Name: הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: חקור ארגון מרחבי של מסלול איתות MAPK בתאי צמחים באמצעות מערכת הביטוי החולפת הטבק. שיטה זו מאפשרת ניטור אינטראקציות חלבונים דינמיות ומספקת כלים לניתוח תגובות תאיות לגירויים סביבתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל-Yumeng (Helen) Xia (אוניברסיטת ראטגרס) על עריכת כתבי היד. העבודה על היווצרות קוטביות BASL נתמכת על ידי מענקים מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של ארה"ב ל-J.D. (R01GM109080) ואוניברסיטת ראטגרס.

1. בניית פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור את המבנים באמצעות טכנולוגיית שיבוט כפי שתואר לעיל 1,6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית להשתמש DNA פולימרז באיכות גבוהה עם פריימרים מתאימים כדי להגביר את רצפי הקידוד של בזל, Yda ו MPK6 ותת-לשכפל אותם וקטורי כניסה. מצא את הפרוטוקול המפורט ב -7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור את גרסאות שלילי דומיננטי של MPK6 ו Yda (DNmpk6 8 ו DNyda 4, בהתאמה), השתמש פלסמידים כניסת MPK6 ו Yda כתבנית ולהציג את מוטציות נקודתיות לפי שיטה מכוונת mutagenesis באתר 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות את המבנים עבור מבחני חולף טבק, לנהל תקן LR (רקומבינציה attL x ATTR) תגובות (נוהל מפורט ב 7) לשלב בזל לתוך pH35CG 10, DNyda ו DNmpk6 לתוך pXNGW ו pXCGW וקטורים 11, בהתאמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את פלסמידים כתוצאה ידי עיכול וסדר אנזים. ברגע זהuccessful, להפוך את המבנים בינארי לתוך Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 12 ולגדל אותם על צלחות הבחירה ב 28 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 ימים. </li></ol></li></ol> 2. הכנת פתרון Agrobacterium הסתננות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבות Agrobacterium כמה שינו טרי לתוך 10 מ&quot;ל של לוריא- Bertani (LB) בינוני עם טיפול אנטיביוטי מתאים (gentamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, Rifamycin 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל, spectinomycin 100 מיקרוגרם / ml עבור pH35CG, pXNGW ו pXCGW בונה; הריכוזים אותו של gentamycin ו Rifamycin עם מיליליטר / מיקרוגרם 50 Kanamycin עבור P19 (לבטא חלבונים נגד השתקה מהונדסת) 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות Agrobacterium שייקר C 28 ° במהירות של 200 סל&quot;ד במשך כ -16 שעות ולאחר מכן למדוד את OD 600 (מוערך ל -1.5 - 1.8) (איור 2 א-ב). ספין למטה התרבויות ב 2500 XG במשך 10 דקות. Re- להשעות ו ווהsh את כדורי תא עם 10 מ&quot;מ של 2 MgCl (הפתרון הסתננות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התרבויות שוב מחדש להשעות את הכדורים עם כמות מתאימה של הפתרון החדיר להגיע OD הסופי 600 = 0.5 (איור 2 ג-ד). לפני שחדר צמחים, לעזוב את תערובות תא בטמפרטורת החדר למשך 1 - 3 שעות. פעולה זו מסייעת לשמור על הומאוסטזיס תא. </li></ol> 3. צמח טבק ליף הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צמחי טבק (ניקוטיאנה benthamiana), גדלו 4 - 5 שבועות בן בתא גידול צמחים סטנדרטי (23 ° C עם מחזורים של 16 שעות אור / 8 hr-כהה) 14 להזרקה עלה. הערה: בשלב זה, צמחי טבק בדרך כלל יש 6 עלים (2 גדולים, 2 בינוני, ו -2 קטנים). שני העלים והבינוניים הם האופטימליים ביותר להזרקת עלה (שני הגדולים הם זקנים מדי, בעוד שני הקטנים הם לעתים קרובות מדי צעירים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני יום הסתננות, להשקות את tobacצמחי שיתוף כדי להרוות את האדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום חדירה, טרום דגירה הצמחים בחושך במשך 1 - שעות 3. שלב זה מאפשר הפיוניות באפידרמיס לפתוח נרחב, אשר מאוד מקל על Agrobacterium כאשר חודר לתוך התאים באפידרמיס עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטות צבע שכותרתו עם תאריכים, דגל העלים כדי להיות שחדר. סמן את האזורים המיועדים הסתננו עם לנוכל עבה שחור (אופציונלי; האזורים הסתננו גלויים לאחר להידבק.