כימות של ביטוי חלבון ו Co-לוקליזציה שימוש חיסונית-histochemical Multiplexed מכתים והדמיה Multispectral
8 באפריל 2016
אימונוהיסטוכימיה היא טכניקת מעבדה רבת עוצמה להערכת לוקליזציה וביטוי של חלבונים בתוך רקמות. שיטות אוטומטיות למחצה לכימות מציגות סובייקטיביות ולעתים קרובות יוצרות תוצאות בלתי ניתנות לשחזור. כאן, אנו מתארים שיטות לאימונוהיסטוכימיה מרובה וכימות אובייקטיבי של ביטוי חלבון ולוקליזציה משותפת באמצעות הדמיה מולטי-ספקטרלית.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא כימות אובייקטיבי של ביטוי חלבונים וקו-לוקליזציה (co-localization) באמצעות דימוי מולטי-ספקטרלי. שיטה זו יכולה לסייע במענה לשאלות מפתח בתחומי המחקר הבסיסי והפתולוגיה האבחנתית, כגון האופן שבו חלבונים משנים את ביטוים ואת מיקומם לאחר טיפול, או במהלך התקדמות מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסירה את הסובייקטיביות של המפעיל הגלומה בשיטות כימות מסורתיות.
כדי להתחיל בתהליך הכימות, פתח את תוכנת הדמיון הרב-ספקטרלי כדי לבנות ספריית ספקטרום מנתחי בקרה שהוכנו מראש וצבעו בכרומוגנים בודדים ובשליחה שצבעה בהמטוקסילין. לאחר מכן, פתח קוביית תמונה שנרכשה מנתח בקרה, ובחר ארבעה עד חמישה אזורים שצבעם חיובי כדי להגדיר אופטית את הכרומוגן. חזור על השלבים עם קוביית תמונה מנתחי בקרה אחרים עד ליצירת ספריית ספקטרום מלאה המייצגת את כל הכרומוגנים, ולאחר מכן שמור את ספריית הספקטרום.
התחילו פרויקט חדש בתוכנת ההדמיה הרב-ספקטרלית על ידי בחירה ב-Multispectral או im3 כאפשרות עבור פורמט התמונה, וב-Brightfield עבור פורמט הדגימה. הגדירו את הפרויקט באמצעות בחירה ב-segment tissue, find features, phenotyping, score, ו-export. במידת הצורך, שנו את רזולוציית התמונה כדי להאיץ את זמן האנליזה.
ייבא את ספריית הספקטרומים שנוצרה קודם לכן ובחר את כל הכרומוגנים שייכללו בניתוח. פתח את קוביות התמונה שיכללו במערך נתוני האימון על ידי בחירה באפשרות Open Image Cube. בחר לפחות 18% מסך התמונות המיועדות לניתוח כדי להבטיח את דיוק האימון.
בשלב הבא, בחרו את סט התמונות לאימון. יש לבחור תמונות המייצגות את כל מצבי המחלה, כדי להגביר את דיוק הסגמנטציה. כללו מספר רב של תמונות בצביעה שלילית בסט האימון כדי למנוע הטיה במהלך שלב זה.
בצעו איזון לבן (White balance) לתמונות בסט האימון על ידי בחירה בכלי הטפטפת ובחירה באזור לבן באחת התמונות. בחרו בכפתור ה-advance כדי לעבור לסגמנטציית רקמה. לאחר מכן, השתמשו בפאנל קטגוריות הרקמה כדי לבחור את סוגי הרקמות שינותחו; לצורך לוקליזציה מדויקת יותר של החלבון ברקמה, ניתן להשתמש בבחירת קטגוריות רקמה.
התחילו ביצירת האלגוריתם ובהגדרת קטגוריות הרקמה באמצעות כלי העט (pen tool) על ידי שרטוט מסביב לקבוצות של תאים בתוך תמונות האימון. עם סיום הגדרת קטגוריית רקמה אחת, חזרו על השלב עבור קטגוריות רקמה אחרות. הקפידו לבחור קבוצות תאים בתמונות המאפיינות את סוג קטגוריית הרקמה.
