Name: הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם E. coli עבור רנטגן קריסטלוגרפיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: למד פרוטוקול מהיר לייצור וטיהור דומיין בולט של norovirus אדם ב-E. coli לקריסטלוגרפיית רנטגן. השיטה מספקת חלבון טהור ביותר לניתוח מבני ופונקציונלי של זנים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון למחקר זה ניתן על ידי קרן CHS. אנו מכירים בפלטפורמת התגבשות החלבונים באשכול המצוינות CellNetworks של אוניברסיטת היידלברג לסינון גבישים ובמתקן הקרינה האירופי לסינכרוטרון על אספקת מתקני קרינת סינכרוטרון.

1. שיבוט דומיין P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את תחום P באזור קידוד על ידי יישור רצף של זנים norovirus (למשל, זן GII.10, GenBank: AF504671, PDB-ID: 3ONU) 6. יתר על כן, הסר את האזור הגמיש בסוף C- המסוף של תחום P (איור 2 א). קודון-לייעל את ה- DNA עבור E. ביטוי coli וכוללים BamHI (N-terminal) ו NotI (C-terminal) אתרי הגבלה כדי-שיבוט תת התחום P קידוד באזור לתוך וקטור ביטוי pMalc2x 6,7. הערה: תחום P באזור קידוד ממוטבת, מסונתז על ידי שירות מסחרי. תחום P קידוד באזור (להוסיף) הוא כ 1 kb באורך נמסר וקטור העברה סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר 2 מיקרוגרם של וקטור העברת עם 1 כל BamHI μl (20,000 יח &#39;/ מ&quot;ל) ו NotI (10,000 יח&#39; / מ&quot;ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם היצרן סיפק מאגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הכנס מתעכל על ג&#39;ל agarose 1%במשך 20 דקות ב 135 V ולטהר את ה- DNA הכנס מן הג&#39;ל באמצעות ערכה מסחרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את וקטור ביטוי pMalc2x ידי לעכל 2 מיקרוגרם של וקטור זה עם כל 1 μl BamHI (20,000 יח &#39;/ מ&quot;ל) ו NotI (10,000 יח&#39; / מ&quot;ל) הגבלה אנזימים עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לטהר את הווקטור מן ג&#39;ל agarose כמתואר לעיל (1.3). הערה: שניהם דגימות (1.2 ו -1.4) ניתן לאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור את הכנס מטוהרים לתוך וקטור pMalc2x מתעכל על אתרי הגבלה BamHI ו NotI עם 1 μl האנזים T4-דנ&quot;א (400,000 U / ml) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 2B ו 2C). השתמש לפחות 20 ננוגרם של וקטור pMalc2x ו וקטור: יחס הכנס 1: 3 (משקל מולקולרי). תמהיל הקשירה הוא בדרך כלל ~ 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform 2 μl של תמהיל הקשירה לתוך 50 μl כימי מוסמכות E. coli DH5α תאים חיידקיים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600בינוני SOC μl עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה התאים שינו במשך 3 דקות XG ב 1000, לבטל את supernatant, ו resuspend גלולה ב 30 μl של המדיום SOC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט לערבב טרנספורמציה על צלחות LB-אגר, המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לבחירה, לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס. חמש מושבות בחר לפחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל אחד מחמשת מושבות, לחסן תרבות 2-3 מ&quot;ל של LB-בינוני בתוספת 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין (LB-אמפר) ולגדול ידי ניעור לילה ב 160 סל&quot;ד ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ פלסמידים מתרבים הלילה באמצעות ערכה מסחרית. בדוק את הנוכחות של הכנס מושלם P על ידי רצף עם פריימר קדימה pMalc2x (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;) לאחור תחל (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. ביטוי דומיין P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform 1 μl (150 ng / μl - 400 ng / μl) של קידוד וקטור pMalc2x עבור התחום MBP-שלו-P<html> חלבון היתוך לתוך 50 μl של א המוסמכת coli BL21 תאים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי (10 דקות על קרח, הלם חום 45 שניות על 42 מעלות צלזיוס) ולגדול 600 μl בינוני SOC עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. תת לתוך 120 מ&quot;ל של אמפר LB לילה ב 160 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תשעה ליטרים (למשל, 6 x 5 צלוחיות L עם 1.5 בינוני L כל אחד) של מגבר LB עם תת (1: 100). לגדל את התאים רועד ב 160 סל&quot;ד ו -37 ° C עד OD 600 מגיע 0.4 - 0.6. בהמשך לכך, מנמיכים את הטמפרטורה ל 22 מעלות צלזיוס במשך ~ 1 hr ולאחר מכן להשרות את ביטוי חלבון עם 0.66 מ&quot;מ של איזופרופיל- β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) 8. לגדל את התאים לילה בשעה 22 ° C (~ 18 שעות). הערה: הטמפרטורה יכולה להיות מגוונת, אבל אנחנו ממליצים להשתמש 22 ° C או נמוך יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי צנטריפוגה (10,543 XG, 15 דק &#39;, 4 ° C). בטל supernatant ולהקפיא התא גלולה ב -20 ° C. </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. שלב טיהור -1 ו פרוטאז מחשוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן מאגרים המשמשים במהלך שלבי טיהור חלבונים מפתרונות מניות להבטיח שחזור יציבות של הניסויים. הכן ארבעה מאגרים