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמויות שוות של מחדש ההשעיה Agrobacterium ומערבבים אותם בצלחת 100 x 15 מ&quot;מ פטרי ידי מתערבל עדין (איור 2E). הערה: במקרה שלנו, ערבבנו 1 מ&quot;ל של P19 עם 1 מ&quot;ל של CFP-בזל, 1 מ&quot;ל של DNyda-nYFP ו 1 מ&quot;ל של DNmpk-cYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתהליך של חדירה, למלא מזרק מחטים 3 מ&quot;ל עם תערובת חדירת (1 - 2 מ&quot;ל) ולדחוף לתוך הצד התחתון (abaxial) של העלה טבק (איור 2F). בעוד חדירה, זה מועילאחד להשתמש ביד לדחוף מצד שני לתמוך בצד העליון בעדינות (adaxial, מפני הכוח לדחוף). הערה: לאחר התערובת החדירה מוזרקת בהצלחה, האזורים הנגועים יהפכו קל לזיהוי באפידרמיס. עם זאת, החדירה עלולה להיכשל בשל הזרקה קשה (ניזק לרקמות) או לדחוף מספיק (אין חדירה נוזלית). עבור כל בדיקה, אנו מציעים לפחות שתי זריקות בשני עלים עצמאיים (מצמחים שונים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצמחים הנגועים בחזרה לתוך תא צמיחה. באופן כללי, ביטויי חלבון ניתנים לזיהוי לאחר החדירה הבאה 48 שעות. </li></ol> 4. הדמיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 חדירת שעות שלאחר, להשתמש מחורר שיחתוך דיסק עלה מאזור מוזרק (בדרך כלל 3 - 4 דיסקים / שטח יכול להיות מיוצר) (איור 2G). להשתמש בפינצטה כדי להעביר את הדיסקים עלה בעדינות לשקופית (הצד abaxial כלפי מעלה) ואת הר אותם עם טיפות מים. הימנע לחיצה מדי הרד על להחליק את המכסה כי סחט / תאים פגומים לא להראות טוב תחת מיקרוסקופ confocal (איור 2H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמית confocal, לסרוק את הדגימות הרכובות על מיקרוסקופ מתחם עלית ניאון כדי לבדוק את רמות הביטוי. הערה: בהתבסס על הניסיון שלנו, התאים המציגים רמות ביטוי ביניים מיוצגים הטוב ביותר תחת מיקרוסקופ confocal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם עדשת 40X (NA 1.3) על מיקרוסקופ confocal. התאם את השקופית למיקום הרצוי כך תאי מבטאי רמות בינוניות של חלבון פלורסנט להישאר במרכז. ספקטרום עירור / פליטה עבור CFP ו YFP הם 458 ננומטר / 480 - 500 ננומטר ו 514 ננומטר / 520 - 540 ננומטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;החי&quot; כדי לצפות בתצוגה מקדימה של תמונות ולאחר מכן להתאים עוצמת ליזר ורווח חכם עבור היחס עוצם / רעש קרינה המאוזן ביותר. כדי לשפר את איכות הדמיה, להגדיל פיקסלים סריקה ו / או מסגרת / קו ממוצע. לבסוף, להתאים את כפתור המיקוד כדי Reach המטוס החציוני מוקדים ולחץ על &quot;לכיד&quot; לקחת את התמונה. הערה: CFP ותמונות YFP ניתן ללכוד ברצף או בו זמנית על ידי סימון או ביטול האפשרות של מצב סריקה &quot;עוקב&quot;, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הקרנת Z היא רצויה עבור התצוגה המעמיקה של התאים, בחר במצב הדמיה &quot;xyz&quot;, להגדיר את עומק טווח הסריקה (10 - 15 מיקרומטר) ולאסוף את התמונות מהחלק העליון לחלק התחתון של תא המטרה . לקמפל את התמונות המתקבלות עם התוכנה ליקה על ידי לחיצה ימנית על קובץ התמונה כדי לבחור &quot;שינוי שם&quot; ותמונות יצוא כקבצי .tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה 30 - 40 תאים לניתוח כימות. </li></ol> עיבוד תמונה 5. וניתוח כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת פיג&#39;י (http://fiji.sc/Fiji) כדי לעבד תמונות ולערוך כימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרפים