Name: ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: חקור רטרוטרנספוזיציה של LINE-1 ברמת גרעין יחיד בקווי תאי HepG2 באמצעות FISH. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של שיעורי הרטרוטרנספוזיציה ותבניות הפעילות הגנומית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה (ES014443 ו-ES017274) ואסטרהזניקה ל-KSR.

הערה: כל הצעדים צריכה להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. עיין בסעיף ריאגנטים לפרטים על איך להכין ריאגנטים בודדים. 1. בדיקות תיוג L1 הערה: בדיקות יכולות להיות מתויגות על ידי תיוג כימי או PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג כימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך ג&#39;ל agarose 0.7-1% טריס-אצטט-EDTA (TAE) חיץ, חום במיקרוגל עד שהיא נמסה, לאפשר את הג&#39;ל להתקרר, ולאחר מכן להוסיף ברומיד ethidium (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). יוצקים לתוך מגש ג&#39;ל, להוסיף מסרקים ולאפשר ג&#39;ל כדי לחזק בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל חללית SNeo (1-2 מיקרוגרם) עם CY3 או FITC ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: SNeo מציין את S pliced ​​ניאו גן mycin הביע לאחר מחזור מלא של ורטרו-טרנספוזיציה. החללית נמצאת ~ 1,000 נ&quot;ב בגודל. SNeo ניתן PCR מוגבר מכל וקטור או genomic DNA. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על streptavidin-CY3 / ריאגנטים תיוג FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את פתרון בדיקת SNeo שכותרתו עם חיץ טעינת ה- DNA 1x, עומס לבאר כל ולהפעיל 75-100 וולט במשך 15-20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את להקת הבדיקה באמצעות Illuminator אולטרה ויולט (UV). שימו לב שהגודל של חללית SNeo ניתן לכוונן כי חומצת גרעיני Lock (LNA) ניתן גם להוסיף (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cut שכותרתו בדיקת SNeo מן הג&#39;ל עם להב נקי, solubilize ולטהר את חללית SNeo מן הג&#39;ל באמצעות ערכת ה- PCR ניקיון על פי הפרוטוקול של היצרן. זהירות: כיסוי כל חלק חשוף של הגוף עם מגינים מגנים (כלומר, מעיילי מעבדת מסיכת פנים ברורים UV) בעת הצגה וחיתוך הג&#39;ל. ראה טבלה של חומר ריאגנטים עבור מידע ג&#39;ל לטהר מוצרי PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל שוב 5 μl של SNeo שכותרתו בדיקה עם החללית SNeo שכותרתו האו&quot;ם על ג&#39;ל agarose 0.7% (ראה 1.1.1) כדי להונותעלייה וירידה גודל הפירמה של עוצמת האות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כמות תווית בדיקה SNeo על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר ו לדלל את החללית SNeo עד 10 ng / aliquots μl ב nuclease חינם H 2 O. aliquots חנות ב -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג PCR (שיטה חלופית תיוג בדיקה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב פריימרים ספציפיים SNeo (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) עם ריאגנטים PCR לתוך צינור יחיד: 13.6 H חינם nuclease μl 2 O; 0.1 dATP μl, dCTP, dGTP (10 ננומטר); 0.05 μl dTTP (10 ננומטר); 0.05 μl dUTP ביוטין / dUTP-FITC / CY3 (10 ננומטר); 4 μl עבור תג 5x חיץ; 0.4 μl עבור פולימראז תג; 1 μl תבנית SNeo (10 נ&quot;ג). ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על חומרים כימיים PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הסכום של כל מגיב ידי כפל המספר הכולל של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפרמטר אופני PCR הבאיםהים כדי להגביר בדיקות תווית SNeo: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 62 ° C למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; החזק ב 4 ° C ללא הגבלת זמן. הערה: טמפרטורת החישול יכולה להיות מותאמת או שיפוע PCR ניתן להשלים לקביעת טמפרטורות חישול אופטימליות עבור בדיקות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 0.7-1% ג&#39;ל כאמור בסעיף 1.1.1, עומס ולדמיין את הלהקה בדיקה כאמור בסעיף 1.1.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים ולטהר את החללית SNeo שכותרתו כאמור בסעיף 1.1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל שוב 5 μl של SNeo שכותרתו בדיקה עם חללית SNeo שכותרתו האו&quot;ם לאשר עליית גודל ואובדן עוצמת אות (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כמות תווית בדיקה SNeo ידי ספיגת מדידה ב 260 ננומטר ו לדלל החללית SNeo עד 10 ng / aliquots μl ב nuclease חינם H 2 O. </li></ol></li></ol> 2. ממרחי כרומוזום הכינו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור שיבוטים יציבים להביע עמוד שדרת וקטור (control) או ורטרו-טרנספוזיציה המוסמכות L1 באמצעות מתודולוגיות מבחר סטנדרטי. 12,16 בעוד הכתבים הלא episomal שימשו לתאם הממצאים עם מחקרים של שעתוק, וקטורים episomal יכול לשמש גם. לגדל תאים המבטאים שליטה ביציבות או וקטור L1 (1 x 10 6 תאים לכל צלחת 10 ס&quot;מ, עם התאמות בגודל צלחת עשה כנדרש) בתקשורת צמיחה מלאה. עבור תאים HepG2, להשתמש RPMI-1600, 10% FBS ו -200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של hygromycin. לגדול תרבויות כדי מפגש 70% ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הערה: הבחירה של מדיום הגידול תלויה בסוג התא. בהתחשב בכך פלסמידים משמשים כאן לשאת קלטות בחירה היא hygromycin ו neomycin, מבחר יציב של שיבוטים יכול להיעשות גם עם neomycin לאחר בחירה על hygromycin, אבל כמות neomycin צריך להיות מותאמת כדי לקבוע רמות סובלנות כלפי כל סוג תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף colcemid (0.4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עד ​​בינוני תרבות דגירה במשך 90 דקות כדי לעצור התאים ב metaphASE. אם באמצעות תאים מסוגים שונים, לקבוע את הריכוז האופטימלי של colcemid וזמן חשיפה (60, 90, ו -120 דקות) מעצר metaphase אופטימלי באופן אמפירי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים 2X עם 10 מ&quot;ל של PBS של 1x Dulbecco (DPBS), trypsinize על ידי הוספת 3-5 מ&quot;ל של 0.25% פתרון טריפסין אל התאים דגירה במשך 5 דקות כדי לנתק את התאים. להשבית טריפסין עם כמות שווה של התקשורת המכיל 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים למשך 2 דקות XG ב 1000 ב 4 מעלות צלזיוס, לשאוב את המדיום מן התא גלולה לשטוף את התאים עם DPBS. לשאוב כל DPBS, עוזב 200 μl של DPBS מחדש להשעות את התאים. ודאו תאים מעורבבים היטב שכל הגושים מפוזרים. השתמש מהבהב או pipetting עדין לערבב לפזר גושים ולהימנע vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של תמיסת hypotonic (כלומר, 75 מ&quot;מ KCl) כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס ירידה מבחינת תוך סיבוב הצינור 15 מ&quot;ל אופקית ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ראה טבלה של חומרים Reagents לקבלת מידע על האופן שבו תוכל להשיג את הפתרון hypotonic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה ב 120 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וחזור על שלבים 2.4 - 2.5 3x עוזב כ 200 μl של פתרון hypotonic מחדש להשעות את התאים לאחר כל שטיפה. ודא כי בסוף של 3 שוטף, הגלולה היא בעליל לבן ונפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות גלולה ב 200 μl של פתרון Carnoy מקבע ולעשות 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16 דילולים בתמיסה Carnoy מקבע. ירידה של כ -10 μl של דילול כל לשקופית נקיה ויבשה מכ 1 סנטימטר מעל ומייד לחשוף את הצד ללא התפשט אדים חמים מים רותחים למשך 30 שניות. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך לעשות פתרון Carnoy מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את המרווחים בטמפרטורת החדר, כתם עם 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Hoechst-33342 על ידי טבילה למשך 15-20 דקות בצנצנת Coplin ולשטוף 3x עם DPBS. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך לעשות את הפתרון Hoechst-33342. </li> &lt;li&gt; צפה מתפשט על מיקרוסקופ פלואורסצנטי / שלב בניגוד בהגדלה 40X. לאחר אופטימיזציה הכנה התפשטות, ממרחים לא צריך להיות מוכתם Hoechst-33342. צפו מתפשט על מיקרוסקופ שלב בניגוד בהגדלה 10X לקבוע איכות הפרדת התפשטות כפי שמתוארת בסעיף התוצאות (ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולכרוך ממרחים טובים עם מרקר פוינט יהלומים בצד הנגדי של השקופית (כלומר, להפיץ ללא צד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות מתפשטת ב -20 ° C עד חודש. המנעו מחשיפה ללחות. </li></ol> 3. הקרינה הכלאה באתרו (FISH) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוב dehydrating ממרחים הערה: לאזן כרומוזום metaphase פורש לטמפרטורת חדר אם מאוחסן ב -20 ° C. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להשיג ולעשות ריאגנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומוזום metaphase דגירה מתפשט באות A RNase 200 μl עבורשעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מחליק חיץ 2x-SSC פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ואחריו שטיפה עם 10 פתרון מ&quot;מ HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ממרחים עם פפסין 1% למשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף עם deionized H 2 O ולשטוף פעמיים עם חיץ 2x-SSC במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת ממרחים עם paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות ולשטוף במאגר SSC 2x פעמים במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים שהפיץ דוגרים במשך 2 דקות בסדרת אתנול: 70%, 80%, ו -95% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות אוויר יבשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה ממרחים עם בדיקות -labeled ורטרו-טרנספוזיציה L1 (כלומר, SNeo) זהירות: לקבלת בדיקות ישירות שכותרתו, להתרחק מן האור בכל העת. ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להשיג ולעשות ריאגנטים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 30 ng של SNeo למאגר הכלאה, חום 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ומצננים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של פתרון בדיקה SNeo לדוארהתפשטות ACH, ומכסים coverslip וסוגרים את הקצוות עם מלט גומי. ודא שלא היווצרות בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את השקופית על 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על גוש חום, טיפה את הטמפרטורה בהדרגה ל -37 מעלות צלזיוס, דגירת הלילה בתא humidified בחושך ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה והצגה (או תוספת של נוגדנים משני) זהירות: לקבלת בדיקות ישירות שכותרתו, להתרחק מן האור בכל העת. הערה: ראה טבלה של חומרים ריאגנטים עבור מידע על איך להכין. שימוש נפח מספיק כדי לכסות את התפשטות כרומוזום כולו מומלץ. זכור כי נפח עודף יאבדו כאשר coverslip מתווסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול שקופיות חיץ 2x SSC להסיר coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ 2x-SSC על 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ לשטוף ב 45 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ SSC 0.1x על 45 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לשטוף שקופיות על ידי טבילת חיץ 2x SSC על 45 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הערה: מקום בצנצנת Coplin המכיל מאגר מומלץ באמבט מים, להתאים הטמפרטורה ל -45 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות מצננים לטמפרטורת החדר לאזן שקופיות במאגר זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות שכותרתו ישירות, דלג לשלב 3.4.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות שכותרתו עקיפות, בלוק בחסימת מאגר במשך 20-30 דקות ולשטוף 3x ב DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם 50 μl של נוגדנים משני (למשל, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל streptavidin-FITC, או αCY3 בחסימת המאגר) במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות 2x SSC למשך 5 דקות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain עם פתרון Hoechst-33342 (0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במשך 10 דקות. הערה: מכתים זה נעשה כדי להכתים הכרומוזומים עבור שיתוף לוקליזציה עם החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף DPBS 3x, להוסיף טיפה של הרכבה בינונית, במקום coverslip וסוגרים את הקצוות עם לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח ורטרו-טרנספוזיציה L1 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 40X magnification. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mathias, S. L., Scott, A. F., Kazazian, H. H., Boeke, J. D., Gabriel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+transcriptase+encoded+by+a+human+transposable+element%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reverse transcriptase encoded by a human transposable element.</a> Science. 254, 1808-1810 (1991).</li>
<li>Feng, Q., Moran, J. V., Kazazian, H. H., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+retrotransposon+encodes+a+conserved+endonuclease+required+for+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human L1 retrotransposon encodes a conserved endonuclease required for retrotransposition.</a> Cell. 87, 905-916 (1996).</li>
<li>Clements, A. P., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+LINE-1+reverse+transcriptase%3Aeffect+of+deletions+outside+the+common+reverse+transcriptase+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The human LINE-1 reverse transcriptase:effect of deletions outside the common reverse transcriptase domain.</a> Nucl Acids Res. 26, 3528-3535 (1998).</li>
<li>Martin, S. L., Branciforte, D., Keller, D., Bain, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+for+an+essential+protein+in+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure for an essential protein in L1 retrotransposition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13815-13820 (2003).</li>
<li>Khazina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimeric+structure+and+flexibility+of+the+L1ORF1+protein+in+human+L1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Trimeric structure and flexibility of the L1ORF1 protein in human L1 retrotransposition.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 1006-1014 (2011).</li>
