בשילוב optogenetic ולהקפיא-שבר Replica immunolabeling לבחינת הסדר ספציפי קלט של גלוטמט הקולטנים עכבר האמיגדלה

מטרת הליך זה, המשלב אופטוגנטיקה עם טכניקת התיוג החיסוני של העתק הקפאה-שבר, היא לנתח את הצפיפות של קולטני גלוטמט יונוטרופיים בסינפסות באמיגדלה של העכבר עם אלמנטים סינפטיים מזוהים לפני ואחרי זה. יכולת השחזור והרבגוניות הגבוהות של טכניקת התיוג החיסוני העתק של שבר הקפאה, בשילוב עם אופטוגנטיקה, מציעה גישה רבת עוצמה לניתוח מתאם של התכונות המבניות והתפקודיות של סינפסות. היתרונות העיקריים של הליך זה הם: הראייה המישורית של האלמנטים הקדם-סינפטיים והפוסט-סינפטיים, והניתוח הכמותי של חלבונים במיקרו-תחומים מיוחדים אלה.

ניתן להתאים טכניקה שונה למגוון רקמות שונות כדי לחקור את התפוצה והארגון של חלבוני ממברנה אינטגרליים. באופן כללי, גישת FRIL אופטוגנטית משולבת זו מאתגרת למתחילים בגלל המגוון הגדול של מכשירים ומכונות שונות הנדרשים. התחלת האפנון בשיטה אחרת היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד כמה שלבים אחרים.

כגון שבירה ושכפול דגימות קפואות כדי להתחיל בהליך זה, הדביקו גוש עטרה של מוח עכבר על מחזיק פורס הרטט. כוונו את גוש הרקמה כך שהניאו-קורטקס יפנה אל הלהב הרוטט. לאחר מכן, פורסים את חלקי העטרה המכילים את האמיגדלה בעובי של 140 מיקרומטר בנקודת אפס טוחנת אחת, PB קר כקרח. ואוספים אותם בצלחת של שש בארות באותו חיץ.

תחת מיקרוסקופ סטריאו, חותכים את אזור העניין מהפרוסות, בצלחת פטרי מצופה באלסטומר סיליקון וממולאת בנקודה אפס נקודה אחת טוחנת PB. לאחר מכן, העבירו את הבלוק הגזום לתמיסת ההגנה מפני קריו, ושמרו למשך הלילה על שש מעלות צלזיוס. בשלב זה, הכינו את מנשאי הנחושת לשימוש בשלבים העוקבים של הליך FRIL, על ידי ליטושם ביריעת עור שמי כמסיר כתמים. מתחת למיקרוסקופ, חבר טבעת של סרט דו צדדי למנשא הנחושת, שתשמש כבאר האחיזה לבלוק הגזום.

לאחר מכן, הנח את הבלוק הגזום בחור של הסרט הדו-צדדי באמצעות לולאת חוט פלטינה. הסר עודף תמיסת הקפאה באמצעות נייר סינון או מברשת. לאחר מכן, כסה את מנשא האחיזה במנשא אחר.

כך שגוש הרקמות נדחק בין שני הנשאים. כדי להקפיא את הדגימה, הכנס את כריך המנשא למחזיק הדגימה. לאחר מכן, הכנס את מחזיק הדגימה ליחידת ההקפאה בלחץ גבוה.

התחל את מחזור ההקפאה על ידי לחיצה על כפתור הסילון האוטומטי, הסר מיד את מחזיק הדגימה וטבל את הקצה בקופסה מבודדת עם חנקן נוזלי. לאחר מכן, הסר בזהירות את כריך המנשא ממחזיק הדגימה, והניח אותו בקריוביאל מקורר מראש. אחסן את הקריוביאלים המכילים את המנשאים בקריוטנק עד לשכפול.

לפני הכנסת אקדח קרן האלקטרונים, הסר את המגן עם לוחית ההסטה. הנח את מד ההגדרה, למרכוז הנימה, לתוך תושבת הקולט דרך מכסה הקתודה התחתון. לאחר מכן, החלק את החוט החדש מעל המד, עד שלמינאי הלחץ מהדק את קצות הנימה.

לאחר מכן, הסר את מד ההגדרה והכנס את מוט הפחמן. תקן את זה, על ידי הידוק צ'אק הקולט של מחזיק מוט המאייד. הקפדה על כך שגובה קצה המוט נמצא באמצע הסליל השני מלמטה.

לאחר מכן, החלף את לוחית הסטה והכנס את אקדח קרן האלקטרונים ליחידת שבר ההקפאה. בהליך זה, התאם את הזרם והמתח לאידוי. לאחר מכן, הכנס את כריך המנשא הקפוא לשולחן ההעתק הכפול בחנקן נוזלי.