שונים עבור כרומטוגרפיה זיקה יון המתכת משותקת (IMAC), שכל אחת מהן מכילה ריכוז שונה של imidazole (10 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ, 50 מ&quot;מ, ו -250 מ&quot;מ). עבור SEC, להכין חיץ ג&#39;ל-סינון (GFB) עם ריכוז מלח גבוה, אך ללא imidazole. השתמש במי deionized ולסנן את כל המאגרים לפני שימוש עם גודל נקבובי של 0.45 מיקרומטר. הערה: ערכת הכנה חיץ מפורט, עיין בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את התא גלולה מתשע התרבות ליטר ו להתמוסס 150 מ&quot;ל PBS ב 4 ° C. Sonicate השעית התא שלוש פעמים במשך 2 דקות (כוח 130 W, 20% משרעת, תדירות דופקת 50%) כדי לשבש את התאים. שמור על השעיית התא על קרח במהלך sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuge השעית תא sonicated (43,667 XG, 30 דק &#39;, 4 ° C) כדי להפריד פסולת תא מן supernatant המכיל חלבון לידי ביטוי. איסוף supernatant וזורקים את הכדור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף לאזן 10 מ&quot;ל (= 1 נפח הטור [CV]) תרחיף של ניקל (Ni) חרוזים agarose -NTA עם חיץ imidazole 10 מ&quot;מ בטור כרומטוגרפיה. מוסיפים את החרוזים Ni equilibrated כדי supernatant משלב 3.3 המכיל הביעו MBP--P שלו חלבון היתוך מושלם דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C עם סיבוב איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להחיל את התערובת Ni-חרוז-חלבון שלם טור כרומטוגרפיה. לשטוף את העמודה לאט עם כל 5 קורות חיים של 10 מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ, ו -50 מאגרים imidazole מ&quot;מ, החל עם 10 מ&quot;מ, אז 20 מ&quot;מ ו 50 מ&quot;מ (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P באמצעות חיץ imidazole 250 מ&quot;מ (איור 3 א). במהלך elution, לבדוק את 280nm OD לאמת את elution של חלבון ההיתוך (עליית OD 280nm). המשך elution עד 280nm OD יורד ל ~ 0.1. שטפו את החרוזים עם כמויות עודפות של חיץ imidazole 250 מ&quot;מ (לפחות 10 קו&quot;ח), ואחריו 10 קו&quot;ח לפחות 10 מ&quot;מ חיץ imidazole. שמור את החרוזים על צעד הטיהור השני (סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוודא את נוכחותו של החלבון היתוך מושלם MBP-שלו-P עם SDS-PAGE באמצעות ג&#39;ל 12% SDS-polyacrylamide (10 x 8 ס&quot;מ) 9 (איור 3 א). בצע ג&#39;ל אלקטרופורזה ב 45 ו -200 V עבור 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז (למשל, באמצעות concentrator מסחרי) החלבון היתוך מושלם eluted MBP-שלו-P לריכוז סופי של ~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל. קליב היתוך מושלם MBP-שלו-P עם פרוטאז HRV-3C במהלך דיאליזה נגד 2 L של 10 מ&quot;מ חיץ imidazole (~ 1: 100) לילה ב 4 ° C (איור 3 א). בהתאם לנפח סופי של חלבון מרוכז, לבצע דיאליזה בבית צינורות קלטת או דיאליזה דיאליזה. הערה: כמות פרוטאז HRV-3C לחלבוןמחשוף מחושב בהתאם לפעילות פרוטאז הספציפי (2 U / μl, 1 U מספיקה כדי לדבוק 100 מיקרוגרם של חלבון) וכמות חלבון היתוך eluted משתנה על רמת הביטוי וניתן לאמוד מתוך תוצאת SDS-PAGE (3.7 ). </li></ol> שלב טיהור 4. 2 nd <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את-חרוזים ניקל משלב 3.6 ב 10 חיץ imidazole מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת חלבון dialyzed משלב 3.7 (המכיל תחום P בקע, חלבון MBP, ו-פרוטאז HRV) עם סיבוב Ni-החרוזים (4.1) equilibrated למשך 30 דקות ב 4 ° C עם איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את התערובת Ni-חרוז לעמודה ולאסוף את הזרימה דרך (תחום P ביקע) (איור 3 ב). למדוד את הריכוז של חלבון כפי שהיא באה את הטור עד 280nm OD מגיע ~ 0.1. הערה: MBP-שלו צריך להישאר כבול אל-חרוזי ניקל (איור 3 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הנוכחות של תחום P בקע באמצעות SDS-PAGE עם 1ג&#39;ל 2% כפי שתואר לעיל (איור 3 ב). לרכז את תחום P eluted כדי ~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו dialyze לילה ב 4 ° C נגד GFB לטיהור SEC שלאחר מכן. </li></ol> שלב טיהור 5. 3 rd <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף משאבות וצינורות של מערכת טיהור HPLC מראש לאזן את העמודה SEC (ראה רשימת חומרים) עם GFB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את תחום P לעמודה בקצב זרימה של 1 מ&quot;ל / min באמצעות superloop (עד 12 מ&quot;ל) או לולאה (עד 3 מ&quot;ל), בהתאם לכמות של המדגם מרוכז. לאחר הזריקה נגמר, להגדיל את קצב הזרימה 2.5 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל שעולה OD ואת תחום P יורד בטור, לאסוף שברים של 1.5 מ&quot;ל. בדוק שברים באמצעות SDS-PAGE עם ג&#39;ל 12% (איור 4 א ו -4). בריכה רק שברים הטהור להתרכז כדי ~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו ~ 8 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: לאחר ~ 110 מ&quot;ל (נפח חלל) ביותר זיהומים הם eluted מעמודה SEC עם 320 מ&quot;ל נפח המיטה. התחום P בד&quot;כ eluted כמו דימר. Elution זמן / נפח של דימר המושלם P תלוי כיתת prep (PG) של טור SEC. </li></ol> 6. התגבשות של דומיין P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מושלם P ב ~ 3 