<li>Martin, S. L., Li, J., Weisz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+defines+distinct+functional+domains+for+protein-protein+and+nucleic+acid+interactions+in+the+ORF1+protein+of+mouse+LINE-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis defines distinct functional domains for protein-protein and nucleic acid interactions in the ORF1 protein of mouse LINE-1.</a> J Mol Biol. 304, 11-20 (2000).</li>
<li>Martin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+particles+with+LINE-1+RNA+in+mouse+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein particles with LINE-1 RNA in mouse embryonal carcinoma cells.</a> Mol Cell Biol. 11 (9), 4804-4807 (1991).</li>
<li>Hohjoh, H., Singer, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+ribonucleoprotein+complexes+containing+human+LINE-1+protein+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic ribonucleoprotein complexes containing human LINE-1 protein and RNA.</a> EMBO J. 15, 630-639 (1996).</li>
<li>Cost, G. J., Feng, Q., Jacquier, A., Boeke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+L1+element+target-primed+reverse+transcription+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human L1 element target-primed reverse transcription in vitro.</a> EMBO J. 21, 5899-5910 (2002).</li>
<li>Szak, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+archeology+of+L1+insertions+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular archeology of L1 insertions in the human genome.</a> Genome Biol. 3, (2002).</li>
<li>Sen, S. K., Huang, C. T., Han, K., Batzer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endonuclease-independent+insertion+provides+an+alternative+pathway+for+L1+retrotransposition+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Endonuclease-independent insertion provides an alternative pathway for L1 retrotransposition in the human genome.</a> Nucl Acids Res. 35, 3741-3751 (2007).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Roberts, R. A., Anderton, M. J., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+HepG2+genome+by+long+interspersed+nuclear+element-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the HepG2 genome by long interspersed nuclear element-1.</a> Mol Oncol. 7, 812-825 (2013).</li>
<li>Boeke, J. D., Garfinkel, D. J., Styles, C. A., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ty+elements+transpose+through+an+RNA+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ty elements transpose through an RNA intermediate.</a> Cell. 40, 491-500 (1985).</li>
<li>Heidmann, T., Heidmann, O., Nicolas, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indicator+gene+to+demonstrate+intracellular+transposition+of+defective+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An indicator gene to demonstrate intracellular transposition of defective retroviruses.</a> PNAS. 85, 2219-2223 (1988).</li>
<li>Moran, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+retrotransposition+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High frequency retrotransposition in cultured mammalian cells.</a> Cell. 87, 917-927 (1996).</li>
<li>Bojang, P. Jr, Anderton, M. J., Roberts, R. A., Ramos, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+LINE-1+retrotransposition+in+HepG2+cells+preferentially+targets+gene+poor+regions+of+chromosome+13%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">De novo LINE-1 retrotransposition in HepG2 cells preferentially targets gene poor regions of chromosome 13.</a> Genomics. 104, 96-104 (2014).</li>
<li>Rozen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+gene+conversion+between+arms+of+palindromes+in+human+and+ape+Y+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abundant gene conversion between arms of palindromes in human and ape Y chromosomes.</a> Nature. 423, 873-876 (2003).</li>
<li>Graves, J. A., Koina, E., Sankovic, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+gene+content+of+human+sex+chromosomes+evolved%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Gen+Develop%22%5BJournal%5D)">How the gene content of human sex chromosomes evolved.</a> Curr Op Gen Develop. 16, 219-224 (2006).</li>
<li>Leem, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+Tf1+is+targeted+to+Pol+II+promoters+by+transcription+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon Tf1 is targeted to Pol II promoters by transcription activators.</a> Mol Cell. 30, 98-107 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Levin, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+retrotransposon+integration+provides+a+saturated+profile+of+target+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of retrotransposon integration provides a saturated profile of target activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Genome Res. 20, 239-248 (2010).</li>
<li>Dai, J., Xie, W., Brady, T. L., Gao, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+regulates+integration+of+the+yeast+Ty5+retrotransposon+into+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation regulates integration of the yeast Ty5 retrotransposon into heterochromatin.</a> Mol Cell. 27, 289-299 (2007).</li>
<li>McClintock, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+behavior+of+mutable+loci+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The origin and behavior of mutable loci in maize.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 344-355 (1950).</li>
<li>Fernandez, L., Torregrosa, L., Segura, V., Bouquet, A., Martinez-Zapater, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-induced+gene+activation+as+a+mechanism+generating+cluster+shape+somatic+variation+in+grapevine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transposon-induced gene activation as a mechanism generating cluster shape somatic variation in grapevine.</a> Plant J Cell Mol Biol. 61, 545-557 (2010).</li>
<li>Garcia-Perez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+engineered+L1+retrotransposition+events+in+human+embryonic+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of engineered L1 retrotransposition events in human embryonic carcinoma cells.</a> Nature. 466 (7307), 769-773 (2010).</li>
<li>Rodic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposon+insertions+in+the+clonal+evolution+of+pancreatic+ductual+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductual adenocarcinoma.</a> Nat Med. 21 (9), (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים מתחרים פוטנציאליים.

