כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral

אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכמת באופן אובייקטיבי ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הבסיסי והפתולוגיה האבחנתית, כגון כיצד חלבונים משנים ביטוי ולוקליזציה לאחר טיפול, או בהתקדמות המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסירה את הסובייקטיביות של האופרטור הטבועה בשיטות הכימות המסורתיות.

כדי להתחיל בתהליך הכמות, פתח את תוכנת ההדמיה המולטי-ספקטרלית כדי לבנות ספרייה ספקטרלית משקופיות בקרה שהוכנו בעבר מוכתמות בכרומוגנים בודדים ושקופית המוכתמת בהמטוקסילין. לאחר מכן, פתח קוביית תמונה שנרכשה משקופית בקרה, ובחר ארבעה עד חמישה אזורים מוכתמים חיובית כדי להגדיר אופטית את הכרומוגן. חזור על השלבים עם קוביות תמונה משקופיות בקרה אחרות עד ליצירת ספרייה ספקטרלית שלמה המייצגת את כל הכרומוגנים, ולאחר מכן שמור את הספרייה הספקטרלית.

התחל פרויקט חדש בתוך תוכנת ההדמיה המולטי-ספקטרלית על ידי בחירה ב-Multispectral או im3 עבור אפשרות פורמט התמונה, ו-Brightfield עבור פורמט המדגם. הגדר את הפרויקט על ידי בחירת רקמת פלח, מצא תכונות, פנוטיפ, ניקוד וייצוא. שנה את רזולוציית התמונה כדי לזרז את זמן הניתוח, אם תרצה.

ייבא את הספרייה הספקטרלית שנוצרה בעבר ובחר את כל הכרומוגנים שייכללו בניתוח. פתח את קוביות התמונה שייכללו בסל נתוני האימון על ידי בחירה באפשרות פתח קוביית תמונה. בחר לפחות 18% מהמספר הכולל של התמונות לניתוח כדי להבטיח דיוק באימון.

לאחר מכן, בחר את ערכת התמונות של האימון. תמונות המייצגות את כל מצבי המחלה, כדי להגביר את דיוק הפילוח. כלול תמונות צביעה שליליות בשפע בערכת האימון כדי למנוע הטיה במהלך שלב זה.

איזון לבן של התמונות בערכת האימון על ידי בחירה בכלי הטפטפת ובחירת אזור בתמונה אחת שהוא לבן. בחר בלחצן התקדם כדי להזיז את פילוח הרקמות. לאחר מכן השתמש בלוח קטגוריות הרקמות כדי לבחור את סוגי הרקמות שיש לנתח ללוקליזציה מדויקת יותר של רקמות חלבון ניתן להשתמש בקטגוריות רקמות נבחרות.

התחל ליצור את האלגוריתם ולהגדיר קטגוריות רקמות על ידי שימוש בכלי העט וציור סביב קבוצות תאים בתוך תמונות אימון. לאחר שתסיים עם קטגוריית רקמה אחת, חזור על השלב עבור קטגוריות רקמות אחרות. הקפד לבחור קבוצות תאים בתוך תמונות האופייניות לסוג קטגוריית הרקמות.

בחר רכיבים שייכללו בהדרכה עבור פלח הרקמות. בחר סולם דפוס מתאים כדי לאמן את פלח הרקמות. לאחר מכן בחר את כפתור פלח הרקמות המאומן.

שים לב לתיבה קופצת המציגה דיוק של שיעור הפיקסלים באזורי אימון מסווגים כהלכה. פלח את כל מערך התמונות של האימון על ידי לחיצה על תמונות פלח. בסיום סקור את ערכת האימון כדי למצוא כל רקמה שסווגה באופן שגוי עם אלגוריתם אימון נוכחי.

כאשר אתה בטוח בתוצאות אלגוריתם פילוח רקמות, בחר בלחצן ההתקדמות. ודא שהגרעינים כבר נבחרו לבחירת ציטופלזמה ו/או ממברנה. בחר את לשונית הגרעינים ובחר את ההגדרות המתאימות לפילוח גרעיני.