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו -8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​להקרנה התגבשות ראשונית. הכן לפחות 100 μl של תחום P לכל ריכוז למסכים ראשוני עם 384 תנאי הקרנה זמינים מסחרי. בצע סינון על 18 מעלות צלזיוס במתכונת צלחת 96-היטב, שם המאגר מכיל 100 μl של פתרון אמא וירידה מורכבת 0.2 פתרון אמא μl 0.2 חלבון μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור לייעל התגבשות תנאים מוצלחים. לכן, להשתמש בצלחות 15-היטב המכילות 3 שורות. הגדרה בשורה הראשונה עם פתרון אמא 100%, בשורה השנייה עם פתרון אמא 90% ו -10% מים, והשורה השלישית עם פתרון אמא 80% ומי 20%. השתמש גודל טיפה של 2 μl (1 μl חלבון + 1 μl פתרון אמא) ו -50081; l של פתרון אמא ככרך המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תנאים קריסטל אופטימיזציה עבור שיתוף בגיבושו של תחום P עם הליגנדים. כן צלחות כמתוארים 6.2. במקום 2 גודל טיפה μl, להגדיר טיפות המכילות 1 פתרון אמא μl, 1 חלבון μl, ו 1 μl של ליגנד בריכוז של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף ערכות נתונים של גבישים יחידים באמצעות קרינת synchrotron. בצע החלפה מולקולרית באמצעות מבנים מושלמים P שפורסמו עם דמיון רצף גבוה ככל 6,10-13 מודל חיפוש ראשוני. הערה: הנוכחות של ליגנד מופיעה בתור בועה-דגם un של צפיפות אלקטרונים. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+norovirus+in+cases+of+gastroenteritis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).</li>
<li>Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of calicivirus.</a> J. Mol. Biol. 240, 256-264 (1994).</li>
<li>Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+structural+characterization+of+recognition+of+histo-blood+group+antigens+by+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).</li>
<li>Marionneau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+binds+to+histo-blood+group+antigens+present+on+gastroduodenal+epithelial+cells+of+secretor+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals.</a> Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).</li>
<li>Jones, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+bacteria+promote+human+and+mouse+norovirus+infection+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.</a> Science. 346, 755-759 (2014).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+GII.10+and+GII.12+norovirus+protruding+domains+in+complex+with+histo-blood+group+antigens+reveal+details+for+a+potential+site+of+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability.</a> J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).</li>
<li>Fath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+RNA+and+codon+optimization%3A+a+standardized+tool+to+assess+and+enhance+autologous+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression.</a> PLoS One. 6 (e17596), (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Processing+of+Rotation+Diffraction+Data+from+Crystals+of+Initially+Unknown+Symmetry+and+Cell+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants.</a> J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).</li>
<li>Mccoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674 (2007).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 486-501 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+D-Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).</li>
<li>Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody+binding+to+a+conserved+epitope+promotes+norovirus+particle+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly.</a> J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).</li>
<li>Hansman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+broad+detection+of+genogroup+II+noroviruses+by+a+monoclonal+antibody+that+binds+to+a+site+occluded+in+the+viral+particle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle.</a> J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).</li>
<li>Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+noroviruses%27+fondness+for+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).</li>
<li>Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+a+rabbit+hemorrhagic+disease+virus+binding+to+histo-blood+group+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens.</a> J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור הביטוי וטיהור תחומי P norovirus באיכות גבוהה ובכמות. Noroviruses אינם נלמדים היטב נתונים מבניים נדרשים ברציפות. למיטב ידיעתנו, ייצור מושלם P תוך שימוש בפרוטוקולים אחרים (למשל, תחומים P-tagged GST) כבר בעייתי, עד כה, ונתונים מבניים מספיק על האינטראקציה norovirus המארח כבר חסר. בשיטה מתוארת כאן, תרמנו לאחרונה באופן משמעותי להבנה את הפרטים המולקולריים של norovirus פחמימות מחייבות. הפרוטוקול הנוכחי ניתן להתאים מגוון של חלבונים. עם זאת, יישום מוצלח...

