיטלי הכפול (האיור 1B). לעומת זאת, שני עותקים של הגן הזה נמדדו פיברובלסטים. הבדל גנטי בין גידול ותאי שאינו סרטני מאפשר חישוב השיעור של תאים סרטניים בתרביות מעורבות (איור 2). באמצעות מדידת מינון הגנים היחסי של NF1 כדי RPP30, חלקם של תאים סרטניים ב תרבות מעורבת ניתן לקבועבכל-ריכוז התרופה (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> איור 1. דיגיטלי PCR. (א) איור של העיקרון. (ב) assay כפול בדיקה מגלה כמות מופחתת של גן המטרה (NF1) בתאי הגידול MPNST S462 ביחס גן הפניה (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> איור 2. שיעור מחושב של תאים סרטניים. תאים סרטניים ותאים שאינם סרטניים היו מעורבים ב יחסים שונים זורעים לתוך היטב בכל צלחת 96. לאחר מצורף O / N, התאים היו שנינות lysedמאצ h / Drop-דיאליזה ואת lysates desalted היו נתונים PCR דיגיטלי אשר נתן יחס של NF1 / RPP30. על בסיס יחס זה, חלקם של תאים סרטניים בכל טוב חושב. ממוצע וסטיית תקן של פרופורציה של תאים סרטניים חושבו מתוך 4 משכפל בכל פרופורציה הגדרת. הפרופורציות המחושבות של תאים סרטניים (ציר ה- Y) היו זממו נגד פרופורציות הגדרה (ציר ה- X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> איור 3. תלויי מנת שינוי פרופורציה של תאים סרטניים. (א) תלוי במינון ההפחתה של תאים חיוניים גלויים. (ב) חלקם של תאים סרטניים (ממוצע וסטיית תקן של 4 משכפל) שנמדד<html> יחס של NF1: RPP30, ירד בטווח של 10 - 0 מיקרומטר. באותו מיקרומטר הגבוה ביותר 50 מנה, כמה תאים חיוניים נותרו, כנראה עקב השפעה רעילה לכל התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . איור 4. תגובת הפרדה של תאים סרטניים מזו של תאים שאינם סרטניים (א) כדאיות או / ו תרבות תאים כוללים ניתן למדוד באמצעות מבחנים קונבנציונליים; שיעור של תאים סרטניים ניתן לקבוע באמצעות ההליך הפגין במחקר הנוכחי. (ב) באמצעות שני פרמטרים, תגובה של תאים הכוללים בתרבות מעורבת לתרופה ניתן לחלק התגובה של התאים הסרטניים והתגובה של התאים שאינם סרטניים..com / קבצים / ftp_upload / 53,752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> תגובה 1 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR Supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> תמהיל Assay עבור RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סיכום ביניים </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> תערובת מאסטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> סה&quot;כ </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> תערובת PCR סופית </td></tr></tbody></table> טבלה 1 הגדרת התגובה Dual ddPCR <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שָׁלָב </td><td> פעולה </td><td> טֶמפֶּרָטוּרָה </td><td> זְמַן </td><td> מחזורים </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymלמחוק הפעלה </td><td> 95 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> denaturation DNA </td><td> 94 ° C </td><td> 30 שניות </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> חישול / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> דקה 1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> שחרור משרות פולימראז </td><td> 98 ° C </td><td> 10 דק &#39; </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> המתנה (אופציונלי) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2 הגדרות Cycler PCR

מטרת פרוטוקול זה היא להעריך ספציפי של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרבויות מעורבות המכילות הוא גידול ותאי שאינו סרטני.

