Name: ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של PilG ב Fastidiosa Xylella (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: חקור תנועתיות מפרכסים ב-Xylella fastidiosa באמצעות תא זרימה ננו-מיקרופלואידי. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועת חיידקים ומאפיינת את תפקיד הגן pilG בפתוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה מומן על ידי מחלקת החקלאות של ארצות הברית, שירות המחקר החקלאי. שמות מסחריים או מוצרים מסחריים בפרסום זה מוזכרים אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות ארצות הברית. USDA היא ספקית שוויון הזדמנויות מעסיקה.

1. פרינג ההיקפיים של מושבת חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול X. fastidiosa (XF) טמקולה סוג בר 22, מוטצית מחיקת pilG XF ΔpliG (באמצעות אסטרטגית מחיקה שתוארה לעיל 23), ו -C XfΔpliG המשלה (באמצעות שתואר לעיל אסטרטגיה שלמה גנטי מבוסס כרומוזום 24) על צלחות אגרו בינוני PD2 25 על 28 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלופן החיטוי (1 x 1 ס&quot;מ 2) במים ב 121 ° C (249 ° F) במשך 15 דקות. תרימי חתיכה אחת של צלופן, לנקז את המים על ידי נגיעה בפינה אחת של צלופן על צלחת פטרי ריקות, בזהירות להניח את הצלופן מעל 15% של השטח אגר ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים X. פרט מושבות fastidiosa עם סטרילי קיסמים מעוגלים ותא נקודה בסביבה נקיה מחיידקים על גבי גיליון מעוקר של צלופן המעולף על 15% של שטח אגר הצלחות אגרו. דגירה את הצלחתs ב- C ° 28 במשך 2-3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את מורפולוגיה קץ המושבות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם עדשת 2X אובייקטיבית עדשה 10X עינית. צלם את השוליים היקפי סביב מושבות. </li></ol> 2. צ&#39;יימברס זרימה מיקרוסקופים Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק מכשירי microfluidic באמצעות נהלי צילום ליתוגרפיות דומים לאלה שתוארו קודם לכן 5,18. תכנון ארבעה ערוצים מקבילים עם תוכנת תכנון בעזרת מחשב על פרוסות סיליקון מאסטר בשיטות ליתוגרפיות תקן 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור לתאי microfluidic מאדון פרוס סיליקון עם polydimethylsiloxane (PDMS). יוצקים PDMS unpolymerized כלפי מאמן פרוסות סיליקון ולרפא אותו ב -60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לקלף את העתק PDMS מן האדון רקיק וקוצצים את העתק PDMS עם להב לתוך 22 מ&quot;מ x 40 מ&quot;מ בגודל זהה של coverslip זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את העתק PDMS, coverslip זכוכית (22 x 40 מ&quot;מ 2), וכן microscשקופית אופ (51 x 76 מ&quot;מ 2) לפלזמה האוויר של 30 וואט למשך 2 דקות 27. סנדוויץ הגוף PDMS בין coverslip זכוכית מיקרוסקופ זכוכית לבנות תא uidic fl מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקדוח חור (5.5 מ&quot;מ קוטר) דרך PDMS בכל קצה של ערוץ בדוגמת. חותכים את צינורות סיליקון גומי לתוך ארוך 12-20 ס&quot;מ. הכנס קצה אחד של צינור גומי סיליקון (5.1 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 2.1 מ&quot;מ קוטר פנימי, 0.8 קיר מ&quot;מ) לתוך בכל קצה הפתיחה של הערוצים של העתק PDMS, וסוגרים אותו עם PDMS unpolymerized ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר קצה אחר של הצינור עד הסוף הדוקרני של מחברי luer פלסטיק. עוטפים את תאי microfluidic התאספו עם רדיד אלומיניום ו החיטוי אותם במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאי חיידקים של X. סוג בר fastidiosa, מוטציה XF ΔpliG, ו XfΔpliG -C משלימים באמצעות גירוד, באמצעות inoculating הפנויה לולאות מצלחות בינוני PD2. התאם צפיפות התאיםכדי צפיפות אופטית של 0.05 ב 600 ננומטר במרק PD2 כפי שתואר קודם לכן 23. לאסוף את הפתרון תא החיידק לתוך מזרק 1 מ&quot;ל gastight. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המכשיר microfluidic על הבמה מיקרוסקופ הפוכה. חברו צינור היניקה אל מזרק 5 מ&quot;ל gastight המכיל מרק PD2. התאימו את מזרק 5 מ&quot;ל gastight עם משאבות מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את צינור מוצא למאגר הפסולת. יש לשמור על קצב זרימה בינונית של 0.2 דקות μl -1 למשך 30 דקות כדי לייצב את המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר צינורות-כניסת צד מזרק 1 מ&quot;ל gastight המכיל את פתרון תא החיידק. שטוף את פתרון תא החיידק דרך צינורות הגומי עד הערוץ הוא הגיע. יש לשמור על קצב זרימה בינוני של 0.2 דקות μl -1 עבור 30 דקות אחרות כדי לשטוף תאים מאוגדים מהאולם לפני לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תריס מיקרוסקופ תחת במשרה מותאמת השדה של המיקרוסקופ לשלוט האור. חבר את התריס כדי שיתוף התריסמערכת ntrol ולחבר את מערכת בקרת תריס למחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מצלמה דיגיטלית ליציאת וידאו של המיקרוסקופ ולחבר אותו למחשב. הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה &quot;תריס&quot; מהתפריט, ולהכיר את התריס מותקן באופן אוטומטי כברירת מחדל בתוכנה כדי ליצור חיבורים אל התריס עם התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את פונקציית &quot;מצלמה דיגיטלית&quot; מהתפריט של תוכנת הצריבה לשגות הזמן להכיר את המצלמה הדיגיטלית באופן אוטומטי כהתקן לכידת ברירת המחדל בתוכנה ליצור תקשורת עם מצלמה דיגיטלית עם התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר תאים חיידקיים באחד הערוצים באמצעות 20X אופטיקה שלב בניגוד, ואז לעבור העדשה אובייקטיבי 40X לפני לכידת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת הצריבה זמן לשגות, בחר את הפונקציה &quot;רכישת התמונה&quot; באמצעות פרמטרים של ברירת מחדל מהתפריט לרכוש את התמונות מן מיקרוסקופ.לאחר מכן, לפתוח את פונקצית &quot;רוכש זמן לשגות&quot; ולהגדיר את מרווח הזמן עד 30 שניות 5,18,28 של משך 6-24 שעות תלוי ניסוי צריך לראות את התנועה מתעוות של X. fastidiosa 5,18,28. לחץ על &quot;אישור&quot; כדי להתחיל את ההקלטה זמן לשגות. לחץ &quot;סטאק פונקציה&quot; מהתפריט, בחר &quot;שמירה בשם&quot; לערום את התמונות בתיקיית היעד במחשב לאחר שסיים את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מספר רב של ערוצים, ללכוד תמונות זמן לשגות מהערוץ הראשון כל 30 שניות במשך 6 שעות. הזז את העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ לערוץ הבא כדי לאתר את תאי היעד. חזור על הפונקציה זמן לשגות כמתואר לעיל כדי ללכוד תמונות בכל אחד ברצף ארבעה ערוצים אם הניסוי מוגדר לנצל ארבעה ערוצים. המשך לכידת תמונה זמן לשגות עבור כל עוד שלושה ימים רצופים. כל הניסויים בוצעו בטמפרטורת החדר (23 ± 2 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקמפל את זמן לשגות תמונות לתוךקובץ וידאו באמצעות תוכנת הדמיה הקלטה זמן לשגות. הפעל תוכנת צריבת הזמן לשגות, לחץ על &quot;פונקצית סטאק&quot; מהתפריט, ובחר &quot;פונקציה גרם פתוחה&quot; כדי לפתוח את הקבצים המוערמים מהמחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את &quot;הסרט הפוך&quot; פונקציה ממודול מחסנית, בחירת כל התמונות ובחירת פורמט &quot;AVI&quot; פלט. לחץ על &quot;שמירה בשם&quot; כדי לשמור את קובץ הווידאו בתיקיית היעד במחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר סרטים מלוקט מתוך תיקיית היעד במחשב ולשחק בהם. לאחר מכן, לבחון את תנועתיות של תאים בודדים באמצעות ויזואליזציה וכתוצאה מהפעילות מתעוות תנועתיות של תאי חיידקים קבצי וידאו שנוצר. </li></ol>

