רקמת 3D משולב תכנון הנדסי

המטרות הכוללות של מודל סרטן ריאות משולב זה במבחנה/בסיליקו הן לחקור את הרגישות של טיפולים ממוקדים לסרטן ריאות של תאים לא קטנים ולחזות את יעילותם של חומרים חדשים. מערכת מודל תלת מימד זו מאפשרת ניטור של תגובות ספציפיות לתאים לטיפולים ממוקדים או שילובים ישירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתחזיות המכוסות בסיליקו יכולות להקל על בדיקות תרופות פרה-קליניות בסביבה רלוונטית פיזיולוגית יותר.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בישויות גידול שונות, שכן ניתן להשתמש בה כדי לייעל את תחזיות התגובה לתרופות על סמך רקע מוטציוני ספציפי. מי שתדגים את ההליך תהיה, פרנציסקה שמיט, עוזרת מחקר, מהמעבדה שלנו. כדי להקים תרבית דינמית, התחל בתרבית מודל הגידול בתנאי תרבית סטטית, בכתר תא ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2, באינקובטור קונבנציונלי.

לאחר שלושה ימים, הרכיבו ביו-ריאקטור אוטוקלאב, והכניסו למערכת תת-רירית ביולוגית של המעי הדק בתוספת פיגום רירית. לאחר מכן, הוסף 45 מיליליטר של RPMI, בתוספת הכמות המתאימה של FCS לבקבוק וחבר את מכשיר הדגימה ללא מחט למערכת הצינורות בין הביוריאקטור לבקבוק המדיום. הכניסו את הביוריאקטור לתוך החממה וחברו אותו למשאבה כדי לתרבית את מודל הגידול, למשך 14 ימים נוספים, עם זרימה בינונית קבועה של שלושה מיליליטר לדקה.

כדי לטפל במודל גידול סטטי עם, גפיטיניב, ביום ה -11 לתרבית בחממה הקונבנציונלית, השתמש תחילה בפיפט פסטר כדי להסיר את המדיום הישן, מהבארות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של RPMI טרי, בתוספת FCS וגפיטיניב, לחלק הפנימי של כל כתר תא ו -1.5 מיליליטר לתחתית כל באר. כדי לאסוף את הדגימות של אליסה מתרבית דינמית, בימים 11 עד 14 של התרבית, חבר את המזרק למכשיר הדגימה והסר מיליליטר אחד של מדיום ממערכת הביוריאקטור.

לאחר מכן אחסן את הדגימות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס, עד לביצוע האליסה. כדי לקבוע את מספר הגרעינים החיוביים של Ki67, השתמש תחילה במיקרוסקופ הפוך כדי לקבל חמש תמונות פלואורסצנטיות של DAPI וחמש Ki67 של תרביות דו-ממדיות בהגדלה של פי 20 מכל מצב, מחלקים לא חופפים של הדגימה. כדי לספור ידנית את הגרעינים החיוביים של Ki67, פתח את התמונה שהופיעה בפיג'י ובחר, תוספים ומונה תאים, ולאחר מכן, לחץ על אתחול, בחר סוג מונה ולחץ על כל גרעין חיובי של Ki67.

מספר התאים שנלחצו יופיע לצד סוג המונה שנבחר. לספירת תאים אוטומטית של המספר הכולל של הגרעינים בתמונות הדו-ממדיות, הפעל את מקליט המאקרו, פתח תמונת DAPI ולחץ על תמונה, הקלד ו-8 סיביות, ולאחר מכן לחץ על שפר ניגודיות והגדר את הפרמטר הרווי לאחד ונרמל. לחידוד התמונה, קבעו את המסיכה שאינה מחודדת ברדיוס של 1 וברדיוס של 60.

כדי לאגד את התמונה, לחץ על סף אוטומטי ובחר בשיטת רני/אנטרופיה עם אובייקטים לבנים על רקע שחור. לאחר מכן, לחץ על תוספים, ואחריו BioVoxxel, ותכונה לא סדירה של קו פרשת המים, עם רדיוס שחיקה של חמש כדי להפריד בין התאים. לחץ על ניתוח, ונתח חלקיקים והגדר את הגודל ל-02 אינסוף וסמן סיכום.

מספר התאים יוצג בטבלת הסיכום כספירת. לאחר מכן, לחץ על צור, כדי לשמור את המאקרו כדי לאפשר ספירה אוטומטית של גרעינים, בתמונות נוספות של תרבית תאים דו-ממדית. לאחר שימוש במאגרי מידע ליצירת רשת גידולים, פתח את תוכנת ניתוח הרשת המתאימה, לחץ על קובץ וחדש, והזן מודלים של גידול

לחץ על אישור, כדי ליצור רשת חדשה, ולאחר מכן לחץ על ריבוע תקריב צפון ואישור, כדי לדמיין את הקולטן בממברנה כפולה. כדי להציג באופן חזותי את הצמתים כמלבנים, לחץ על חלבון כללי ולאחר מכן על EGFR ולאחר מכן Ok.To להוסיף תווית לצמתים ברשת, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשנות צבע וצורה והגדר את קודי הצבע של הצומת כפי שצוין. כדי להציג באופן חזותי את פרמטרי הקריאה כמשושים, בחר פנוטיפ, הזן התפשטות ולחץ על OK.