לאחר מכן, העבירו את שולחן ההעתק הכפול לכלי Dewar, וקבעו אותו למקלט שלב הדגימה בזווית של 45 מעלות. הרם את הטבלה הכפולה עם מניפולטור טבלה. הכנס אותו ליחידת שבר ההקפאה על הבמה הקרה, והמתן כ-20 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה של שולחן ההעתק הכפול להסתגל ל-115 מעלות צלזיוס שליליות.

לאחר מכן, שבר את הרקמה על ידי סיבוב הגלגל נגד כיוון השעון באופן ידני, המחובר לתכריך מעל שולחן העתק כפול. כאשר התכריך מסתובב, הוא מאלץ את שולחן ההעתק הכפול להיפתח, מה שגורם לשבירת הרקמה. שכבת פחמן מזווית של 90 מעלות מוחלת על הפנים השבורות.

לאחר מכן, הסר את הדגימות המשוכפלות משולחן ההעתק הכפול, והעביר אותן לצלחת קרמיקה של 12 בארות מלאה ב-TBS. בעזרת מוט תיל לולאה פלטינה, הסר את הרקמה המשוכפלת מנשא הדגימה. לעיכול SDS, העבירו העתק לבקבוקון זכוכית של ארבעה מיליליטר מלא במיליליטר אחד של מאגר עיכול SDS.

הניחו לו להתעכל במשך 18 שעות בחום של 80 מעלות צלזיוס עם ניעור. לתיוג חיסוני, שטפו את ההעתק במשך 10 דקות במאגר עיכול SDS טרי. לאחר מכן, דגרו אותו עם נוגדנים ראשוניים ומשניים, מדוללים ב-2% BSA-TBS, בתא לח ב-15 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות.

לאחר מכן, הרכיב את ההעתק על רשת מוטות מקבילים מצופה טופס של 100 שורות. דמיין את ההעתק עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב-80 או 100 קילו-וולט. לאחר מכן, רכוש את התמונות הדיגיטליות באמצעות מצלמת CCD.

כאשר הוא במצב לא מקוון, מצא את האזורים המתאימים בתמונה מהעותק המשוכפל, באמצעות ציוני דרך שונים. ארבעה שבועות לאחר הזרקת AAV, כדי לבטא את Channelrhodopsin-2 בקבוצת הגרעין התלמי האחורי, Channelrhodopsin-2 מועבר ביעילות אנטרוגרדית לאורך האקסונים התלמוסיים כדי להגיע למסות התאים המשולבות באמיגדלה. ניתן לזהות את ההתמחות הפוסט-סינפטית של סינפסות גלוטמטרגיות בהעתק כמקבץ של חלקיקים תוך-ממברניים על פני ה-E של קרום הפלזמה, ולעתים קרובות היא מלווה ב-P-face של האלמנט הפרה-סינפטי שלה.

כאן, קולטני Channelrhodopsin-2 וגלוטמט הודגמו באמצעות חלקיקי זהב בגדלים שונים המצומדים לנוגדנים המשניים. בגלל היעדר כלים מבניים או מולקולריים כדי לזהות על אותו העתק אם הממברנה הפוסט-סינפטית שייכת לנוירונים המשולבים. ההעתק המתאים סומן עבור קולטני אופיואידים mu, סמן לנוירונים אלה.

כדוגמה לניתוח הכמותי של צפיפות קולטני הגלוטמט בסינפסות אלה, הנה תרשימי הפיזור של מספר חלקיקי הזהב לקולטני אמפא לעומת האזור הסינפטי בקוצים ובדנדריטים. מה שחושף מתאם חיובי בשני המבנים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור, שהשלבים הבודדים תלויים זה בזה מאוד.

לכן, טעות באחד השלבים עלולה לסכן את כל ההליך. צפייה בחלק גדול מהתמחויות ממברנת הפלזמה על משטח דו מימדי של ההעתק, מאפשרת בדיקה של ההתפלגות המרחבית וההמשכיות הפיזית של מולקולות מעניינות ללא שחזור מייגע וגוזל זמן של קטעי ארטרופין סדרתיים. גישה זו יכולה לשמש חוקרים אחרים כדי לקבל תובנות לגבי קשרי מבנה-תפקוד של סינפסות ספציפיות במעגלים עצביים.

כאשר הוא מתיר את מקור התשומות ואת טבעם של האלמנטים הפוסט-סינפטיים. הוא קריטי, אבל בעייתי.