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את השינוי הפרופורציונלי התלוי במינון של תאי גידול בתרבית המכילה תאי גידול ותאים שאינם תאי גידול. שיטה זו מספקת כלי מבוסס גנטי להערכת ההשפעה והספציפיות של תרופות נגד סרטן in vitro. יש לה פוטנציאל יישומי בגילוי תרופות ובטיפול מותאם אישית בסרטן.היתרון המרכזי של שיטה זו הוא שכאשר נבדקת תרופה נגד סרטן בתרבית המכילה תאי גידול ותאי שאינם תאי גידול, ניתן להפריד את התגובה של תאי הגידול מזו של התאים שאינם תאי גידול. את הפרוצדורה זו תדגים אינה, טכנאית מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוצדורה על ידי תרבית של תאי גידול ופיברובלסטים במצע DMA סטנדרטי בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך לילה.בשלב של תת-צפיפות (subconfluence), קצרו את התאים באמצעות 0.05% trypsin וספרו אותם בעזרת המוציטומטר. לאחר מכן, ערבבו 400 תאי גידול ו-1,600 תאים שאינם תאי גידול יחד בכל באער של פלטת תרבית בעלת 96 באערים עם 0.2 mL של מצע גידול, והכינו ארבע חזרות לכל ריכוז של תרופה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5% carbon dioxide למשך הלילה.לאחר מכן, הכין תמיסות סטוק של Nilotinib ב-DMSO בריכוזים של 0, 2, 4 ו-20 mM. דלל כל אחת מהן פי 200 ב-5 mL של מצע DMA כדי לקבל תמיסות תרופה בריכוז כפול של 0, 10, 20 ו-100 uM. לאחר מכן, הסר 0.1 mL מהמצע מכל באער.הוסיפו 0.1 mL של מצע המכיל את התרופה והמשיכו לדגור את התאים למשך חמישה ימים. בסיום הטיפול, בחנו את התאים ההיצמדים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פנים (phase contrast) וצלמו אותם. שאבו את המצע ושטפו את התאים ההיצמדים ששרדו פעם אחת עם 0.2 mL של PBS.כדי ללייס את התאים בשיטת HotSHOT, הוסף 50 uL של תמיסת ליזיס בסיסית לכל באר. אטום את הבארים בעזרת נייר אלומיניום. לאחר מכן, דגור את הפלטה בטמפרטורה של 95 degrees Celsius בתנור או על פלטת חימום למשך 30 דקות.לאחר 30 דקות, בדקו תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו תאים שלמים על פני הבארות. במקרה שהתאים לא עברו ליזה מלאה, הגדילו את זמן החימום או הוסיפו דטרגנט. הקפאה חד-פעמית ב-20 Celsius degrees תסייע גם היא לפירוק התאים.לאחר מכן, הוסיפו 50 uL של תמיסת ניטרול לכל באר, לאחר מכן העבירו את כל הליזאטים לבארי ה-U Form של פלטת PCR ויבשו אותם במכשיר PCR cycler בטמפרטורה של 95 degrees Celsius למשך 10 עד 30 דקות. לאחר מכן, בצעו רקונסטיטוציה לליזאטים בעזרת 20 uL של מים מזוקקים. כדי לבצע הסמכה ל-DNA באמצעות דיאלזה בטיפה (drop dialysis), חלקו מסנן ממברנה בעלת קוטר של 25 mm לארבעה אזורים ומספרו את האזורים.הצמדו את המסננים על מים מזוקקים כאשר הצד המבריק פונה כלפי מעלה בתוך באער של פלטת 12 באערים. לאחר מכן, טפטפו בזהירות 20 uL של ליזאט ששוחזר על גבי המסנן. כסו את הפלטה ובצעו דיאליזה למשך 30 עד 60 דקות.לאחר מכן, שאבו את המים שמתחת למסנן מבלי להפוך אותו ומבלי להפריע לטיפות. העבירו את טיפות הליזט לבארות של פלטת PCR חדשה. לאחר מכן, ייבשו את טיפות ה-DNA על ידי חימום הפלטה בטמפרטורה של 95 °C למשך 10 עד 30 דקות במכשיר PCR cycler.