<ol><li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li>
<li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%2C+a+regional+problem+or+global+threat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li>
<li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xylella+fastidiosa%3A+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li>
<li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+pili+and+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li>
<li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility%2C+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li>
<li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li>
<li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li>
<li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li>
<li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9(2001).</li>
<li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-dependent+%27stick-and-roll%27+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li>
<li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li>
<li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion%2C+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li>
<li>Thomas, W. E. Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion. Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. Toronto, Ontario, Canada, , 751-759 (2005).</li>
<li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li>
<li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li>
<li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li>
<li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li>
<li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Operon%2C+Pil-Chp%2C+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li>
<li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemoreceptors%3A+High-performance+signaling+in+networked+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li>
<li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li>
<li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa%3A+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li>
<li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li>
<li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+Media+for+the+Pierce%27s+Disease+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Mater.+Sci%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li>
<li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-%28dimethylsiloxane%29+and+their+chemical+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li>
<li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

במחקר זה, אנו שאפיינו את התנהגות התנועה של X. fastidiosa PilG מוטציה XF ΔpilG וללחצים XfΔpilG- C משלים שלה החדש תוכנן מרובים מיקרו במקביל ננו-ערוץ fl תאי uidic. קלי FL מייקרו החדש תוכנן תאי uidic יכולים להכיל עד ארבעה תאים במקביל 100 מיקרומטר ערוצי ננו רוחב לעומת עיצובים קודם לכן עם ערוץ רחב אחת בלבד 50 מיקרומטר 18. הערוץ-ננו רחב יותר המשופר מקלת כניסתה של תאים חיידקיים עם הזורם של התקשורת. בנוסף, תא מיקרופלואידיקה זה הוא 1) ...