לאחר מכן בחר אם קטגוריות רקמות בודדות או כל קטגוריות הרקמות ייכללו בפילוח. בחר בגישת הסף המבוססת על אובייקט כתמים נגדיים לקבלת שיטה פשוטה להשגת תוצאות טובות. לאחר מכן, בחר את גישת הסף מבוססת האובייקטים על כתם נגד גרעיני אמין.

בחר פרמטרים בצורת ציטופלזמה על ידי בחירת הכרטיסייה ציטופלזמה. לאחר מכן, בחר מרחק חיצוני לגרעין. לאחר מכן בחר גודל מינימלי.

בחר את רכיב האפשרות הבא עם ראשי, משני ובחר שלישוני כאפשרויות משניות. עבור ללשונית הממברנה. בחר תחילה עבור הסמן הספציפי לממברנה המשמש.

התאם את הצפיפות האופטית בקנה מידה מלא או OD כדי למצוא סף מינימלי או חיובי עבור כל סמן על ממברנות התא. המשך תחת לשונית הממברנה בחר את גודל התא המרבי. לאחר בחירת כל האפשרויות, בחר פלח הכל.

החל את ההגדרות על התמונות והתבונן בהן. בחר מראש כדי לעבור לשלב הניקוד IHC ובחר קטגוריית רקמות לניקוד. בחר סוג ניקוד רצוי ובחר את תא התאים שישמש בניתוח הניקוד.

לאחר מכן, בחר הצג נתוני רכיבים והזז את הסמן מעל תמונות האימון כדי למצוא צפיפות אופטית מתאימה סף מינימלי של צביעה עבור תאים חיוביים עבור הרכיבים המעניינים. ייצא את הנתונים עבור ערכת ההדרכה כדי לבדוק את האלגוריתם שנוצר באמצעות פילוח רקמות, פילוח תאים וערכי ניקוד עקוב אחר ההנחיות כדי ליצור תיקיה חדשה עבור ספריית הייצוא. בחר תמונות וטבלאות שייווצרו ויכללו בניתוח.

לאחר מכן, בצע את הניתוח על-ידי בחירה באפשרות ייצוא לכולם. לאחר השלמת הניתוח, הצג את נתוני פילוח התאים והניקוד עבור תמונות עם צביעה גבוהה ונמוכה כדי להעריך את דיוק ההגדרות. לאחר שתהיה מרוצה מההגדרות, לחץ על הכרטיסייה ניתוח אצווה כדי להעתיק את האלגוריתם לפרויקט הפעיל.

לאחר מכן בחר ספריית ייצוא חדשה ובחר את התמונות והטבלאות שייכללו בניתוח. תחת אפשרות קבצי הקלט בחר את כל התמונות שייכללו בניתוח האצווה. בחר באפשרות ההפעלה כדי לבצע את הניתוח.

לאחר השלמתו, התקדם לכרטיסיית מיזוג הסקירה. בחר כלול הכל ובחר מיזוג כדי ליצור גליונות נתונים עם נתוני סיכום לניתוח. אימון בוצע על רקמות הערמונית כדי לפלח תמונות לחלקי אפיתל וסטרומלי.

יחד עם תא שאינו רקמות. קבוצה של תמונות אימון יובאה לתוכנת הדמיה מולטי-ספקטרלית המייצגת סוגי רקמות ומצבי מחלה של כל מערך התמונות. קטגוריות רקמות נוצרו כולל סטרומה, אפיתל ולא רקמות והקטגוריות הוגדרו על ידי ציור ידני על גבי תמונות אימון.

אלגוריתם לפילוח רקמות נוצר והוחל על מערך האימון של תמונות. פילוח מדויק של הרקמות. באמצעות טכניקת האימונוהיסטוכימיה המולטיפלקס, תאים חיוביים לביטוי גרעיני של ER-alpha הנראים כאדומים ו-AR הנראים כחומים זוהו למרות אותות צבע ומטריים חופפים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את ביטוי החלבון ולוקליזציה משותפת, ליידע ולתקן רקמות משובצות פרפין.