לאחר מכן, בצעו רקונסטיטוציה (reconstitute) לליזאטים ב-10 uL של מים. בשלב הבא, הכינו את תערובת המאסטר (master mix) המכילה את כל הרכיבים למעט ה-DNA עבור תגובת ה-digital PCR עם פרוב כפול. ערבבו במערבל Vortex וסובבו בצנטריפוגה ל-10 שניות בעוצמה מרבית, וחלקו 15 uL מהתערובת לכל באר בלוח PCR של 96 בארות.הוסיפו את הליזאט של כל דגימה לבארים המכילות את תערובת המאסטר. העבירו 20 uL מכל תערובת תגובה לבאר בצדו של הדגימות במחסנית בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חלקו 70 uL של שמן למחולל טיפות לכל באר בצדו של השמן במחסנית.סגרו את המחסנית באמצעות אטם והניחו את כל המערך בתוך מחולל טיפות לפני תחילת יצירת הטיפות. לאחר מכן, העבירו 40 uL של תמיסת טיפות לכל באער של פלטת PCR בעלת 96 באערים. אטמו את הפלטה באמצעות יריעת רדיד והניחו את הפלטה בתוך מכשיר PCR cycler.בשלב הבא, הגדירו את טמפרטורת המכסה ל-105 °C ואת קצב העלייה ל-2 °C לשנייה. בסיום, העבירו את הפלטה לקורא טיפות והתחילו בקריאה. לחלופין, ניתן לאחסן את הפלטה בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 24 שעות.כעת טענו את נתוני ה-digital PCR ובצעו ניתוח אוטומטי. בחנו את הדגימות באופן ידני כדי לוודא שהטיפות החיוביות והשליליות מופרדות היטב. הסִירו מהניתוח המשך דגימות שבהן אין הפרדה ברורה בין טיפות חיוביות לשליליות.העתיקו את היחס שהתקבל בין NF1 ל-RPP30 לגיליון Excel. לאחר מכן, חשבו את פרופורציית תאי הגידול. עבור כל ריכוז של התרופה, חשבו את הממוצע ואת סטיית התקן מארבע החזרות, ולאחר מכן שרטטו את הממוצעים ואת סטיות התקן כפונקציה של ריכוזי התרופה.מוצג כאן ה 감소 התלוי במינון של התאים החיוניים הנראים. שיעור תאי הגידול שחושב מהיחס בין NF1 ל-RPP30 פחת בטווח של 0 עד 10 uM. במינון הגבוה ביותר של 50 uM נותרו מעט תאים חיוניים, ככל הנראה בשל השפעה רעילה על כל התאים.ניתן למדוד את החיוניות והשגשוג של סך התאים באמצעות בדיקות קונבנציונליות, אך ניתן לקבוע את פרופורציית תאי הגידול באמצעות הפרוטוקול המוצג במחקר הנוכחי. באמצעות שני הפרמטרים הללו, ניתן לחלק את תגובת התאים הכוללת לתרופה בתרבית מעורבת לתגובת תאי הגידול ולתגובת התאים שאינם תאי גידול. ניתן לבצע את כל הליך הבדיקה בתוך שבוע אחד, כולל תקופת טיפול של חמישה ימים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי היחס בין הגן מטרה לגן השלילה משתנה. אנו רואים טווח צר מאוד הנע בין 0 ל-1, ולכן דיוק הוא חיוני. יש לצמצם ככל האפשר את השונות בין הדגימות ובטיפול בהן.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש גם בתרביות ראשוניות המכילות תאי גידול ותאים שאינם תאי גידול כדי לבחון את ההשפעה והספציפיות של תרופות נגד סרטן. יתרה מכך, ניתן להעריך באופן ספציפי את השפעתה של תרופה על תת-אוכלוסייה מסוימת של תאים עם שינוי גנטי מוגדר. אני מקווה שסרטון זה יעזור לכם להבין כיצד להשתמש במאפיין גנטי כדי לקבוע את פרופורציית תאי הגידול בדגימה או בתרבית המכילה הן תאי גידול והן תאים שאינם תאי גידול.