מתודולוגיות כמו רצף הגנום כולו, הפוך PCR סופג דרומי הועסקה ללמוד ורטרו-טרנספוזיציה L1. למרות מתודולוגיות אלה הן בעלי ערך רב באיתור שבו הוספות L1 להתרחש בתוך הגנום, אתגר מבלבל עבור כל אחד מהם הוא הצורך תיכנות ב-סיליקון לצרף יחד רצפים. המתודולוגיה FISH המתואר כאן נועדה להשלים שיטות אלה, במיוחד במקרה של מחקרים הדורשים ניתוח ורטרו-טרנספוזיציה L1 אקטופי בתאים בתרבית. הגישה יכולה לשמש הן הערכה כמותית ואיכותית של אירועים ורטרו-טרנספוזיציה וכן להחיל שלב...

אדם הארוך וביניהם גרעיני Element-1 (קו-1 או L1) הוא מרכיב נייד אוטונומי, המתקדם בתוך הגנום באמצעות &quot;העתק ודבק&quot; מנגנון ורטרו-טרנספוזיציה. L1 אדם טיפוסי הוא ~ 6 kb ארוך ומורכב 5&#39;UTR (אזור מתורגם) המשמש כמקדם, שתי מסגרות קריאה פתוחות (ORFs): L1 -ORF1 ו L1 -ORF2, וכן 3&#39;UTR עם פולה יש זנב L1 חלבון -ORF1 שלושה תחומים נפרדים:. תחום סליל סליל, RNA הכרת Motif ו- C- מסוף תחום, בעוד חלבון L1 -ORF2 יש endonuclease, הפוך transcriptase ותחומים עשירים ציסטאין 1,2,3,4,5. L1 -ORF1 מפגין פעילות המלווה חומצות גרעין, בעוד L1 -ORF2 מספק פעילות אנזימטית, עם שני החלבונים הדרושים עבור ורטרו-טרנספוזיציה 1,2,6. מחזור של L1 ורטרו-טרנספוזיציה מתחיל עם תעתיק מן 5&#39;UTR של L1 </em&gt; mRNA bicistronic ידי RNA פולימראז II, טרנסלוקציה לתוך הציטופלסמה, ותרגום. בציטופלסמה, מיצגים L1 -ORF1 או ציס -binding בו חבילות RNA משלה או -binding טרנס בו חבילות RNAs אחרים (כלומר, סינוס / SVAs / פסוידו) כדי ליצור חלקיק ribonucleoprotein (RNP) עם L1 -ORF2p 7, 8. RNPs translocate לתוך הגרעין שבו פעילות endonuclease של ניקס L1 -ORF2p הדנ&quot;א הגנומי (gDNA) כדי לחשוף את OH - קבוצה 9, כי הוא בתורו שמוצג טרנסקריפטאז הפוך הממשלה הפוכה לסנתז RNA ל- DNA מסוף &#39;3. במהלך סינתזה הפוכה, הגדיל השני של ה- DNA הוא פצע 7-20 נ&quot;ב מאתר ניק המקורי כדי ליצור הפסקות מעד אשר מלאות ליצירת רצפי כניסת L1 החתימה (למשל, TTTTAA) בשם כפילויות אתר היעד (TSD) 9,10. תהליך זה ידוע בשם שעתוק לאחור ממשלת היעד (TPRT) ומוביל insertiעל של עותקים מלאים או קטועה של DNAs L1 / אחרים עם TSDs בשני קצותיו של רצף מוכנס. ורטרו-טרנספוזיציה L1 הוכח גם להיות מתווכת דרך הקצה שהצטרף שאינם הומולוגיים TPRT דמוי בסוגי תאים מסוימים 11. וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1 המועסקים המחקרים שלנו הוא בלתי episomal והוא מורכב מתויג L1 -ORF1 &amp; מונע 2p ידי היזמים CMV-L1-5&#39;UTR משולב (איור 1) 12. גרסאות מוקדמות יותר של מבנה זה תוארו במחקרים באמצעות שמרים תרביות תאים אנושיים 13,14,15. שני היזמים CMV ברורים הממוקם 5 &#39;ו 3&#39; מסתיים של וקטור, עם הסוף &#39;3 להציב אוריינטציה הפוכה לנהוג ביטוי של neomycin לאחר שחבור ואינטגרציה. הקלטת מחוון ורטרו-טרנספוזיציה בסוף &#39;3 ​​מורכב antisense מוכנס גנים neomycin כדי L1 -ORFs ויהפכו פעיל על ידי הפרדה לשני חצאים על ידי גושב אינטרון עם תורם שחבור (SD) ו acceptor שחבור (SA) אתרים (איור 1). עם האינטגרציה לתוך כרומוזום, L1 הוא עבד מן האמרגן המשותף לייצר mRNA שמורכבת mRNA bicistronic ו mRNA neomycin הפעיל. במהלך עיבוד RNA, האינטרון גלובין עובר שחבור מתוך הגן neomycin לשחזר גן neomycin מתפקדת במלואה. ה- mRNA ההיברידית ארוזה לתוך RNP ב CIS ו translocated לתוך הגרעין שם הוא משולב לתוך הגנום גם בתור הוספות באורך מלא או קטומים באמצעות TPRT. כאן אנו מתארים מתודולוגיה המשתמשת קרינת כלאה באתרו (FISH) עם בדיקות המכוונות באופן ספציפי על גן neomycin השחבור (SNeo) כדי לעקוב אחר דפוסי L1 -retrotransposiition ושיעורי כניסה ברמת הגרעין היחידה. היעיל והספציפי של זיהוי אושר באמצעות ורטרו-טרנספוזיציה מוסמכת ובונה חסרה ו חלליות Detect SNeo או neomycin ו גלובין אינטרון צומת 16. מתודולוגיה זו מהווה חלק מן החסרונות של מבחנים ורטרו-טרנספוזיציה מבוססת תרבית תאים, כגון הוספות מרובות, התנגדות מושבה והרחבת שיבוט חיובית.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labeling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x מאגר חסר צבע</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>Individual dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>התאם את הריכוז של dATP, dGTP, dCTP ל-2&nbsp; mM ו-dTTP עד 1.5&nbsp; mM במים ללא נוקלאז.</td></tr><tr><td>dUTP-16-ביוטין (0.5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&nbsp; mM)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&nbsp; mM)</td> ערכת תיוג דגים <td>של Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS ערכת תיוג דגים</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי MIRUS</td><td></td><td></td> MIR3225 <td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>ניתן להשתמש בכל מגיב נקי PCR במקום מכונת PCR של NucleoSpin PCR Clean Up</td></tr><tr><td>Kit PCR</td><td></td><td></td> ניתן <td>להשתמש בכל מכונת Thermocycler כדי להגביר את מוצר התווית.