Noroviruses אדם הם הגורם העיקרי של גסטרואנטריטיס חריפה ברחבי העולם 1. וירוסים אלה שייכים למשפחת Caliciviridae, אשר יש לפחות חמישה סוגים, כולל norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, ו Nebovirus. למרות השפעה הגבוה על מערכת הבריאות והפצה רחבה, חקר noroviruses אדם נפגע על ידי עדר מערכת תרבית תאים חזקה. נכון להיום, אין חיסונים שאושרו או אסטרטגיות אנטי זמינות. חלבון קפסיד הגדול norovirus, כינת VP1, ניתן לחלק תחום פגז (S) ואת התחום בולט (P) 2. תחום P מחובר תחום S ידי ציר גמיש (H) באזור. תחום S מהווה פיגום סביב רנ&quot;א הנגיפי, ואילו תחום P מהווה את החלק קצוני של קפסיד ויראלי. תחום P מרכיב לתוך הדימרים רלוונטיים מבחינה ביולוגית כאשר הביעו בחיידקים. ה- P דimer אינטראקציה עם מבני פחמימות, כינת אנטיגנים קבוצת histo-דם (HBGAs) שנמצאים כמו אנטיגנים מסיסים המצויים ברוק ומצאו בתא פונדקאי מסוים 3. האינטראקציה תחום-HBGA P נחשב חשוב זיהום 4. ואכן, לאחרונה דווח חשף את החשיבות של HBGAs הסינטטי או HBGA להביע חיידקי זיהום norovirus אנושי במבחנה 5. מחקרים שוטפים לגבי מצורף התא המארח של noroviruses מבוצעים בעיקר עם חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) שיכול לבוא לידי ביטוי בתאי חרקים או עם תחומי P רקומביננטי לידי ביטוי Escherichia coli (E. coli). כדי להבין את יחסי הגומלין P תחום-HBGA ברזולוציה אטומית, P מבנים מורכבים תחום-HBGA ניתן לפתור באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מושלם P וטיהור המאפשר ייצור של תחום P בכמות ובאיכות גבוהה לשמש crystall רנטגןography. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים וחלבונים הלא מבניים. תחום P הוא קודון אופטימיזציה עבור E. ביטוי coli ו משובטים לתוך וקטור העברה סטנדרטי. תחום P הוא מחדש משובט לתוך וקטור ביטוי מקודד polyhistidine התג (שלו) לבין חלבון מחייב מנוז (MBP) כי הם ואחריו אתר מחשוף פרוטאז. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מתבטא E. coli, ואחריו שלושה שלבים לטיהור. חלבון ההיתוך המושלם MBP-שלו-P מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקת יון מתכת משותקת (IMAC). לאחר מכן, חלבון ההיתוך הוא בקע עם rhinovirus אדם (HRV) פרוטאז -3C ואת תחום P מופרד MBP-שלו על ידי צעד טיהור נוסף IMAC. לבסוף, תחום P הוא מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל (SEC). התחום P מטוהרים לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. הקרנת התגבשות תנאי חלבון היא performed עם ערכות הקרנה זמינות מסחרי באמצעות ריכוזי חלבון שונים P מושלם. צמיחת קריסטל הוא ציין והתנאים המבטיחים ביותר ממוטבים. עם השיטות שתוארו כאן, אפשר לעבור גן לחלבון לבנות בתוך פחות מארבעה שבועות. לכן, השיטה שלנו הביטוי המושלם P, טיהור, ההתגבשות מתאימה לחקור את אינטראקצית norovirus לארח ברמה המולקולרית ולספק נתונים חשובים כדי לסייע עַדכָּנִי חיסון הקרנת עיצוב תרופה.