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי, פתוגניים הגורם למספר מחלות יבול חשיבות הכלכלית, כולל המחלות של פירס גפן (ותטיס vinifera ל) 1,2, 3. חיידק זה מוגבל עצת ניצוח המים כלי. זיהום של גפן גורם סתימה של צינורות עצה ותוצאות לחץ מים חסרים תזונתי 3. הקולוניזציה מוצלח תלוי ביכולת של החיידק לעבור מהאתר הראשוני של הידבקות לשאר הצמח 3. מתעוות תנועתיות הוא אמצעי תנועת חיידקים עצמאי-flagellar באמצעות הרחבה, מצורף, ההכחשה של פילי IV הסוג קוטבי 4 כי כבר מאופיין ב X. fastidiosa 5,6,7. תנועתיות מתעוות נצפתה על ידי פינצטה לייזר ו במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 8,9,10. שימוש בשיטות אלה, tmotilities הכישוף שנוצר על ידי pilus IV סוג של נ gonorrhoeae ו פ aeruginosa התאפיין פילי תיוג uorescently fl לכידות תנועותיהם מיקרוסקופיות. למרות שני השיטות שפרטו הכח הדבק של חיידקים בודדים, הנהלים הם מסובכים וגוזל זמן 9,10. תאי uidic מיקרו fl שימשו להתבונן הגירה למרחקים ארוכים של תאים בודדים, כמו גם אגרגטים קטנים של תאים חיידקיים 5,6. תאים אלו עוצבו כמו ערוצי microfabricated-ננו צלחת משולבת עם 11,12,13,14 מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה. מייקרו fl מכשירים הקאמריים uidic מציעים כמה יתרונות ללימוד התנהגות תנועת תאי תאי האינטראקציות של חיידקים: (i) הוא מספקת פלטפורמה משולבת עם יכולות ערוץ מרובות; (Ii) זה יכול לבחון את תנועות ו מצבורים של תאים בודדים של תכונות בקנה מידה ננו של חיידקים; (Iii) הוא מאפשר מטר ישירהקלטה תמונה icroscopic של תאים חיידקיים וניתוח זמן לשגות, (iv) שהיא מספקת תצפיות במרחב ובזמן לטווח ארוך של הפרט / או אוכלוסיות של חיידקים בסביבה-מיקרו; (V) את קצב הזרימה של מדיום תרבות ערוץ ניתן לשלוט באופן מדויק ו (vi) רק נפח קטן מאוד (1 מיליליטר) של מדיום התרבות נדרש עבור כל ניסוי. לאחרונה, מיקרו fl uidic fl ow מערכת הועסק לחקור את ההתנהגויות של תאים חיידקיים תחת microenvironments שונים 14,15,16. הדביק ואת מצורף המשטח של E. 15 coli, X. fastidiosa 16, ו Acidovorax citrulli 14 משטחי זכוכית הוערכו באמצעות תאי מיקרו fl uidic. ההצטברות וביו בקולנוע היווצרות בתיווך פילי סוג IV של citrulli Acidovorax נותחו 14. יתר על כן, ההצעה של א citrulli שרואים בזמן fl ow גonditions הוכיח כי פילי הסוג IV עשויים לשחק תפקידים חשובים קולוניזציה ולהפיץ של א citrulli ב צינורות העצה תחת SAP fl ow תנאים. Motilities והמרטיט של Pseudomonas aeruginosa ו X. תאי fastidiosa נצפו בהצלחה נגד זרם נוזל בתוך תא זרימת microfabricated 5,6,17. IV pilus סוג לוקה מוטציות pilB ו pilQ של X. fastidiosa נמצא עמוקות לשנות את המהירות של מתעוות תנועתיות בתנאי הזרימה בהתקני uidic fl מיקרו 5,6,18. המחקרים שנערכו על הידבקות חיידקים תנועתיות בהתקנים מיקרו fl uidic ציינו כי fl מיקרו תאי uidic מתאימים במיוחד לניתוח תנועתיות לפרכס נדידת חיידקים בתיווך פילי במבחנה. תוצאות אלו מסבירות את מנגנון ההעברה בתיווך מתעוות המאפשר מצורף תאי תאים, צבירת קולוניזציה בתוךהמארח, בסופו של דבר להוביל לזיהום סיסטמי. פיל-CHP אופרון של X. fastidiosa מכיל pilG, פילים, pilJ, גלולה, chpB ו chpC מקודדי אות התמר מסלולי 20. וכימיים הטרנסממברני להיקשר לגירויים כימיים בתחום periplasmic ולהפעיל מפל איתות חלק cytoplasmic שלהם בסופו של דבר לשלוט תנועתיות מתעוות חיידקים. בשנת אופרון Pil-CHP של X. fastidiosa, PilG חלבון phospho-הסעות הוא homologue כדי סטרייצ&#39;י. בתוך א &#39; coli ו פ aeruginosa, סטרייצ&#39;י הוא הרגולטור בתגובה במערכות chemotaxis כי אינטראקציה עם החלבונים המנועים שוטונים 19, 21. למרות התרומות של אופרון Pil-CHP כלפי ארסיות X. fastidiosa נבחנו לאחרונה 20, תפקיד pilG ב אופרון chemotaxis בתגובה לאותות סביבתיים פילי IV סוג מוסדר / מנוע של X. fastidiosa הוא UNCליר. כדי להבהיר את התובנה של chemotaxis הרגולטור pilG בפעילות של תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa, תא מיקרו fl uidic משמש כדי להעריך את תנועתיות ומרטיט של X. fastidiosa. PilG של fastidiosa X. מאופיין על ידי השוואת פנוטיפים של מוטציה המחיקה XF ΔpliG, -C XfΔpliG זן משלימה סוג בר שלו במבחנה. התוצאות ממחישות את תפקידו של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>Biology materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., et al., 2004 22</td></tr><tr><td>pilG מוטציה מחיקה Xf&Delta; pliG</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., et al., 2007 26</sup</td></tr><tr><td>>pilG זן משלים Xf&Delta; pliG-C&nbsp;</td><td></td><td></td><td>דייוויס, מ. ג'יי, et al. 1998 23</sup</td></tr><tr><td>>חומרים וציוד פיזיקליים </חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>לולאות חיסון חד פעמיות</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>הליכים כמותיים כגון איסוף חיידקים</td></tr><tr><td>פולידימתילסילוקסן (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 סיליקון ערכות אלסטומריות</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 מצלמה דיגיטלית</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>תמונה, הקלטת וידאו ומדידה&nbsp;</td></tr><tr><td>קו צינורות</td><td>אדג'ווד, ניו יורק</td><td></td>#T4300 <td>מחובר למזרק ולתא המיקרופלואידי</td></tr><tr><td>מחברי לואר פלסטיק</td><td>אדג'ווד, ניו יורק</td><td></td><td>מחובר למזרק ולתא המיקרופלואידית</td></tr><tr><td>משאבות מזרק</td><td>פיקו פלוס, מכשיר הרווארד, MA</td><td>#702209</td><td>ניתן לכוונן את קצב הזרימה בזמן שהמשאבה פועלת.</td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>אטומים לגז, חברת Hemilton, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>מספקים את המרק הזורם</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אולימפוס IMT-2 הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>תצפית והקלטה של</td></tr><tr><td>תמונה מצלמה דיגיטלית SPOT-RT</td><td>מכשירי אבחון, בע"מ, MI</td><td>RT230</td><td>תמונה, הקלטת וידאו ומדידה</td></tr><tr><td>תריס מיקרוסקופ</td><td>הUNIBLITZ, US</td><td>#LS2T2</td><td>מצלמת בקרה' s זמן חשיפה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ מערכת בקרת תריס</td><td>UNIBLITZ, US</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 ערוץ יחיד CE/UL/CSA מנהל התקן תריס מאושר</td></tr><tr><td>MetaMorph תוכנת תמונה</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>עיבוד תמונה ברזולוציה גבוהה בזמן אמת&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; pilg</em&gt; ב<em&gt; fastidiosa xylella</em