עוצמת הקרינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש טוב יותר אם ביטוי CFP / YFP הואמפוזרים באופן אחיד, להשתמש פיג&#39;י להפגין את עוצמת האות של CFP ו YFP לאורך הפריפריה התא. כדי להשיג זאת, הראשונה להשיק פיג&#39;י ולאחר מכן בחר &quot;קובץ&quot; ו &quot;פתח&quot; כדי להתחיל את התמונה. לחץ על &quot;קו&quot; בתפריט הכלי ובחר &quot;קו מקוטע&quot; על ידי לחיצה ימנית. החלט האזור של עניין ולשרטט קו לאורך בפריפריה התא להתחקות אחר CFP או האות YFP (איור 3A-C). הערה: פיג&#39;י מודד את ערך עוצמת קרינה המוחלט לאורך הקווים המפולחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התפריט הנפתח &quot;נתח&quot; &quot;פרופיל מגרש&quot; כדי ליצור גרף עם ערכי מיקום ועצמה המייצגים את הרמות של CFP / YFP לאורך הקו המפולח. אם תרצה, לשכפל את ערכי העצמה (על ידי בחירה בתפריט &quot;העתק&quot;) לתוך Excel או תוכנה גרפית אחרת כדי ליצור גרפים עוצמים דומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת תואר קוטביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף כ 20 represenתאי tative מן 3 ניסויים לשכפל להעריך את מידת הקוטביות של CFP ו YFP בתאי טבק. חשב את מידת הקוטביות מבוססת על היחס בין עוצמת קרינה הגבוהה (מוגדר H) על עוצמת הקרינה הנמוכה (מוגדר L). הערה: שיטת כימות מוסברת באיור 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את ערכי H ו- L, למתוח קו מקוטע לאורך האזור המעוניין בשולי התא (כמתואר לעיל), לחץ על &quot;נתח&quot; מהתפריט הנפתח, ולאחר מכן בחר &quot;מדוד&quot;. כאשר &quot;תוצאות&quot; חלון צץ, להשתמש &quot;Mean&quot; ערכים לבצע כימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מן התאים המציגים ביטוי אחיד יחסית של CFP ו YFP, למשל, CFP-בזל (איור 3 א) או YFP השלים מתוך שיתוף-ביטוי DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ב) יש לקבל את ערכי H ו- L על ידי מדידת שני אקראי שנבחרו מגזרים היקפיים עם אורך שווה. </li> &lt;li&gt; מן התאים המציגים הצטברות הקוטב ברור של חלבוני ניאון, במקרה זה, את שיתוף ביטוי CFP-בזל, DNyda-nYFP ו DNmpk6-cYFP (איור 3 ג), לאסוף את ערכי H מאזורי הפריפריה עם אותות הקרינה מועשר ואת Ls מהאזורים עם נמוכה / לא הצטברות קרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פינת היחסים כתוצאה של H / L מ -20 תאים יחד ולבדוק עבור התפלגות נורמלית. חשב את ערכי p על ידי מבחן t של סטודנט (עבור התפלגות נורמלית) או מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (KS) (לחלוקה הלא-נורמלי). </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BASL+controls+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis.</a> Cell. 137, 1320-1330 (2009).</li>
<li>Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAPKK+kinase+gene+regulates+extra-embryonic+cell+fate+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis.</a> Cell. 116, 109-119 (2004).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304, 1494-1497 (2004).</li>
<li>Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+expanded+roles+for+MAPK+signaling+in+Arabidopsis+stomatal+cell+fate+revealed+by+cell+type-specific+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations.</a> Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19, 63-73 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BASL+Polarity+Protein+Controls+a+MAPK+Signaling+Feedback+Loop+in+Asymmetric+Cell+Division%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division.</a> Dev Cell. 33, 136-149 (2015).