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">הכנת ממרחי כרומוזומים</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>הוספת קולצמיד ישירות למצע הגידול לריכוז סופי של 0.4&nbsp; ומיקרו; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>מדלל 1&nbsp; פתרון M KCl ל-75&nbsp; תמיסת mM להכנת תמיסה היפוטונית</td></tr>: <tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> קיבוע קרנוי <td>מערבבים 3 נפחים של מתנול ונפח אחד של חומצה אצטית להכנת תמיסת קיבוע קרנוי. הפוך טרי בכל פעם.</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>ממיסים את Hoechst-33342 ב-PBS לריכוז סופי של 1&nbsp; מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>Diamond Point Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>כדי לנטרל תאים, דגרו תאים בטריפסין למשך 5 דקות ולא פעילים עם נפח שווה של מדיה שלמה.</td></tr><tr><td>שקופיות כיסוי</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>צנצנות קופלין</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>בלוק</td><td></td><td></td> חום <td>ניתן להשתמש בכל בלוק חום למטרה זו, אם כי מומלץ להשתמש בלוקים המותאמים למגלשות חימום.</td></tr><tr><td>(600&nbsp; מ"ל)</td> <td>סיגמא</td><td>CLS1003600</td><td>מלאו את הכוס במים, חממו לרתיחה, השתמשו באדים החמים כדי לפוצץ כרומוזומים.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניקון</td><td>ניקון</td><td>125690</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ כדי להסתכל על איכות ההתפשטות.</td></tr><tr><td colspan="4" ><>ריאגנטים וחומרים חזקים לדגים</חזק></td></tr><tr><td>טריסודיום ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כרוריד</td><td>סיגמא</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>סיגמא</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>דטראן סולפט</td><td>סיגמא</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>סיגמא</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>זרע סלמון DNA</td><td>טכנולוגיות חיים&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול</td><td>סיגמא</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td></td> 322415-DPBS <td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>ממיסים את Hoechst-33342 ב-PBS לריכוז סופי של 1&nbsp; מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>גומי צמנט/איטום ציטובונד&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>שבע צנצנות קופלין Thermo</td><td>Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>תא לח כהה</td><td>סיגמא</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי שקופיות</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>יבש בלוק חום דיגיטלי</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x מלח-נתרן ציטראט (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>ערבבו 175 גרם NaCl, ו-88.2&nbsp; גרם טריסודיום ציטראט עם 800 מ"ל H2O. יש לערבב תוך התאמה ל-pH 7. לאחר שכל המלחים מתמוססים, כוונו את הנפח ל-1 ליטר וסננו דרך 0.22 ומיקרו; מ נייר סינון. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>1&nbsp; מ"ג/מ"ל של Rnase A</td><td></td><td></td><td>יש לדלל 20x SSC buffer למאגר SSC 2x. ממיסים RNase A במאגר SSC 2x לריכוז סופי של 1&nbsp; מ"ג/מ"ל. הכינו פתרון חדש בכל פעם.</td></tr><tr><td>1% פפסין</td><td></td><td></td><td>ממיסים פפסין (W/V) ב-10 מ"מ הידרוכלוריד לריכוז סופי של תמיסה של 1%. הפוך טרי בכל פעם.</td></tr><tr><td>4% פרפורמלדהיד (4% PFA)</td><td></td><td></td><td>שוקלים 4.0 גרם PFA בקולט אדים, מוסיפים 50 מ"ל של 1xPBS, מחממים ל-60&nbsp; &deg; C תוך כדי ערבוב והתאם את ה-pH עם טיפות NaOH עד שכל ה-PFA מתמוסס והתמיסה מתבהרת. כוונן את עוצמת הקול ל-100&nbsp; מ"ל, מסנן דרך 0.22 ומיקרו; m לסנן נייר ולאחסן 5 מ"ל ב-20&nbsp; &deg;C. הפשרה של PFA ב-37 &deg; C למשך 10-15 דקות לשימושים הבאים. התאם את גודל המסנן בהתאם לכמות הפרפורמלדהיד.</td></tr><tr><td>חוצץ</td><td></td><td></td> כביסה <td>שלבו 100 מ"ל פורממיד (20%) עם 2.5 מ"ל של 20x SSC, התאימו ל-pH 7 עם 1.0 M HCl והביאו את הנפח ל-500 מ"ל עם H2O בדרגה מולקולרית.</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> הכלאה <td>שלב 50% פורממיד, 10% דקסטרן סולפט, 0.1% SDS ו-300 ננוגרם/מ"ל DNA של זרע סלמון במאגר SSC 2x. כמות הפורממיד קובעת עד כמה כרומטידות ממוקדות; טיטרציה של הסכום.</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> זיהוי <td>מדלל 20x מאגר SSC ל-4x והוסף 0.2% Tween-20 כדי ליצור מאגר זיהוי.</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> חוסם <td>שלב 5% אלבומין בסרום בקר (BSA) עם 0.2% Tween-20 במאגר SSC 4x.</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> ייבוש <td>הכינו תמיסות אתנול של 70%, 80% ו-95%.</td></tr></tbody></table>