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Fastidiosa Xylella הוא חיידק שאינו והולקה בשוט גראם שלילי הגורם למספר מחלות חשיבות הכלכלית של צמחים. תנועתיות מתעוות מספקות X. fastidiosa אמצעי לתנועת תוך צמח למרחקים ארוכים והתנחלות, תורם כלפי פתוגניות ב X. fastidiosa. תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa מופעל על ידי פילי מסוג IV. סוג IV פילים של fastidiosa Xylella מוסדרים pilG, רגולטור chemotaxis בחלבוני קידוד אופרון Pil-CHP כי הם מעורבים עם מסלולי העברת אותות. כדי להבהיר את התפקידים של pilG ב תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa, pilG -deficient מוטציה XF ΔpilG ומתח המשלים XfΔpilG- C המכיל יליד pilG פותחו. תאי microfluidic משולבים עם מערכת הקלטת הזמן לשגות תמונה שמשו לראות את התנועה מרטטת XfΔpאילג, XfΔpilG- C ומתח סוג הבר שלה. באמצעות מערכת הקלטה זו, הוא מתיר תצפיות במרחב ובזמן ארוך טווח של צבירה, הגירה של תאים בודדים ואוכלוסיות של חיידקים באמצעות תנועתיות מתעוות. X. סוג בר fastidiosa ו XfΔpilG- C זן משלימים הראה המאפיינים תנועתיות מתעוות טיפוסי לצפות ישירות בתאי זרימה microfluidic, בעוד מוטציה XfΔpliG הציג את הפנוטיפ לקוי מתעוות. מחקר זה מוכיח כי pilG תורמת תנועתיות והמרטיטה של X. fastidiosa. תא הזרימה microfluidic משמש כאמצעי להתבוננות תנועתיות מתעוות.

הנוכחות של מיעוט המושבה היקפי מעיד על תנועתיות מתעוות סוג IV בתיווך pilus, נצפתה במושבות של X. סוג בר fastidiosa ומתח XF ΔpliG -C משלים (איור 1). Mutant XfΔpliG, לעומת זאת, לא להפגין שוליים סביב בפריפריה של מושבות (איור 1). זמן לשגות הדמיה של תאים חיידקיים בתאי תזרים ננו-microfluidic גילה כי תנועתיות מתעוות נצפתה בשני X. סוג בר fastidiosa ואת (V1 משלימה...