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+Streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway%28R%29+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system.</a> Plant methods. 4, 4(2008).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+evidence+that+the+Arabidopsis+MAP+kinase+MPK6+is+involved+in+anther%2C+inflorescence%2C+and+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development.</a> J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated site-directed mutagenesis.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+transport+activity+by+heterotrimerization+of+Arabidopsis+ammonium+transporter+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo.</a> Plant Cell. 25, 974-984 (2013).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+agrobacterium+using+the+freeze-thaw+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method.</a> CSH protocols. 2006 (7), (2006).</li>
<li>Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> Plant J. 33, 949-956 (2003).</li>
<li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+Arabidopsis+plants%3A+growth%2C+preservation+of+seeds%2C+transformation%2C+and+genetic+crosses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).</li>
<li>Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+signaling+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell polarity signaling in Arabidopsis.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).</li>
<li>Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIN+phosphorylation+is+sufficient+to+mediate+PIN+polarity+and+direct+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).</li>
<li>Furutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar-localized+NPH3-like+proteins+regulate+polarity+and+endocytosis+of+PIN-FORMED+auxin+efflux+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers.</a> Development. 138, 2069-2078 (2011).</li>
<li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+localization+and+degradation+of+Arabidopsis+boron+transporters+through+distinct+trafficking+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).</li>
<li>Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OCTOPUS%2C+a+polarly+localised+membrane-associated+protein%2C+regulates+phloem+differentiation+entry+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 139, 1306-1315 (2012).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+stomatal+meristemoids+reveals+new+component+of+asymmetric+cell+division+and+commonalities+among+stem+cell+populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).</li>
<li>Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRX+mediates+feedback+between+brassinosteroid+levels+and+auxin+signalling+in+root+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth.</a> Nature. 443, 458-461 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כללי גלישה ו שינויים אפשריים של מערכת הביטוי החולפת טבק התמר אות: התבטאות יתר של חלבון פלואורסצנטי (FP) -tagged חלבונים באפידרמיס הטבק שמש בהצלחה לבדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון subcellular בתאי צמח. עם זאת, לומד הפצת איתות דינמית של מורכבות חלבון planta הוא נושא מאתגר בשל הקשרי subcellular מסובכים, אינטראקציה בין חלבונים חולפים ואירועים הולכים אותות. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו נצלנו את מערכת BiFC לבחון אירועי איתות MAPK. על ידי שיתוף להביע Yda-nYFP ו MP...