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה line-1 ברמת יחיד nucleus

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

יסוד גרעיני ארוך-1 (Line-1 או L1) מהווה כ-17% מה-DNA הקיים בגנום האנושי. בעוד שרוב ה-L1אינם פעילים עקב חיתוכים של 5', ~80-100 מהאלמנטים הללו נשארים מוכשרים לטרנספוזיציה ומתפשטים למקומות שונים ברחבי הגנום באמצעות חומרי ביניים של RNA. בעוד ש-L1 ישנים יותר מאמינים כי הם מכוונים לאזורים עשירים ב-AT בגנום, המטרות הכרומוזומליות של L1 חדשות ופעילות יותר נותרו מוגדרות בצורה גרועה. כאן אנו מתארים מתודולוגיית הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) שניתן להשתמש בה כדי לעקוב אחר דפוסים של החדרת L1 ושיעורי שילוב L1 חוץ רחמי ברמת הגרעין היחיד. בניסויים אלה, נעשה שימוש בבדיקות ניאומיצין המסומנות על ידי פלואורסצאין איזותיוציאנט/ציאנין-3 (FITC/CY3) כדי לעקוב אחר רטרוטרנספוזיציה של L1 במבחנה בתאי HepG2 המבטאים ביציבות L1 חוץ רחמי. מתודולוגיה זו מונעת טעויות בהערכת שיעורי הרטרוטרנספוזיציה הנוצרת על ידי רעילות ומסבירה את התרחשותן של החדרות מרובות לגרעין יחיד.

תרשים סכמטי של וקטור ורטרו-טרנספוזיציה L1 מוצג באיור 1. וקטור מורכב גן neomycin באוריינטציה antisense כדי ORFs L1 כי מופרעת על ידי אינטרון גלובין באוריינטציה השכל ליברפול זכתה SD ואתרי SA. כאשר משולבים ביציבות לתוך כרומוזום, L1 mRNA הוא עבד מן CMV המשולב אמרגן L1-5&#39;UTR (איור 1). במהלך עיבוד RNA, האינטרון גלובין עובר שחבור מתוך הגן neomycin. רנ&quot;א הניא L1 ארוז, translocate...

