יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מכשיר דגימה בקנה מידה מיקרו, ה-Single-probe, לניתוח תאים בודדים חיים באמצעות ספקטרומטריית מסה בתנאי סביבה. ולבצע הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקרים ביולוגיים ותרופות.

כגון מהן המולקולות הקיימות בתאים בודדים חיים, וכיצד הן מופצות ברקמות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהגשושית היחידה היא מכשיר רב תכליתי שיכול לשמש הן לניתוח תאים בודדים חיים והן לניסויי הדמיה של ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. למרות ששיטה זו יכולה לנתח תאים ורקמות בודדים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות שבהן רצוי דגימה בקנה מידה מיקרו, כגון ניתוח ספאר של כימיקלים ומיקרו-מושבות חיות וביופילמים.

מי שידגים איתי את ההליך יהיה ווי ראו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. הניחו איבר עכבר שלם מעניין במרכז באר פלסטיק קטנה. טבלו את האיבר בתרכובת הטמעת רקמות עד לגובה של כ-10 מ"מ.

הנח מיד את הרקמות בחנקן נוזלי להקפאת בזק. כדי להכין את קטע רקמת העכבר, קחו את איבר העכבר הקפוא והפשירו ל-15 מעלות צלזיוס בקריו-מיקרוטום מבוקר טמפרטורה. אבטח את הרקמה על בסיס פלדה עם כ-500 מיקרוליטר של תרכובת הטמעת רקמות, והנח על תושבת חתך קריו-מיקרוטום כך שכיוון החיתוך הרצוי יוצג לסכין.

חתכו את הרקמה לעובי של 12 מיקרון. לאחר מכן, הניחו את פרוסות הרקמה החתוכות על שקופיות מיקרוסקופ פוליקרבונט והשאירו אותן לייבוש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השג דגימת תא, כגון 1 מיליליטר של תרחיף תאי HeLa, והוסף אותה ל-9 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם בצלחת תרבית תאים סטנדרטית בגודל 10 ס"מ.

שמור את התאים בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2 למשך יומיים-שלושה, עד שמשטח הגידול מכוסה ב-70-80% על צלחת תרבית התאים. בצע מעבר תאים בצלחת תרבית התאים. לשם כך, שאפו את מצע הגידול ושטפו את התאים ב-5 מ"ל של מי מלח 1x פוספט.

הסר את ה-PBS באמצעות קצה שאיפה סטרילי ודגר על התאים עם 2.5 מ"ל טריפסין למשך כ-5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים מצלחת התרבית. עצור את פעילות הטריפסין על ידי הוספת 7.5 מ"ל של מדיום תרבית תאים שלם ולאחר מכן, השעיה אחידה של התאים. כדי להכין את דגימות התאים לספקטרומטריית מסה של תא יחיד, או ניסוי SCMS, הנח תחילה מגלשות מיקרו-כיסוי בודדות לבארות של צלחת של 12 בארות.

לאחר מכן, הוסף לבאר 1.8 מ"ל של מדיום תרבית תאים ו-0.2 מ"ל תרחיף תאים. ערבבו בעדינות את התאים עם תסיסה קלה של הצלחת לפני הדגירה בסביבת 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס, למשך כ-24 שעות. כדי לבצע טיפול תרופתי בתאים המתורבתים, הוסף תמיסת תרכובת תרופה לצלחת תרבית התאים בת 12 הבארות.

הנח את צינור הקוורץ בעל הקידוח הכפול לתוך מושך מיקרו-פיפטה בלייזר, ומשוך מחט קוורץ כפולה. כנקודות התחלה, הגדר את החום ל-400, את החוט לשלוש, את המהירות ל-80, את העיכוב ל-150 ואת המשיכה ל-250. חותכים את קצה המשיכה כך שיישארו כ-5 מ"מ של נימי קוורץ דו-קדמיים לא נמשכים בקצה השני.

חותכים קטע של 80 מ"מ של נימי סיליקה התמזגו כנימים המספקים ממס. לאחר מכן הכנס את הנימים לתוך קדח אחד בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת הקדח הכפול. שימוש בלהבה כדי למשוך נימי סיליקה התמזגו כפולט nanoESI, חתוך לאורך 7-10 מ"מ והכנס אותו לתוך הקדח השני בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת הקדח הכפול.

מרחו כמות מינימלית של שרף ריפוי UV על הקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת הקדח הכפול. מצק את השרף באמצעות מנורת LED UV למשך כ-20 שניות, כדי לאבטח את הנימים המספקים ממס ואת פולט ה-nanoESI. לאחר מכן, חותכים שקופית זכוכית מיקרוסקופ רגילה לשניים לאורכה.

לאחר מכן, הנח את הגשושית היחידה על קצה אחד של מגלשת הזכוכית, כך שפולט ה-nanoESI מופנה כלפי חוץ. מרחו את האפוקסי הרגיל על גוף הגשושית היחידה כך שהיא תיקבע על מגלשת הזכוכית לפני שתשאיר למשך הלילה להתקשות. מערכת זו כוללת אוגן ממשק מקור יונים מותאם אישית של ספקטרומטר המסה, ולוח אופטי מאלומיניום המחובר למיקרוסקופ דיגיטלי USB, שלב תרגום XYZ ידני מיניאטורי ומערכת שלב התרגום XYZ הממונעת.