<table><tbody><tr><td>תחום P DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt סינתזת גנים</td></tr><tr><td>pMalc2x&nbsp; וקטור</td><td>לפי בקשה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי</td> <td>ג'ל מהירה QIAQiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 ס"מ, אפשרי לשימוש בגודל אחר</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>שונים</td><td>חיתוך של 10 kDa, 30 kDa ו-50 kDa בשימוש</td></tr><tr><td>ביעילות תת-שיבוט DH5 ואלפא; תאים מוכשרים</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>זריקה אחת BL21 (DE3) מוכשרת כימית E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C פרוטאז</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC טור</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>שונים</td><td>4 מסכים עם כל 96 בארות</td></tr><tr><td>פחמימות</td><td>Dextra Laboratories, בריטניה</td><td>מוצרי קבוצת דם</td> <td>שונים</td></tr></tbody></table>

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; e. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

קפסיד norovirus מורכב חלבון מבני גדול יחיד, כינת VP1. VP1 מחולק פגז (S) תחום תחום בולט (P). תחום S מהווה פיגום רציף סביב רנ&quot;א הנגיפי, ואילו צורות המושלמות P קוצים ויראלי על תחום S ומכיל הקבע עבור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים. תחום P נקשר מבני פחמימות, כלומר., אנטיגנים קבוצת histo-דם, אשר נחשבים חשובים עבור זיהומי norovirus. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לייצור תחומי P norovirus באיכות גבוהה בתשואות גבוהות. חלבונים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו ELISA כדי לחקור אינטראקציות antigenicity ומארח תאים. תחום P הוא משובט ראשית לתוך וקטור ביטוי ולאחר מכן הביע בחיידקים. החלבון הוא מטוהר באמצעות שלושה צעדים כרוכים משותקים כרומטוגרפיה זיקת מתכת-יון כרומטוגרפיה הדרת גודל. בעקרונית, אפשר לשכפל, מפורש, לטהר, ולגבש חלבונים בתוך פחות מארבעה שבועות, מה שהופך בפרוטוקול זה מערכת מהירה לניתוח זני norovirus המתהווה.

סכמטית של הפרוטוקול המתואר מתוארת באיור 1. הפרוטוקול מכסה 6 חלקים עיקריים הכוללים שיבוט של גן המטרה, ביטוי, טיהור בן שלושה שלבים, וגיבוש. איור 2 מדגימה את העיצוב של מבנה הביטוי (EC) ו מאפיינים של וקטור ביטוי pMalc2x. הרצף של אתר השיבוט המרובה (MCS) של וקטור pMalc2x מציג את אתרי מחשוף הגבלת פרוטאז. איור 3 מציג תוצאות SDS-PAGE נציג של חלבון היתוך המושלם MBP--P שלו מושלמת P בקע עם השרטוטים המקבילים של...

כאן, אנו מתארים שיטה להביע ולטהר norovirus באיכות גבוהה בולטות (P) תחומים ב E. coli לשימוש במחקרים קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תחומי P calicivirus אחרים, כמו גם חלבונים הלא מבניים, כלומר., הגנום צמוד חלבונים נגיפיים (VPG), פרוטאז, ו RNA רפליקאז (RdRp).

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם<em&gt; E. coli</em&gt; עבור רנטגן קריסטלוגרפיה