בחר את הרכיבים שייכללו באימון עבור מפריד הרקמות (tissue segmenter). בחר קנה מידה (scale) מתאים לתבנית כדי לאמן את מפריד הרקמות. לאחר מכן, בחר בכפתור עבור מפריד הרקמות המאומן.
שימו לב לתיבת פופ-אפ המציגה את הדיוק של פרופורציית הפיקסלים בתוך אזורי אימון שסווגו כראוי. בצעו סגמנטציה לכל סט תמונות האימון על ידי לחיצה על segment images. עם סיום התהליך, עברו על סט האימון כדי לאתר רקמות שסווגו באופן שגוי על ידי אלגוריתם האימון הנוכחי.
כאשר תוצאות אלגוריתם סגמנטציית הרקמה משכנעות, לחצו על כפתור ההמשך (advance). ודאו שגרעינים (nuclei) כבר נבחרו כדי שניתן יהיה לבחור בציטופלזמה ו/או בממברנה. בחרו בלשונית הגרעינים והגדירו את ההגדרות המתאימות לסגמנטציית הגרעין.
לאחר מכן, בחרו האם לקטגוריות רקמה בודדות או לכל קטגוריות הרקמה ייכללו בסגמנטציה. בחרו בגישת הסף המבוססת על אובייקט של צביעת נגד (counterstain) עבור שיטה פשוטה להשגת תוצאות טובות. לאחר מכן, בחרו בגישת הסף המבוססת על אובייקט על סמך צביעת נגד גרעינית מהימנה.
בחר פרמטרים בצורת ציטופלזמה על ידי בחירה בלשונית הציטופלזמה. לאחר מכן, בחר מרחק חיצוני מהגרעין. לאחר מכן בחר גודל מינימלי.
בחר את רכיב האפשרות הבא עם ראשוני, משני ובחר שלישוני כאפשרויות משניות. עבור ללשונית הממברנה. בחר ראשון עבור הסמן הספציפי לממברנה שנעשה בו שימוש.
כוון את סולם הצפיפות האופטית המלאה או ה-OD כדי למצוא סף מינימלי או תוצאה חיובית עבור כל סמן על קרומי התאים. בהמשך, תחת הלשונית membrane, בחר את גודל התא המקסימלי. לאחר בחירת כל האפשרויות, בחר ב-segment all.
החילו את ההגדרות על התמונות ובחנו אותן. בחרו ב-"advance" כדי לעבור לשלב דירוג ה-IHC ובחרו קטגוריית רקמה לדירוג. בחרו את סוג הדירוג הרצוי ובחרו את מדור התא שישמש בניתוח הדירוג.
בשלב הבא, בחרו ב-view component data והניחו את הסמן מעל תמונות האימון כדי למצוא את סף הצפיפות האופטית המינימלית המתאים לצביעת תאים חיוביים עבור הרכיבים הרלוונטיים. ייצאו את הנתונים עבור סט האימון כדי לבחון את האלגוריתם שנוצר באמצעות פילוח רקמות, פילוח תאים וערכי דירוג; פעלו לפי ההנחיות כדי ליצור תיקייה חדשה עבור ספריית הייצוא. בחרו את התמונות והטבלאות שיוצרו וייכללו בניתוח.
בשלב הבא, בצע את הניתוח על ידי בחירה בייצוא עבור הכל (export for all). עם השלמת הניתוח, בחן את נתוני סגמנטציית התאים והניקוד עבור תמונות עם צביעה גבוהה ונמוכה כדי להעריך את דיוק ההגדרות. לאחר שההגדרות מספקות, לחץ על לשונית ניתוח אצוות (batch analysis) כדי להעתיק את האלגוריתם לפרויקט הפעיל.