לאחר מכן, לחץ לחיצה ימנית ובחר שוב שנה צבע וצורה כדי להגדיר את קוד הצבע ל-255, 204, 204. כדי להציג באופן חזותי את הקצוות של אינטראקציות בין צומתים, לחץ על מעבר מצב עבור חיצי הפעלה, ועיכוב עבור חיצי עיכוב קהים. לאחר מכן, לחץ על קובץ ושמור בשם, ושמור את רשת האיתות שנוצרה, כמו models.xml גידול

לניתוח מצב יציב של שיווי המשקל של המערכת, פתח את תוכנת SQUAD, לחץ על טען רשת והעלה את קובץ models. xml הגידול jove. לחץ, הפעל ניתוח.

כדי לכתוב פרוטוקול סימולציה, לחץ על מתקדם ו-pertubator, ולאחר מכן לחץ על ערוך פרוטוקול, כדי לדמות את ההתנגדות ל-anit-EGFR. לאחר מכן, לחץ, פרטובציה ובחר את המצב ההתחלתי הסטנדרטי שווה למצב יציב ארבע. לחץ על הוסף, כדי להוסיף את הדופק הקבוע החדש, ולאחר מכן בחר את פרמטר המצב והגדר את היעד ל-FLIP, את הזמן לאפס ואת הערך ל-4.

לחץ, בסדר, והגדר את המצבים עבור c-MET ו-Gefitinib, באותו אופן. כדי להגדיר ערך מצב לצומת EGFR הפעיל, לחץ על צומת פעיל ולאחר מכן לחץ על ערוך. הגדר את המצב ל-8 ולחץ על אישור.

לחץ על אישור כדי לשמור את הפרוטוקול. כדי להציג את העקומות הספציפיות, תחת לוח האפשרויות, בחר EGF-EGFR, כוכב EGF-EGFR, כוכב Mek, קספאזות, PI3K, Gegitinib, אפופטוזיס, התפשטות, מעכב MEk ומעכב PI3K. לאחר מכן, לחץ על אתחול והפעל כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכות.

כדי לדמות טיפול משולב במעכבי PI3K ו-Mek, לחץ על ערוך פרוטוקול. לאחר מכן, תוך שימוש באותו פרמטר צומת כפי שהודגם זה עתה, לחץ על צינור, ואחריו הוסף, כדי להוסיף פולס קבוע חדש. לאחר מכן, בחר פרמטר מצב, והגדר את היעד למעכב PI3K, את הזמן לאפס ואת הערך לאחד, ולחץ על אישור.

לחץ על הוסף, שוב, כדי להוסיף עוד פולס קבוע חדש ותחת פרמטר המצב, הגדר את היעד למעכב Mek, הגדר את הזמן לאפס ואת הערך לאחד, ולחץ על אישור, ואחריו אישור שוב, כדי לשמור את הפרוטוקול. תחת לוח האפשרויות, תוך שימוש באותם צמתים לייצוג הגרפי כפי שהודגם זה עתה, לחץ על אתחול והפעל כדי להתחיל סימולציה מלאה של תגובת המערכות. לאחר מכן, כדי לסיים את הסימולציה, לחץ על איפוס.

מערכת בדיקת גידול תלת מימדית זו, מקלה על קביעת מדד ההתפשטות. וכימות האפופטוזיס באמצעות M30 Elisa. בניסוי מייצג זה, למשל, רק תאי גידול HCC827 שעברו מוטציה ב-EGFR, שהודגרו בתנאי תרבית סטטית, הגיבו לעיכוב גורם גדילה אפידרמלי.

על ידי מעכב טירוזין-קינאז, גפיטיניב, כפי שמעידה העלייה באפופטוזיס שנצפתה במערכת מודל הגידול HCC827. כאן מוצגות תמונות מייצגות של מודלים סטטיים של גידולים תלת מימדיים, עם או בלי, משרה מעבר אפיתלי-מזנכימלי, סימולציה TGF-beta-1. שימו לב לעלייה בביטוי הווימנטין, בתרביות תאי הגידול המטופלות.

בתנאים דינמיים, גפיטיניב מפעיל השפעה חזקה על תאי HCC827 שעברו מוטציה ב-EGFR, כפי שמעידה הירידה במבנים דמויי רקמה, בנוכחות מעכב טירוזין-קינאז, בהשוואה לתרבית מבוקרת שלא טופלה. בגרף זה, נצפתה סימולציה של הדחף הידוע במוטציה, הפעלה משותפת של EGFR ו-c-MET, וקצב התפשטות מוגבר, ושיעור אפופטוזיס מופחת בתאי HCC827, לאורך זמן, המשקף עמידות המושרה על ידי גפיטיניב המתואמת עם הפעלת MEK ו-PI3K. ואכן, מידול של מעכבי PI3K ו-MEK המשולבים מביא להיפוך של אפקט העמידות נגד EGFR, הפחתה בהתפשטות ואינדוקציה של אפופטוזיס.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Western Blot או כדי לחקור מסלולי איתות במורד הזרם. יתר על כן, מערכות תרבית משותפת עם סוגי תאים שונים עשויות לשמש גם לניתוח הדיבור ההדדי בין תאים שונים בסביבת המיקרו של הגידול. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום פיתוח התרופות לחקור את יעילות התרופות בסיליקו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחזות את יעילות התרופות בקבוצות חולים מרובדות, על ידי הדמיית שינויי איתות וניתוח תגובות המערכת המתקבלות במוטציות ורקעים שונים.