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

המטרה הכללית של הפרוטוקול היא ייצור וטיהור של הדומיין הבולט (protruding domain) של נורו-וירוס אנושי ב-E.coli, במטרה להפיק חלבון טהור במיוחד עבור קריסטלוגרפיה של קרני X. הפרוטוקול שלנו לביטוי חלבון, טיהור והתגבשות הוא מהיר, חסון, וניתן לשימוש עבור חלבונים מבניים ולא-מבניים. היתרון של פרוטוקול זה הוא שהחלבונים המתקבלים הם טהורים מאוד ויכולים להוות גבישים המסוגלים להפיק דיפרקציה ברזולוציה גבוהה.על פי ניסיוננו, ייתכן שיהיה צורך בהתאמת הפרוטוקול עבור חלבונים בעלי מסיסות נמוכה יותר. לדוגמה, ניתן לשנות את מצע הגידול או את טמפרטורת הגידול במהלך ביטוי החלבון. לתחילת התהליך, העבירו מיקרוליטר אחד של וקטור pMalc2x, המקודד לחלבון המהוזם MBP-His-P domain, לתוך 15 מיקרוליטר של תאי E.coli BL21 כשירים באמצעות פרוטוקול טרנספורמציה סטנדרטי.הוסיפו 600 µL של מצע SOC לתאים. גדלו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C. העבירו את התאים שעברו טרנספורקציה לתרבית משנית של 120 mL של LB-ampicillin למשך לילה, במהירות של 160 rpm ובטמפרטורה של 37 °C.החדירו את תרבית המשנה לשלושה ליטרים של LB-ampicillin. גדלו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במהירות ניעור של 160 rpm עד שהצפיפות האופטית ב-600 nanometers תגיע ל-0.4 עד 0.6. לאחר מכן, הפחיתו את הטמפרטורה ל-22 degrees Celsius למשך כשעה אחת.חשוב להמתין עד שהטמפרטורה תגיע ל-22 °C לפני ההשראה בריכוז נמוך של IPTG כדי לאפשר ביטוי של חלבון ממיס. השרה את ביטוי החלבון באמצעות 0.66 millimolar של IPTG. לאחר ההשראה, גדל את התאים למשך הלילה ב-22 °C.קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגציה. השליכו את העילוי והקפיאו את משקע התאים ב-20 degrees Celsius. הכינו תמיסות בופר המשמשות לשלבי ניקוי החלבון מתמיסות מלאי, כמפורט בפרוטוקול הכתוב.הפשיר את משקע התאים מהתרבית של תשעה ליטר והמס ב-150 milliliters של phosphate buffered saline בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. בצע סוניקציה לתסחיף התאים שלוש פעמים למשך שתי דקות כדי לפרק את התאים. סבב את תסחיף התאים שעבר סוניקציה בצנטריפוגה כדי להפריד את שאריות התאים מהנוזל העליון המכיל את חלבון היתוך MBP-His-P domain המבוטא.אספו את העל-משקע והשליכו את המשקע. שטפו והשילו 10 מיליליטר של תרחיף חרוזי nickel-NTA agarose עם בופר imidazole בריכוז 10 millimolar בעמודת כרומטוגרפיה. הוסיפו את חרוזי הניקל שהושלו אל העל-משקע המכיל את חלבון היתוך MBP-His-P domain המבוטא, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב איטי.לאחר הדגירה, העבירו את כל תערובת חרוזי הניקל והחלבון לעמודת כרומטוגרפיה. שטפו את העמודה באיטיות עם חמישה נפחי עמודה (CVs) של תמיסות בופר עם אימידזול בריכוזים של 10 millimolar, 20 millimolar ו-50 millimolar, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. בצעו אלואוציה של חלבון היתוך MBP-His-P domain באמצעות תמיסת בופר אימידזול בריכוז 250 millimolar בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.במהלך האלוציה, בדוק את הצפיפות האופטית ב-280 ננומטר כדי לוודא את אלוציית חלבון היתוך. המשך באלוציה עד שהצפיפות האופטית ב-280 ננומטר תירד לכ-0.1. בעבודה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, שטוף את החרו지를 בכמות עודפת של בופר עם 250 מילימולר imidazole, ולאחר מכן בבופר עם 10 מילימולר imidazole.שמרו את החרוזים לשלב הניקוי השני. אחתקו את נוכחותו של חלבון היתוך MBP-His-P domain באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם נתרק דודציל סולפט (SDS-PAGE), תוך שימוש בג'ל פוליאקרילאמיד 12% SDS. לאחר מכן, רכזו את חלבון היתוך ה-MBP-His-P domain ששולטס (eluted) לריכוז סופי של כ-3 mg/mL.