לאחר מכן, בחרו ספריית ייצוא חדשה ובחרו את התמונות והטבלאות שיכלול הניתוח. תחת אפשרות קבצי הקלט, בחרו את כל התמונות שיוכללו בניתוח ה-batch. בחרו באפשרות ההפעלה (run) כדי לבצע את הניתוח.
עם ההשלמה, עברו ללשונית סקירת המיזוג (review merge). בחרו ב-"כלול הכל" (include all) ובחרו במיזוג (merge) כדי ליצור גיליונות נתונים עם נתוני סיכום לצורך ניתוח. האימון בוצע על רקמות ערמונית כדי לפלח את התמונות לחלקים אפיתליאליים וסטרומליים.
יחד עם מדגם שאינו רקמה. קבוצה של תמונות אימון המייצגות סוגי רקמות ומצבים מחלה מכל מערך התמונות יוובאו לתוכנה לדימות רב-ספקטרלי. נוצרו קטגוריות של רקמות הכוללות סטרומה, אפיתליום ומרכיבים שאינם רקמה, והקטגוריות הוגדרו באמצעות סימון ידני על גבי תמונות האימון.
אלגוריתם לסגמנטציית רקמות פותח והוחל על סט תמונות האימון. סגמנטציה מדויקת של הרקמות בוצעה. באמצעות טכניקת immunohistochemistry מרובה (multiplex), זוהו תאים עם ביטוי גרעיני חיובי של ER-alpha (הנראה באדום) ושל AR (הנראה בחום), למרות חפיפה של אותות צבע ומטריקה. הביטוי הספציפי לממברנת התא של CD-147 נמדד כמותית באמצעות שימוש ב-E-cadherin (הנראה בשחור) כחלבון סימן.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לכמת ביטוי חלבונים וקו-לוקליזציה ברקמות מקובעות ומוטמעות בפרפין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה דן בשיטה לאימונוהיסטוכימיה רב-ערוצית (multiplexed immunohistochemistry) המשתמשת בדימות רב-ספקטרלי כדי לכמת באופן אובייקטיבי ביטוי חלבונים וקו-לוקליזציה. הטכניקה שואפת לבטל את הסובייקטיביות של המבצע הנמצאת בשיטות כימות מסורתיות, ובכך לשפר את השחזוריות במחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- פתולוגיה
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- אימונוהיסטוכימיה מעריכה את הלוקליזציה והביטוי של חלבונים.
- שיטות נוכחיות מביאות לעיתים קרובות לסובייקטיביות וחוסר הדירות.
- דימות רב-ספקטרלי מציע פתרון לאתגרים אלו.
- ניתן ליישם שיטה זו הן במחקר בסיסי והן בפתולוגיה אבחנתית.
מטרת המחקר
- לכימות אובייקטיבית של ביטוי חלבונים וקו-לוקליזציה.
- למענה על שאלות הנוגעות לשינויים בחלבונים לאחר טיפול או התקדמות מחלה.
- לשיפור הדיוק של שיטות הכימות במחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בניית ספרייה ספקטרלית משקפי ביקורת שנצבעו בכרומוגנים בודדים.
- שימוש בתוכנה לדימות רב-ספקטרלי לניתוח קוביות תמונה משקפי ביקורת.
- הגדרה אופטית של אזורי כרומוגן לשיפור הכימות.
- שמירת הספרייה הספקטרלית לניתוחים עתידיים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מסירה בהצלחה את הסובייקטיביות של המבצע.
- היא מספקת דרך מהימנה להערכת לוקליזציה ואקספרסיה של חלבונים.
- ניתן לשחזר את התוצאות בניסויים שונים.
- טכניקה זו יכולה לקדם את ההבנה בתחומי מחקר מגוונים.
מסקנות
- אימונוהיסטוכימיה מרובת-סמנים (Multiplexed immunohistochemistry) בשילוב עם דימות רב-ספקטראלי היא כלי בעל ערך.
