מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

המטרה הכוללת של ביו-אסאיי (bioassay) פשוט זה, המבוסס על תאים, היא לזהות, לכמת ולנטר את הפעילות של חברים במשפחת הליגנדים של הגורם לצמיחה של תאי אנדותל וסקולריים (vascular endothelial growth factor). שיטה זו יכולה לספק מענה לשאלות מפתח בביולוגיה וסקולרית, וירולוגיה, סרטן ואופתלמולוגיה, שבהם ליגנדים ממשפחת ה-VEGF מתווכים תהליכים מרכזיים במחלות אלו. היתרון העיקרי של בדיקה זו הוא שהיא מאפשרת להעריך ליגנדים ממשפחת ה-VEGF במונחים של יכולתם להיקשר ולהצליב את הקולטנים השונים שלהם, ללא צורך בתאי אפיתל ייעודיים.

תרבתו את שורת התאים WEHI-3D המפרישה IL3 על ידי העברה בפיפט של 5×10⁶ תאים בשלב הצמיחה הלוגריתמי לארבעה עד עשרה בקבוקי T175 המכילים 50 ml של מצע גידול טרי. דגרו למשך שבעה ימים או עד שהתאים יעברו את שלב הצמיחה הלוגריתמי בכ-24 עד 48 שעות. שפכו את הנוזל והתאים מהבקבוקים.

סבב בצנטריפוגה ב-1,000 Gs למשך 15 דקות כדי להסיר תאים ושאריות תאיות. לאחר מכן, הסר את 90% העליונים של העלייה (supernatant) וסנן אותם באמצעות יחידת סינון של 0.22 micron. חלק את המצע המותנה למנובות של 1 milliliter לצורך הכנת הבדיקה.

מנות של 50 milliliter להכנת מצע גידול למעבר של שורות תאים תלויות-גורם, ונפחים של 200 milliliter לאחסון לטווח ארוך ב-20 degree Celsius. יש לאחסן את הנפחים הקטנים יותר ב-20 Celsius. גדל תאי BAF3 בקרה במצע גידול המכיל 10%WEHI-3D conditioned medium.

ותאי VegFR2-EPoR-BAF3 באותו מצע מתוסף G418 בריכוז של 1 mg/mL. בצע מעבר לתאים בדילול של 1:15 מתאים הגדלים בפאזה לוגריתמית. קצור תאי BAF3 ביקורת או תאי VegFR2VPoR-BAF3 מתרביות הנמצאות במרכז הפאזה הלוגריתמית.

הוצא את התאים מהתחתית של הבקבוק באמצעות פיפוט עדין, וסבב בצנטריפוגה ב-750 Gs למשך חמש דקות כדי להשיג משקע של תאים. השהה מחדש את המשקע ב-10 milliliters של mouse tonicity phosphate buffered saline וסבב שוב בצנטריפוגה ב-750 Gs למשך חמש דקות. חזור על פעולת השטיפה פעמיים נוספות כדי להסיר את המצע המכיל IL3.

שטפו את התאים פעם אחת באמצעות מצע ללא מצע מותנה DEHI-3D. חשוב לשטוף את מצע התרבית המכיל IL3 כדי להבטיח שלא נותרו גורמי גדילה נוספים, שעלולים להוביל לתוצאה חיובית שגויה או לפעילות רקע גבוהה. לאחר הצנטריפוגציה והסרת הנוזל העליון, השהו שוב את התאים באותו מצע נטול IL3 בריכוז של 7.4 times 10 to the fourth תאים למיליליטר.

לבסוף, ערבבו נפחים שווים של trypan blue ב-PBS עם אוכלוסיית התאים והעבירו להמוציטומטר. ספרו לפחות 100 תאים. תאים שספגו את הצבע נחשבים למתים או גוססים.