assessing-specificity-of-anticancer-drugs-in-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

טירוזין קינאז רצפטור באים לידי ביטוי ectopically בסוגי סרטן רבים וזוהו כמטרות טיפוליות בלוקמיה חריפה. כתב יד זה מתאר אסטרטגיה יעילה להערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה.

הערכה טרום קלינית של מעכבי טירוזין קינאז לטיפול בלוקמיה חריפה

שיטה לסינתזה של סוכני טיטניום ונדיום נגד סרטן אוויר רגיש מתוארת, יחד עם ההערכה של הפעילות ציטוטוקסיות כלפי שורת תאי הסרטן אנושית על ידי assay MTT.

מכלולים נגד סרטן מתכת: סינתזה וCytotoxicity הערכה על ידי assay MTT

כאן, ניטור בזמן אמת של חילוף החומרים של תאי הגידול, בשילוב עם מודל ממברנה כוריו-אלנטואית של עובר עוף (CAM) של גרורות, משמשים להערכת מטרות/סוכנים אנטי-סרטניים חדשים על יכולתם לעורר רגישות לתאי גידול לכימותרפיה הפוגעת ב-DNA.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

אנו מציגים מודל תלת מימדי (תלת מימדי) של סרטן ריאות המבוסס על פיגום קולגן ביולוגי כדי לחקור את הרגישות לטיפולים ממוקדי תאים לא קטנים-סרטן-ריאות (NSCLC). אנו מדגימים טכניקות קריאה שונות לקביעת מדד ההתפשטות, האפופטוזיס ומצב המעבר האפיתלי-מזנכימלי (EMT). הנתונים שנאספו משולבים במודל סיליקו לחיזוי רגישות לתרופות.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך הסינרגטיות בין נוגדן נגד סרטן תרופות antineoplastic במודלים פרה באמצעות המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay.

Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

כאן נתאר שיטת הפריה תרבות משותפת כדי באופן רקורסיבי אתגר, ממוקדות גידול תאי T, המאפשר ניתוח פנוטיפי ופונקציונליים של פעילות antitumor תא T...

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

מערכת בדיקת תפוקה גבוהה במבחנה פותחה להערכת תרופות נגד סרטן באמצעות אורגנוידים של גידול שמקורם במטופל (PDOs), בדומה לרקמות סרטן אך אינן מתאימות למערכות במבחנה עם 96-well ו-384-well.

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

צעד הכרחי בפיתוח אפטמר נגד סרטן הוא לבחון את קשירתו למטרה. אנו מדגימים בדיקה מבוססת ציטומטריה של זרימה כדי לחקור את הקשירה הזו, תוך הדגשת החשיבות של הכללת אפטמר בקרה שלילית ותאים סרטניים חיוביים או שליליים עבור אותו חלבון מסוים.

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

במאמר זה אנו מציגים שיטה לזיהוי תרכובות המווסתות את מנגנון ADCC, מנגנון חשוב להרג תאים סרטניים של נוגדנים אנטי-סרטניים. ההשפעה ציטוטוקסית של תאי NK נמדדת בספרואידים של תאי סרטן השד בנוכחות Trastuzumab. ניתוח תמונה מזהה רוצחים חיים ומתים ותאי מטרה בספרואידים.

כימות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים במודל ספרואידי גידול: יישום לגילוי תרופות

חקור הערכת ספציפיות של תרופות נגד סרטן במבחנה באמצעות תרביות מעורבות של תאי גידול ופיברובלסטים. שיטה זו מאפשרת הפרדת תגובות התאים באמצעות PCR דיגיטלי לניתוח מדויק.

הערכה ספציפית של תרופות נגד הסרטן

גלה סרטונים נוספים