כאן אנחנו מעסיקים מתודולוגיה FISH לעקוב ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת הגרעינים היחידה בפערי כרומוזום של שורות תאי HepG2 להביע LINE-1 הסינטטי ביציבות.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדמיות ולניתוח של שיעורי ותבניות רטרוטרנספוזיציה של L-1 ברמת הגרעין הבודד באמצעות היברידיזציה של פלואורסצנציה במקום (fluorescence in situ hybridization), או FISH. היתרון המרכזי של מתודולוגיה זו הוא העובדה שהיא מאפשרת לחוקר להימנע מהערכת חסר או הערכת יתר של שיעורי ותבניות הרטרוטרנספוזיציה, וכאשר היא מושלמת במתודולוגיות אחרות, היא מאפשרת את חקר רטרוטרנספוזיציית L-1 ברמת הגרעינים הבודדים. את ההליך מבצעת כעת ד"ר Pasano Bojang, עמיתה בכירה במעבדה.כדי להתחיל, לאחר הכנת ג'ל אגרוז בריכוז של 0.7% עד 1% בבופר TAE בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש ב-CY3 או ב-FITC כדי לסמן את הגשש SNeo והדגר בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת בהתאם לפרוטוקול היצרן. ערבב את תמיסת הגשש SNeo המסומן עם 1X DNA loading buffer והעמס אותה לבארי הג'ל אגרוז. לאחר מכן, הרץ את הג'ל במתח של 75 עד 100 וולט למשך 15 עד 20 דקות.השתמש במאיר UV כדי להמחיש את פס הגשש. בעזרת להב נקי, גזור את גשש ה-SNeo המסומן מהג'ל. לאחר מכן, השתמש בערכה לניקוי PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן כדי להמיס ולטהר את גשש ה-SNeo.לאחר הניקוי, הרץ שוב חמישה µL של גשש מסומן SNeo יחד עם גשש SNeo לא מסומן על ג'ל agarose בריכוז 0.7% כדי לאשר את העלייה בגודל ואת הירידה בעוצמת האות. כדי לכמת את כמות גשש ה-SNeo המסומן, מדוד את הבליעה ב-260 nm ודלל את גשש ה-SNeo למנות של 10 ng/µL במים נקיים מנוקלאז. אחסן את המנות בטמפרטורה של 20- °C.לאחר יצירת שיבוטים יציבים המבטאים L-1 בעל יכולת רטרוטרנספוזיציה, או את שלד הווקטור, גדלו תאי HepG2 המבטאים באופן יציב את וקטור הבקרה או את L-1. הוסיפו 0.4 micrograms per milliliter של colcemid למצע התרבית. דגרו למשך 90 דקות כדי לעצור את התאים בשלב המטפאזה.השתמש ב-10 milliliters של 1X Dulbecco's PBS, או DPBS, כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסף תמיסת trypsin בריכוז 0.25% והדגר למשך חמש דקות. מצע המכיל 10% FBS הוסף כדי לנטרל את ה-trypsin.בשלב הבא, העבירו את התאים לשפופרת של 15 milliliters וסובבו בצנטריפוגה ב-1,000 Gs ובטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, שאבו את המצע ממעל למשקע התאים והשתמשו ב-DPBS כדי לשטוף את התאים. שאבו את כל ה-DPBS למעט 200 microliters, והשתמשו בו כדי להשעות מחדש את התאים באמצעות נקישה של השפופרת או פיפטינג עדין, כדי להבטיח שהתאים מעורבבים היטב ושאין ביניהם גושים.בעודכם מסובבים את המבחנה באופן אופקי, הוסיפו באופן של טיפה-טיפה חמישה מיליליטרים של תמיסה היפוטונית שחוממה מראש, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 120 Gs ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו את כל התמיסה ההיפוטונית למעט 200 µL.שטפו בתמיסת קיבוע שלוש פעמים, תוך השארת כ-200 microliters של תמיסת קיבוע בתאים בין השטיפות. לאחר שלושת השטיפות, ודאו שהמשקע נראה לבן ונפוח. לאחר מכן, השתמשו ב-200 microliters של תמיסת קיבוע Carnoy כדי לסבסב מחדש את המשקע, והשתמשו בתמיסת הקיבוע כדי לבצע את הדילוציות הבאות של התאים שסבסבו מחדש.טפטפו 10 µL מכל מהילה על תבנית זכוכית נקייה ויבשה מגובה של כסנטימטר אחד, וחשפו מיד את הצד ללא הפריסה של התבנית לאדים חמים של מים רותחים למשך 30 שניות. לאחר ייבוש הפריסות בטמפרטורת החדר, צבעו בעזרת תמיסת קיבוע המכילה DAPI והניחו זכוכית כיסוי. לאחר האינקובציה, שטפו את התבניות שלוש פעמים באמצעות DPBS.בכדי לבחון את הפריסות, השתמשו במיקרוסקופ ניגודיות מבוסס פלואורסצנציה בהגדלה של 40X. לאחר אופטימיזציה של הכנת הפריסות, אין צורך לצבוע אותן. כדי לסמן פריסות תקינות, השתמשו בטוש עם חוד יהלום בצדו הנגדי של השקף.כדי לייצב ולייבש פריסות של כרומוזומים בשלב המטאפאזה, יש להוסיף 200 µL של RNase A לדגימות ולהדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. יש לשטוף את השקופיות פעמיים עם 2X SSC למשך חמש דקות בכל פעם, ולשטוף את הדגימות עם 10 mM HCl. לאחר מכן, יש להוסיף 1% pepsin לפריסות ולהדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות.לאחר שטיפת השקופיות במים דה-יוניזים, שטפו את הדגימות פעמיים ב-2X SSC למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, הוסיפו 4% paraformaldehyde לפריסות והדגירו למשך 10 דקות, לפני ביצוע שתי שטיפות נוספות בבופר 2X SSC. לאחר שטיפות ה-SSC, ייבשו את הפריסות על ידי הדגרה של הדגימות למשך שתי דקות בכל שלב בסדרת האתנול הבאה.הוסיפו 30 nanograms של SNeo לתמיסת ההיברידיזציה וחממו בטמפרטורה של 72 °C למשך 10 דקות, ולאחר מכן קררו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לאחר מכן, טפטפו 30 µL של הגשוש SNeo על כל משטח, וכסו את הדגימה באמצעות זכוכית כיסוי. אטמו את הקצוות בעזרת דבק גומי, תוךما וידוא שלא נוצרו בועות.השאירו את השקופית על גוש חימום בטמפרטורה של 72 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הפחיתו את הטמפרטורה בהדרגה ל-37 °C. דגרו למשך לילה בחושך, בתוך תא לח, בטמפרטורה של 37 °C.כדי להחיל נוגדן משני, התחילו בטבילת השקופיות בבופר 2X SSC כדי להסיר את לוחות הכיסוי. לאחר מכן, טבלו את השקופיות ב-2X SSC בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך חמש דקות לשטיפה, לפני העברת הדגימות לבופר שטיפה ושטיפה פעמיים ב-45 degrees Celsius למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, טבלו את השקופיות בבופר 0.1X SSC בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך 10 דקות.לאחר מכן, שטפו את השקופיות בבופר 2X SSC בטמפרטורה של 45 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר קירור השקופיות לטמפרטורת החדר, עבור גששים מסומנים באופן ישיר, השתמשו ב-2X SSC לשטיפת השקופיות פעמיים, למשך חמש דקות בכל פעם. השרו את השקופיות בבופר גילוי למשך 10 דקות ב-RT. לאחר מכן, הוסיפו מדיום רכיבה המכיל DAPI ובצעו צביעה נגדית של הדגימות למשך 10 דקות.הצמדו זכוכית כיסוי והשתמשו בלק גוף כדי לאטום את הקצוות. לבסוף, נתחו רטרוטרנספוזיציה של L-1 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה בהגדלה של 40X. כפי שמוצג כאן, צפיפות פריסות כרומוזומי מטהפאזה נקבעה על ידי הכנת דילוסות והערכת כל פריסה מבחינת צפיפות, התפלגות ומרחק הפריסות מהגרעין.לניתוח המשכי נבחרו פריסות בצפיפות נמוכה עם התפלגות אחידה. תמונות אלו מייצגות פריסות כרומוזומים שנצבעו בצבע Hoechst DAPI, ואיכות הפריסות הוערכה על פי אורך הכרומוזומים, עגלות הפריסות והמרחק בין הכרומוזומים. כאשר תאים הודגרו למשך זמן קצר בתמיסה היפוטונית, פריסות הכרומוזומים הפכו לקשירות באופן הדוק והיה קשה להבחין בכרומוזומים בודדים.עם זאת, דגירה ממושכת יותר בתמיסה היפוטונית הובילה לrupture של הגרעינים, לפיזור של כרומוזומים ו/או לאובדן כרומוזומים. דגירות ממושכות יותר ב-colcemid הגבירו את מספר התאים בשלב המטפאזה, אך הובילו לעיבוי של הכרומוזומים. כפי שמודגם כאן, נמצא כי דגירה של 90 דקות ב-colcemid, 20 דקות בתמיסה היפוטונית ב-37 °C, ושימוש באדים חמים לפיצוץ התאים, הם התנאים האופטימליים להפקת פריסות (spreads) באיכות גבוהה.בניסוי זה, פריסות כרומוזומים נצבעו עבור רטרוטרנספוזיציה של L-1 באמצעות גששים המכוונים ל-SNeo. הגשש סומן הן ב-FITC והן ב-CY3 כדי להראות שבשני המקרים, רטרוטרנספוזיציה של L-1 נצפית רק בתאים המבטאים L-1 מסוג פראי (wild-type). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים ניסוי זה למעשה תוך שש עד שמונה שעות, במיוחד אם זמני ההיברידיזציה קוצרו לשעתיים עד ארבע שעות והפרוטוקול בוצע כהלכה.בעת ביצוע הטכנולוגיה, חשוב לשטוף ביסודיות, למטב את זמני ההיברידציה ולסמן כימית את גששי ה-dNTP כדי למנוע זיהום. כדי לענות על שאלות נוספות, כגון המיקום הכרומוזומלי של ההחדרה, ניתן לבצע טכנולוגיות נוספות כמו ריצוף L-1 ו-G-banding. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד לסמן את גששי ה-L-1, לבצע פריסות כרומוזומליות, ולמדוד תבניות ושיעורים של רטרוטרנספוזיציה של L-1 באמצעות טכנולוגיית fluorescence in situ hybridization.טכנולוגיה זו סללה את הדרך לחקר דפוסי רטרו-טרנספוזיציה של L-1 וכן לאתרי השתבשות של L-1. חשוב לזכור כי בעבודה עם חומרים רעילים, ריאגנטים ביולוגיים ואור אולטרה-סגול, נקיטת אמצעי זהירות כגון חבישת כפפות ושימוש בציוד מיגון היא חיונית.