יש לחשב בקפידה את כמות הפרוטאז הדרושה כדי לבצע פיצול יעיל של דומיין ה-MBP-His-P. הכמות תלויה בסכום הכולל של חלבון היתוך שאלואט ובתוצאות ה-SDS-PAGE. יש לבצע את פיצול חלבון היתוך ה-MBP-His-P באמצעות HRV 3C protease במהלך דיאליזה כנגד שני ליטרים של באפר imidazole בריכוז 10 millimolar למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בהתאם לנפח הסופי של החלבון המרוכז, בצעו דיאליזה בקסטת דיאליזה או בשרוך דיאליזה. השתייוו את חרוזי הניקל שהופרודו מראש בבופר אימידזול 10 millilmolar. דגרו את החלבון שעבר דיאליזה, המכיל את דומיין P העשוי, חלבון MBP ופרוטאז HRV, עם חרוזי הניקל המושווים למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס בסיבוב איטי.יש להעביר את תערובת חרוזי הניקל בעמודה ולאסוף את התסננת (flowthrough) בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. זהו דומיין ה-P המנוקק. יש למדוד את ריכוז החלבון היוצא מהעמודה עד שהצפיפות האופטית ב-280 ננומטר מגיעה לכ-0.1.ה-MBP-His אמור להישאר קשור לחרוזי הניקל, בעוד שהדומיין P המנוקה נשטף ב-flowthrough. בדוק את נוכחותו של הדומיין P המנוקה באמצעות SDS-PAGE עם ג'ל 12% כפי שבוצע קודם לכן. לאחר ריכוז הדומיין P שנשטף לכ-3 mg/mL, בצע דיאליזה למשך לילה ב-4 °C מול בופר סינון ג'ל (gel filtration buffer) לצורך טיהור עוקב באמצעות כרומטוגרפיית הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography).שטפו את המשאבות והצינורות של מערכת הניקוי בכירומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC), ובצעו שיווי משקל מוקדם של עמודת הכרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (SEC) עם באפר לסינון ג'ל. מזקו את דומיין ה-P לתוך העמודה בקצב זרימה של 1 mL לדקה, באמצעות superloop או loop, בהתאם לנפח הדגימה המרוכזת. לאחר סיום ההזרקה, הגבירו את קצב הזרימה ל-2.5 mL לדקה.ככל שהצפיפות האופטית עולה והדומיין P יוצא מהעמודה, אספו פראקציות של 1.5 milliliters. הדומיין P מולקע בדרך כלל כדימר. לאחר בדיקת הפראקציות באמצעות SDS-PAGE עם ג'ל של 12%, אגדו רק את הפראקציות הטהורות ביותר ורכזו אותן לכשלושה milligrams per milliliter ולכשמונה milligrams per milliliter.השתמשו בדומיין P בריכוזים של כ-3 mg/mL ו-8 mg/mL לסריקת התגבשות ראשונית. הכינו לפחות 100 µL של דומיין P לכל ריכוז עבור סריקות ראשוניות עם 384 תנאי סריקה זמינים מסחרית. בצעו את הסריקה בטמפרטורה של 18 °C בפורמט של פלטה בעלת 96 בארות, כאשר המאגר מכיל 100 µL של תמיסת אם וטיפה מורכבת מ-0.2 µL של תמיסת אם ו-0.2 µL של חלבון.אשפו את תנאי ההגבשה המוצלחים באמצעות פלטות בעלות 15 בארות המכילות שלוש שורות. השתמש ב-500 µL של תמיסת אם כנפח המאגר. הגדר את השורה הראשונה עם 100% תמיסת אם.השורה השנייה עם 90% תמיסת אם ו-10% מים. והשורה השלישית עם 80% תמיסת אם ו-20% מים. הגדירו טיפה תלויה עם גודל טיפה של 2 µL על ידי ערבוב של נפח שווה של חלבון ותמיסת אם.השתמשו בתנאי הגביש האופטימליים לגביש משותף (co-crystallization) של דומיין P עם ליגנדים. הכינו פלטות כפי שנעשה קודם לכן, אך במקום נפח טיפה של שני מיקרוליטר, הגדירו טיפות המכילות 1 µL של תמיסת אם, 1 µL של חלבון ו-1 µL של ליגנד בריכוז של 1 mg/mL. כאן מוצגת תוצאת SDS-PAGE מייצגת, המראה את כמות חלבון היתוך MBP-His-P domain שנושפה לאחר שלב הניקוי הראשון, שבו חלבון היתוך MBP-His-P domain מנוקה באמצעות חרוזי nickel-NTA agarose.לאחר הפרדת ה-MBP-His מהדומיין P השגור, כמות דומיין P השגור שאלוטה נותח 또한 באמצעות SDS-PAGE. לאחר שלב הניקוי הסופי באמצעות כרומטוגרפיה של הפרדה לפי גודל (size exclusion chromatography), סריקת גבישים הובילה לאופטימיזציה של תנאי הגביש. כאן מוצגת תבנית הדיפרקציה של דומיין בולט.עקרונית, ניתן לשבט, לבטא, לטהר ולהקריץ חלבונים בפחות מארבעה שבועות, מה שהופך פרוטוקול זה למערכת מהירה לניתוח זנים חדשים של norovirus. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהאיכות חשובה יותר מהכמות. בשל האיכות הגבוהה של דומייני ה-P המטוהרים, ניתן לבצע מחקרים נוספים, כולל חיסון לייצור נוגדנים, ניסויי NMR ומחקרים מבוססי ELISA.יתרה מכך, ניתן להשתמש בדומיין P המטוהר ליצירת קומפלקסים עם פרגמנטים של נוגדנים וננו-נוגדנים (nanobodies). לאחר צפייה בפרוטוקול זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבטא ולטהר דומיינים P של norovirus באיכות גבוהה.