במחקר זה, תא זרימת ננו-microfluidic הועסק לדמיין והן מבחינה תפקודית לאפיין את תנועתיות והמרטיטה של Xylella fastidiosa, חיידק הגורם למחלה של פירס גפן.

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; PilG</em&gt; ב<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לאפיין תפקודית את הגנים האחראים לתנועת התזזית (twitching motility) של חיידקים, באמצעות תא זרימה מיקרופלואידי ננומטרי המשולב עם מערכת להקלטת תמונות במרווחי זמן (time-lapse). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח לגבי פנוטיפ של חיידקים ותפקוד הגנים הקשורים אליו, כגון תנועת התזזית של חיידקים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת תצפית מיוחדת ומתוכננת של נדידת אגרגציה של תאים בודדים ואוכלוסיות. את ההליך זה תדגים ד"ר Xiangyang Shi, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. באמצעות אסטרטגיית מחיקה סטנדרטית, גדלו את זן הבריי (wild-type) של Xylella fastidiosa מסוג Temecula, גדלו מוטנטים עם מחיקה של pilG, וגדלו את הזן המשלים, כולם על מצעי אגר של מדיום PD2. דגרו את החיידקים בטמפרטורה של 28

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנחנו כאן להמחיש כיצד להשתמש אלקטרונים cryotomography (ECT) כדי ללמוד את ultrastructure של תאים חיידקיים של כמעט ילידי מדינות, כדי "macromolecular" (~ 4 ננומטר) החלטה.

אלקטרונים Cryotomography של תאים חיידקיים

הקלטה התנהגות תאיים ב Myxococcus xanthus Biofilms באמצעות זמן לשגות Microcinematography

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

טרנסלוקציה של אפקטור לתאי מארח באמצעות מערכת הפרשה מסוג III היא אסטרטגיית אלימות נפוצה בקרב חיידקים גרם שליליים. יושם מבחן מבוסס היתוך אפקטור בטא-לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה. בתאים נגועים בירסיניה, ההמרה של מדווח FRET על ידי הבטא-לקטמאז מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

ב פרוטוקול זה, שכותרתו fluorescently ט cruzi הוזרקו לזחלים דג זברה שקוף, טפיל תנועתיות נצפתה ויוו באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון זריחה.

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

תאים חיידקיים במרחב מאוד מאורגנים. כדי לבצע את הארגון הזה לאורך זמן בתאים Myxococcus xanthus גדל לאט, פותחה מלכודת קרינה פלואורסצנטית הדמיה לחיות תאים עם רזולוציה גבוהה ייתכן במשך מספר דורות. באמצעות שיטה זו, ייתכן הדינמיקה של חלבונים חשובים על כרומוזום סגרגציה ועל חלוקת התא יכול להיקבע.

קרינה פלואורסצנטית Live-תא הדמיה של שלמה וגטטיבי תא מחזור של חיידק חברתית גידול איטי Myxococcus xanthus

הדמיה של תאים חיידקיים היא גישה ביולוגיה מערכות מתפתחים התמקדו הגדרת תהליכים סטטיים ודינאמיים המכתיבים את הפונקציה של מכונות macromolecular גדולות. כאן, שילוב של הדמיה תא כמותי לחיות וטומוגרפיה מסוג ההקפאה משמשת לחקר הלגיונרים האלה הפרשת מערכת הפרשה ופונקציות.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה ויעילה לזיהוי גורמים גנטיים המעורבים בסוגים שונים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa.

שיטה בעלת תפוקה גבוהה להתבוננות בפנוטיפים של תנועתיות ב-Pseudomonas aeruginosa

חקור תנועתיות מפרכסים ב-Xylella fastidiosa באמצעות תא זרימה ננו-מיקרופלואידי. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על תנועת חיידקים ומאפיינת את תפקיד הגן pilG בפתוגנזה.

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של

גלה סרטונים נוספים