analysis-of-line-1-retrotransposition-at-the-single-nucleus-level

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.

Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול טכניקת תיוג פסיפס המאפשרת ההדמיה של נוירונים נגזרו תא אב משותף בשני צבעים שונים. זה מקל על ניתוחי שושלת עצביים עם היכולת של נוירונים בודדים היכרויות לידת תפקוד גן הלומדים באותו נוירונים של אנשים שונים.

ניתוח שושלת תא ולימודי תפקוד גן באמצעות Twin-spot MARCM

כאן, אנו מתארים פרוטוקול המיפוי גנום רחב של אתרי אינטגרציה של מולוני Murine לוקמיה וירוס מבוססי וקטורים רטרוביראל בתאים אנושיים.

Retroviral סריקה: מיפוי MLV אתרי אינטגרציה להגדרת אזורים רגולטוריים ספציפיים לתא

פרוטוקול חזקים כדי לפקח אוכלוסיות עצבית על ידי זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה ואחריו-מבוססות תוכנה שלאחר עיבוד מתואר. שיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה לזיהוי אירועים הביולוגי בקרב אוכלוסיה הנבחר במהלך הניסויים הדמיה בשידור חי.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

אנו מציגים שיטה אוטומטית עבור שחזור תלת מימדי של Caenorhabditis elegans germline. השיטה שלנו קובעת את המספר והמיקום של כל גרעין בתוך germline ו ניתוחים germline חלבון הפצה, מבנה cytoskeletal.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

כאן, אנו מציגים גישה ביולוגית ואנליזות כדי לזהות את הביטוי LINE-1 ברמה מסוימת.

ה-RNA רצף הדור הבא וצינור ביואינפורמטיקה לזיהוי קו מבוטא-1s ברמה הספציפית לוקוס

מאמר זה מתאר מבנה פשוט המבוסס על ה-PCR כדי לנטר את הפעילות של כריכת שורות פעילה של קו 1 וכדי למפות דה נובו בגנום נתון. באמצעות קו התא MCF7, אנו מדגימים בזאת כיצד ניתן להחיל שיטה זו כדי לזהות פעילות של קו -1 ממוקם ב 22q 12.1.

זיהוי הפעילות הרטרוטרנספוזיציה של קו חם-1s באמצעות PCR הופכי למרחקים ארוכים

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

חקור רטרוטרנספוזיציה של LINE-1 ברמת גרעין יחיד בקווי תאי HepG2 באמצעות FISH. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של שיעורי הרטרוטרנספוזיציה ותבניות הפעילות הגנומית.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

גלה סרטונים נוספים