חלבוני אינטראקציה בתוך מתחמי רשת טופס היררכיים מסובכים כי לשחק תפקיד מרכזי כמעט כל תהליכים ביולוגיים המתרחשים בסביבת הסלולר צפויה. עם זאת, מן התפתחות צמח לתגובות צמיחה, חל חוסר כלים נוחים שיכול לא רק במהירות אלא גם ביעילות לזהות ולנטר איתות אירועים אלה דינמיים ברמת subcellular. מערכת ביטוי חלבון החולפת באפידרמיס עלה טבק מושכת יתרונות המאפשר הדמית חלבוני ניאון בתאים חיים. מערכת זו מספקת למחצה בתנאי vivo המאפשרים שלאחר translational שינוי חלבון ובדיקה מהירה של לוקליזציה חלבון. על ידי בחינת אות YFP השלימה את השלמת פלורסנט bimolecular (BiFC) assay מודיע האפשרות של אינטראקציה בין חלבונים בתאי צמח. בהשוואה לשיטות אחרות, למשל, שמרים ושתיים היברידיים (Y2H) ושיתוף-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC גם מספק אמצעי רב עוצמה של ביטוי חזותי תאים שבו אינטראקציות בין חלבונים עלולה להתרחש ברמה subcellular. בגלל חלוקת התא סימטרית (ACD) שומרת גזע אוכלוסיית תאים תוך יצירת סוגי תאים חדשים לייצור רקמות / איברים, זה מנגנון הכרחי לקידום רב-תאיות איקריוטיים. פיתוח הפיוניות ארבידופסיס נוצל בעבר כמערכת מודל לחקר ACD בצמחים. התא המבשר, התא האם meristemoid, מהחלק סימטרי לייצר שני לתאי בת אחרים, meristemoid (עובר גזע חטיבות דמויי תאים לפני הסיום לתוך זוג התאים שומרים) ו תא קרקע השושלת הפיוניות (SLGC) (עשוי להתחלק להתמיין תא מדרכה), בהתאמה (איור 1). בשנת הפיוניות ACD, שבירת חלבון הרומן של אסימטריה בשושלת הפיוניות (בזל) מקוטבת premitotically לנהוג סימטריות חלוקות, אשר incאסימטריה גופנית lude ואסימטריה תא גורל 1. אשד MAPK המורכב של תודה MAPKKK ואת MAPKs, MPK3 ו -6 הנו מכשיר מרכזי דפוסי חלוקת הפיוניות ואימוץ גורל 2,3, 4,5. לאחרונה, ג&#39;אנג et al. קשר בין בזל חלבון קוטביות אל מסלול איתות Yda-MAPK ארבידופסיס הפיוניות 6 ACD. מסלול יודה-MAPK הקנונית, דרך MPK3 / 6, phosphorylates בזל ומפעיל הקיטוב שלו. פונקציות בזל פוספורילציה כמו פיגום ומגייסת יודה (Yda) ו MPK3 / 6 להקים קומפלקס חלבון ולרכז את איתות לעבר התא בקליפת 6. קיטוב של רכיבים MAPK ואת לולאת המשוב החיובי בין בזל ואת מסלול Yda-MAPK מייצג מנגנון חדשני עבור קיטוב חלבון בתאי הצמח. מקומית איתות MAPK מועשרת שאמורות להיות קשורים קשר הדוק בידול גורל תא ב הפיוניות ACD 6 (איור 1). אחד kנתוני הניסוי EY שתמכו מודל זה בא מן מבחני טבק המצביעים על חלוקה מחדש של המרחב MAPKs המושרה על ידי ביטוי של בזל 6. באופן כללי, זה לא קל לעקוב אחר המקום שבו איתות MAPK מתרחשת משום מולקולות MAPK ולרוב מצאו מקום בתוך התא. במחקר זה, השתמשנו במערכת מפוצלת YFP לדמיין את האינטראקציה בין קינאז במעלה או במורד הזרם אלה להציע שבו ממסר איתות מתרחשת. בנוסף, אנו הרחבנו את השימוש במערכת BiFC ידי להביע שיתוף חלבון שלישי (CFP-tagged) עם זוג פיצול YFP (המרמז על אינטראקציה בין חלבונים) כדי לחזות האם וכיצד YFP השלים יכול להיות מווסת מרחבית על ידי השיתוף הביע חלבון CFP. בעשותם כך, הראינו כי שיתוף ביטוי של CFP-בזל המושרה מחדש המרחבי של אינטראקציות בין Yda ו MPK6, מן חלוקה שווה דפוסים מקוטב על קליפת התא של טבק epidermתאי al. מערכת זו ולכן יש פוטנציאל להתפתח לניטור אירועים איתות דינמי בתאי הצמח בתנאים כאשר תאים מאותגרים על ידי גירויים פנימיים או חיצוניים (כגון שיתוף ביטוי של חלבונים אחרים, יישום כימי, התקפה הפתוגן או שינויים סביבתיים, וכו &#39;. ).