- השיטה משפרת את האובייקטיביות של כימות חלבונים.
- יש לה השלכות משמעותיות הן למחקר והן לאבחון קליני.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אימונוהיסטוכימיה כמותית מרובת סמנים (multiplexed) עם דימות מולטי-ספקטרלי נותנת מענה לצורך הקריטי בנתונים אובייקטיביים וניתנים לשחזור של ביטוי חלבונים וקו-לוקליזציה (co-localization) בגילויים מבוססי רקמה. על ידי ביטול הסובייקטיביות של המבצע, זרימת עבודה זו מגבירה את הביטחון החזוי בנקודות תפנית מרכזיות בתיקוף מטרות ובמחקר תרגומי. גישה זו תומכת בהערכה חסונה של סמנים ביולוגיים, ומאפשרת קבלת החלטות בתיקי הפיתוח המותאמות לסיכון בשלבים מוקדמים ובפיתוח פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר כימות אובייקטיבי של ביטוי חלבונים ומיקום מרחבי בהקשר של רקמה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבחנה בין דפוסי ביטוי תאיים-תת-מרכזיים (subcellular) וספציפיים לרקמה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות ניתוח קולוקליזציה (co-localization) של מספר סממנים ביולוגיים.
- משפר את הביטחון החזוי להעברת מטרות לשלבי סריקה בהמשך התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק רכישת תמונות וניתוח בקיבולת גבוהה ובאופן סטנדרטי להבטחת שחזוריות של הבדיקה.
- מספק תוצאות כמותיות, ספציפיות לתא, המתאימות לתהליכי סריקה.
- מאפשר השוואה חסונה של השפעות תרכובות על לוקליזציה ואקספרסיה של חלבונים.
- תומכת ביכולת הרחבה (scalability) של הפלטפורמה ובשימוש חוזר במגוון מודלים של רקמות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את כימות הסמנים הביולוגיים לרקמות ולמדורים תת-תאיים הרלוונטיים למחלה.
- שומר על רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני באמצעות תמיכה בהשוואות אובייקטיביות בין מחקרים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי כך שהוא מאפשר ניתוח של אוכלוסיות תאים כפולות-חיוביות, יחידות-חיוביות ושליליות.
- מסייע בקבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי קידום סמנים ביולוגיים מועמדים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
סבב העבודה של הדמיון המרובה (multiplexed imaging) משלב שלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ובכך תומך בבדיקת היפותזות, תיקוף מטרות והערכת ביומרקרים טרנסלציונליים.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): מכמת באופן אובייקטיבי ביטוי חלבוני וקו-לוקליזציה כדי להבהיר מסלולים ביולוגיים ולתקף מטרות.
- סריקה (Screening): מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר מדידות חסונות סטטיסטית וספציפיות לתאים (compartments) לצורך השוואות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי (Translational Research): מתאימה את ניתוח הביומארקרים למבנה הרקמה ולאוכלוסיות התאים הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): מבססת פלטפורמת דימוי וניתוח סטנדרטית וניתנת להרחבה עבור פריסה של מספר פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי מטרה וביומרקריים.
- ערך תפעולי: מייעל ומסטנדרט את רכישת התמונות והניתוח שלהן, ובכך משפר את השחזוריות ואת התפוקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקה של פיתוח (go/no-go) וניהול יעיל של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות וביומרקריים שעברו ולידציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה, דימוי רב-ספקטרלי ותוכנות לניתוח תמונות.
- נדרשת גישה לסורקי סליידים אוטומטיים ולפלטפורמות דימוי רב-ספקטרלי תואמות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה ואלגוריתמים של ניתוח.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה לסוגי רקמות שונים ולמודלים של מחלות.
- בחירת סט האימון ותיקוף האלגוריתם הם קריטיים לצורך כימות חסר הטיות ואמין.