production-human-norovirus-protruding-domains-e-coli-for-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה לאיתור חלבונים מתויגים fluorescently בmicrographs אלקטרונים. פלואורסצנטי הוא מקומי הראשון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה המופעל על חלקי Ultrathin. תמונות אלה אז מיושר לmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף.

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

מקור: Leuthold, M. M., et al. ייצור תחומים בולטים של נורו-וירוס אנושי ב - E. coli לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים את הטיהור של תחום נורו-וירוס אנושי רקומביננטי P באמצעות כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, תוך הדגשת ההפרדה של חלבון המטרה מזיהומים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך יותר בהתבסס על נגישות נקבוביות דיפרנציאלית. התהליך מנוטר על ידי ספיגת UV ומאושר באמצעות ניתוח SDS-PAGE של שברים שנפלטו.

טיהור חלבוני תחום P רקומביננטיים שמקורם בחיידקים של נורו-וירוס אנושי

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות חלקיקים דמויי וירוס נורו-וירוס אנושי (VLPs) הנקשרים לחיידקי מעיים אנושיים. התרחיפים החיידקיים מעורבבים עם ה-VLPs ומודגרים כדי לאפשר היווצרות קומפלקסים של חיידקי VLP. לאחר מכן מסומנים הקומפלקסים בנוגדנים ספציפיים ל-VLP המתויגים כפלואורופורים, ולאחר מכן הדמיה וכימות מבוססי ציטומטריית זרימה כדי לזהות את אחוז החיידקים הקשורים ל-VLP.

בדיקה לכימות הקשר של VLPs נורו-וירוס אנושי לחיידקי מעיים

מאמר זה מתאר את מתודולוגיית המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית, המשמשת להשגת תמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה של מקרומולקולות במצבן הכמעט טבעי. השיטה מניבה תמונות המתאימות לעיבוד ממוחשב נוסף בגישת החלקיק הבודד, שתוכננה ליצירת שחזור תלת מימדי של מקרומולקולה.

עשה ואל תעשה של מיקרוסקופ אלקטרוני cryo-: פריימר על הכנת דוגמאות וגבוהה איסוף נתונים איכות לשיקום Macromolecular 3D

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

שיטה זו מתאר את שיבוט, הביטוי, ואת טיהור של Nsa1 רקומביננטי לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, רנטגן זווית קטנה פיזור (SAXS), והוא רלוונטי לניתוח המבני היברידית של חלבונים אחרים שניהם הורו, מגרה תחומים.

שילוב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עם זווית קטנה פיזור קרני רנטגן ליצור מודל לא מובנה מחוזות Nsa1 של Cerevisiae ס

אנו מתארים פרוטוקולים עבור קביעת המבנה של התחום המחייב של IKK של נמו על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן. השיטות כוללות ביטוי חלבונים, טיהור ואפיון, כמו גם אסטרטגיות למיטוב מוצלח של גביש וקביעת מבנה של החלבון בצורתו הלא מאוגדת.

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

המטרה של פרוטוקול זה היא לכמת את הכריכה של הפתוגן איקריוטית האנושי הנגיף כדי חיידקים. לאחר ביצוע הראשונית וירוס חיידק הקובץ המצורף, הזרימה cy, לנסות לזהות חיידקים מאוגדים וירברית בתוך האוכלוסייה.

כימות האדם Norovirus וירוס כריכת כריכה של חיידקים קומנדסאל באמצעות זרימה Cy, לנסות

כאן מתוארים פרוטוקולים להכנת מכלולי וירוסים המתאימים לניתוח נוזל-EM וקריו-EM בקנה מידה ננומטרי באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה.

קידום הדמיה ברזולוציה גבוהה של מכלולי וירוסים בנוזלים ובקרח

למד פרוטוקול מהיר לייצור וטיהור דומיין בולט של norovirus אדם ב-E. coli לקריסטלוגרפיית רנטגן. השיטה מספקת חלבון טהור ביותר לניתוח מבני ופונקציונלי של זנים חדשים.

הפקה של דומיינים בולטים norovirus אדם

גלה סרטונים נוספים