חיוני שהתאים המשמשים למבחן יהיו בעלי חיוניות גבוהה כדי להבטיח שהם מסוגלים להגיב לתנאי המבחן. השתמשו בפיפט אוטומטי P20 מכויל היטב ובטיפים שעברו עיקור באוטוקלאב כדי להוסיף 1,000 תאים ב-13.5 µl של מצע דל ב-IL לבארות של פלטה בעלת 72 בארות. הקפידו לערבב את תגסוס התאים במהלך החלוקה למנות כדי להבטיח ששקיעת תאים עקב כבידה לא תגרום להטיה בריכוז התאים.

השתמשו בפיפט P2 מכויל היטב כדי להוסיף 1.5 µL של מצע ללא IL3 בשלוש חזרות לבאירי הביקורת. ערבבו בעדינות. באופן דומה, הוסיפו את מצע ה-conditioned של WEHI-3D בריכוז 10% ואת ביקורת ה-VegFA בריכוז 100 ng/mL ללא IL3 לבאירים הרצויים.

לבסוף, הוסיפו 1.5 microliters של דגימות הבדיקה בשלישייה. מלאו את הבארות שאינן בשימוש בלוחית המיקרו-בארים במים סטריליים, PBS או במצע גידול. הניחו נייר ספיגה ספוג במים בתוך מכל חדיר לגזים כדי ליצור תא לח שמאפשר חילוף גזים.

דגרו את פלטות הבדיקה בתאים באטמוספירה לחה של 10% carbon dioxide למשך 16 שעות. לאחר 16 שעות של דגירה, נתחו את הפלטות באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך סטנדרטי בהגדלה של 40 עד 100x. בשלב זה ניתן להבחין בין דגימות חיוביות לשליליות.

בבארים ללא תמיכה של גורמי גדילה או עם מדיום בלבד, ייראה מספר מופחת של תאים עגולים, וכן תאים מתים או גוססים ושיירי תאים. זאת לעומת תאים שהודגרו במדיום המכיל IL3 או ליגנד עבור VegFR2, שהם גדולים ושקופים, ובהם אין או שיש עדות מינימלית לגבביות בציטופלזמה של התא או לשיירי תאים בתרבית. העבירו 10,000 תאים שטופים ב-135 microliters של מדיום נטול IL3 לבארים של פלטה סטנדרטית בעלת 96 בארות.

השתמשו בפיפט P20 מכויל כדי להוסיף 15 µL של דגימות הבדיקה והביקרות לבארות. דגרו את תערובת התאים, גורמי הגדילה ו/או חומרי העיכוב כפי שבוצע קודם לכן למשך 48 שעות. עם סיום תקופת הדגירה, העריכו את מספר התאים החיוניים בבארות באמצעות השיטות המפורטות בחלק הכתוב של הפרוטוקול.

כאן מוצגות תוצאות של בדיקה שבה נעשה שימוש בבדיקה הביולוגית VEGF-R2 EPoR BAF3 כדי לכמת את הפעילות של שלושה ליגנדים אנושיים רקומביננטיים בעלי ספציפיות ל-VEGF-R2: VEGF-A165, VEGF-C ו-VEGF-D. הפעילות כומתה בנוכחות bevacizumab, נוגדן חד-שבטי מעכב ל-VEGF-A165, או בנוכחות trastuzumab, נוגדן שאינו מנטרל.

הנתונים נורמלו ביחס לתגובה ל-VEGF-A165 לבדו. כצפוי, bevacizumab חסם את ההשפעה של VEGF-A165 בבדיקה, אך לא השפיע על הפעילות של VEGF-C ו-VEGF-D. תאים שנחשפו ל-IL3 הפגינו חיוניות גבוהה.

בעוד שאלו שלא נחשפו לגורם גדילה נוסף מראים חיוניות נמוכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי קיימים מגוון סוכני בקרה במצע מותנה (conditioned media) שיש להכין לפני הבדיקה. טכניקה זו סללה את הדרך להתחדשות במחקרים בביולוגיה וסקולרית, וירולוגיה, סרטן ואופתלמולוגיה לבחינת תפקידו של VEG-FM בליגנים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת תאי הביו-אסאי (bioassay), ביצוע הבדיקה וניהול ניתוחים כמותיים או חצי-כמותיים של פעילות VEG-FM ligin.