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>pENTR/D/TOPO</td><td>Life Technologies</td><td>K2400-20</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange II XL ערכת מוטגנזה מכוונת אתר</td><td>Agilent Technology</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB אמרסקו</td><td></td><td>J106-2KG</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>AMRESCO</td><td>J673-1KG</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr><tr><td>ריפמפיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R3501-1G</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>K4000-25G</td><td></td></tr><tr><td>ספקטינומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<תת>2</תת></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 מ"מ שקופית</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 מ"מ זכוכית כיסוי</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר</td><td>Leica&nbsp;</td><td>TCS SP5 II</td><td>LAS AF Lite תוכנה</td></tr><tr><td>40X עדשה אובייקטיבית</td><td>Leica</td><td>HCX&nbsp; תוכנית APO&nbsp;</td><td>HCX&nbsp; תוכנית APO, NA 1.30</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>SORVALL 6 +</td><td></td></tr> <tr><td>מנקב חורים</td><td></td><td></td><td>סיכות</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות בז</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td></td></tr><tr><td>מס '5 מלקחיים</td><td>Canemco & Marivac</td><td>205EQA-מפרט</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות mapk שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

ויזואליזציה של אירועי איתות דינמיים בתאים חיים כבר אתגר. הרחבנו מערכת ביטוי חולף הוקמה, השלמה פלורסנט biomolecular (BiFC) assay בתאים אפידרמיס טבק, מאינטראקציה בין חלבונים בדיקות ניטור הפריסה המרחבית של הולכת אותות בתאי הצמח. בפרוטוקול זה, השתמשנו assay BiFC להראות כי האינטראקציה ואת האיתות בין יודה ארבידופסיס MAPKKK ו MAPK6 להתרחש קרום הפלזמה. כאשר בזל חלבון פיגום היה שיתוף הביע, האינטראקציה יודה-MAPK מחדש ושיתוף מקוטב מרחבית עם CFP-בזל. מערכת ביטוי טבק מהונדס זה מאפשרת בדיקה מהירה של איתות שינויי לוקליזציה ודינמית (פחות מ -4 ימים) והוא יכול להכיל מספר רב של צבעי חלבון פלואורסצנטי (לפחות שלוש). גם הצגנו שיטות מפורטות לכמת הפצת חלבון (לוקליזציה מרחבית סימטרית, או &quot;קיטוב&quot;;) בתאי טבק. יש מערכת ביטוי טבק מתקדמת זו יש פוטנציאל להיות בשימוש נרחב לבדיקה מהירה של אירועי איתות דינמיים בתאי צמח חיים.

כדי למנוע מוות של תאים המושרה על ידי איתות MAPK היפראקטיבי, הגרסאות פעיל קינאז של Yda (DNyda) ו MPK6 (DNmpk6) ששימשו assay שיתוף ביטוי בתאים טבק. לא האינטראקציה בין DNyda ו DNmpk6 נחשף על ידי BiFC ולא CFP-בזל עצמו שנוצר דפוס הפצה אחידה (איור 3A-B). עם זאת, כאשר CFP-בזל הוכנס זוג אינטראקציה DNyda-DNmpk6, הן CFP אותות YFP היו מחדש כדי באופן מקוטב מאוד (איור 3 ג). חלוקה מחדש הדבר מצביע על כך בזל אינטראקציה עם Yda ו MP...

ברמה התת-תאית, אירועי איתות מווסתים באופן דינמי על ידי רמזים התפתחותיים וסביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המשתמש במערכת הביטוי החולפת של הטבק כדי לנטר אינטראקציה דינמית של חלבון-חלבון ולחשוף ארגון מרחבי של העברת אותות בתאי צמחים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדמיות של התפלגות מרחבית דינמית של חלבון

imaging-spatial-reorganization-mapk-signaling-pathway-using-tobacco

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

עבודה זו מתארת ​​את שיטה חדשה למיקוד סלקטיבי אברונים subcellular בצמחים, assayed באמצעות BioRad ג'ין האקדח.

ביטוי גנים חולף בטבק באמצעות גיבסון הרכבה והאקדח הגן

היווצרות של קומפלקסי חלבוני in vivo ניתן דמיינו ידי שלמת הקרינה bimolecular. שותפי אינטראקציה הם התמזגו לחלקי משלימים של תגי ניאון והביעו transiently בי טבק, וכתוצאה מכך אות ניאון מחדש על סמיכות של שני חלבונים.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

שעון הסגמנטציה מניע ביטוי גנים תנודתי על פני המזודרם הקדם-סומיטי (PSM). פעילות חריץ דינמית היא המפתח לתהליך זה. אנו משתמשים בהדמיה וניתוחים חישוביים כדי לחלץ דינמיקה זמנית מנתוני ביטוי מרחבי כדי להוכיח שביטוי ליגנד דלתא וקולטן Notch מתנדנד ב-PSM של בעלי חוליות.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיה optogenetic כדי לווסת מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAPK) פעילות במהלך התמיינות תאים והתפתחות עובריים Xenopus . שיטה זו מאפשרת הפעלה הפיכה של המסלול איתות MAPK בתרבית תאים יונקים ועל אורגניזמים חיים תאיים, כמו עוברי Xenopus , עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.

ארעי ביטוי טבק Benthamiana משאיר לייצור טריטרפן בקנה מידה מפוח

הליך זה מוצג להמחיש החלבון קינאז פעילות בעכברים קבועים ומתנהגים. כתבת הפעילות המשופרת של א-קינאז, tAKARα, מתבטאת בנוירונים בקליפת הגולגולת והפכה לנגישה להדמיה דרך חלון גולגולתי. מיקרוסקופ הדמיה של שני פוטון באורך החיים משמש כדי להמחיש פעילויות PKA ב vivo במהלך תנועה נאכף.

ויזואליזציה של חלבון קינאז פעילות בראש-קבוע עכברים התנהגות באמצעות Vivo Two-פוטון מיקרוסקופ החיים הדמיה מיקרונטית

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

היכולת לסמן באופן קבוע תאי גזע וצאצאיהם באמצעות פלואורופור באמצעות קו עכברים מהונדס בלתי ניתן להשראה מאפשרת ניתוח מרחבי וזמני של הפעלה, התפשטות, נדידה ו/או התמיינות in vivo. מעקב אחר שושלת יכול לחשוף מידע חדש על מחויבות לשושלת, תגובה להתערבויות ורב-תחומיות.

מעקב אחר שושלת של תאי גזע בעלי תווית פלואורסצנטית אינדוקטיבית במוח העכבר הבוגר

מספר שיטות נפוצות מוצגות כאן כדי לחקור את אירועי הסחר בקרום של קולטן פלזמה קינאז. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים מפורטים הכוללים את הכנת החומר הצמחי, טיפול תרופתי ומערך הדמיה קונפוקלית.

שיטות מבוססות תמונה לחקר אירועי סחר בממברנות בתאי שושלת סטומאטלית

חקור ארגון מרחבי של מסלול איתות MAPK בתאי צמחים באמצעות מערכת הביטוי החולפת הטבק. שיטה זו מאפשרת ניטור אינטראקציות חלבונים דינמיות ומספקת כלים לניתוח תגובות תאיות לגירויים סביבתיים.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

גלה סרטונים נוספים