שנה את אוגן ממשק מקור היונים של ספקטרומטר המסה ויצר את המעמד של הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. חבר את הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי ששונה, מיקרוסקופ דיגיטלי USB, שלב תרגום XYZ ידני מיניאטורי עם מחזיק מהדק גמיש, ומערכת שלב התרגום XYZ הממונעת ללוח האופטי מאלומיניום. השתמש בגמיש clamp מחזיק כדי לתקן את מגלשת הזכוכית המחוברת עם בדיקה אחת.

לאחר מכן, חבר את מערך הבדיקה היחידה לספקטרומטר המסה. כוונן את הגמיש clamp מחזיק ואת שלב ה- XYZ המיניאטורי, כדי למקם את הפולט של הגשושית היחידה מול כניסת ספקטרומטר המסה. הפשירו את קטע הדגימה בטמפרטורת החדר, והניחו אותו על מערכת שלב התרגום XYZ הממונעת מתחת לבדיקה היחידה.

התאם את מיקום המדגם על ידי שינוי הקואורדינטות בתוכנת הבקרה. השתמש במזרק כדי לשאוב את ממס הדגימה בקצב מתאים. ואז, הפעל את מתח היינון.

התאם את גובה הגשושית הבודדת כך שהיא תנוח ממש מעל פני הדגימה, ותוכל לבצע מיצוי פני השטח של מטבוליטים. הרם בזהירות את Z stage, ולאחר מכן השתמש במיקרוסקופ הדיגיטלי USB כדי לנטר את שינוי המרחק בין קצה הבדיקה היחידה למשטח הרקמה. הגדר את הפרמטרים להוספת רסטר במקטע המעניין בתוך המדגם.

עבור מקטעי הכליות של העכבר המוצגים כאן, השתמש במהירות רסטר של 10 מיקרומטר לשנייה ובמרחק של 20 מיקרומטר בין השורות. הגדר את הפרמטרים להוספת רסטר במקטע המעניין בתוך המדגם. עבור מקטעי הכליות של העכבר המוצגים כאן, השתמש במהירות רסטר של 10.0 מיקרומטר לשנייה, ובמרחק של 20 מיקרומטר בין השורות.

הגדר שיטה לרכישה אוטומטית של ספקטרום MS מספקטרומטר המסה. עבור MSI ברזולוציית מסה גבוהה על דגימת כליה של עכבר, השתמש ברזולוציית מסה של 60, 000, מצב חיובי של 5kV, מיקרוסריקה אחת, זמן הזרקה מקסימלי של 150 אלפיות השנייה ובקרת רווח אוטומטית. התחל את רכישת הנתונים של MSI ולאחר מכן בנה תמונות MS מקבצי MS גולמיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הגדר את מערכת הבדיקה היחידה לפי ההוראות עבור MSI והתאם את קצב זרימת הממס. שטפו את התאים המתורבתים המחוברים על שקופיות הזכוכית עם PBS כדי להסיר מדיה תרבותית ורכיבי תרופות חוץ-תאיים. לאחר מכן הנח את מגלשת הזכוכית המכילה תא על מערכת שלב התרגום XYZ הממונעת לניסוי.

מקד את הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי מעל הדגימה, על קצה הגשושית הבודדת כדי לנטר את חדירת התאים במהלך הניתוח. השתמש במיקרוסקופ הדיגיטלי USB בצד הגשושית היחידה כדי לנטר את תנאי העבודה של פולט ה-nanoESI בבדיקה היחידה. השתמש בתוכנית בקרת ה-XYZ הממונעת ובסטריאומיקרוסקופ דיגיטלי כדי לאתר תא מעניין ולמקם במדויק את קצה הבדיקה היחידה מעל הדגימה.

התחל ברכישת נתוני MS לפני הכנסת קצה הבדיקה היחידה לתא. הורד את הצלחת המכילה תא כדי למשוך את קצה הגשושית היחידה החוצה מהתא. לבסוף, הניחו לממס לזרום במשך כשלוש דקות, כדי לשטוף לחלוטין את הגשושית היחידה.

הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית של קטעי כליות של עכבר, וניתן לזהות מספר רב של מולקולות הקיימות על פני הרקמה. התפלגות המרחב והשפע היחסי של מולקולות מרובות על פני הרקמה תווו. רזולוציה מרחבית של 8.5 מיקרון הושגה באמצעות תצפית על מעברים חדים של תכונות הקיימות בנתוני ספקטרומטריית המסה.

ייצור הגשושית היחידה עם קצה חד ותעלות פתוחות הוא קריטי לניתוח תא בודד. יש צורך במיקרוסקופים כדי לאתר את תאי המטרה ולפקח על תהליך חדירת התאים. שינוי האות מספקטרום המסה מספק גם מידע נוסף לאישור חדירת התאים.

מספר רב של מולקולות זוהו מתאים בודדים חיים. כאשר משתמשים בהם למחקרי תרופות אנטי-סרטניות, ניסויים בתאי בקרה משמשים כדי להראות את ההבדל בטיפול תרופתי נגד סרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד מייצרים את הגשושית היחידה, וכיצד מכשיר זה משמש לניתוח ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספקטרומטריית מסה של תא בודד וסביבה של רקמות ביולוגיות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שיש צורך בהוראות מפורטות כדי לייצר את מכשיר הבדיקה היחידה, להגדיר את המערכת כולה ולהפעיל את המכשירים. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ניתוח התא הבודד ברציפות עבור תאים רבים. וכל ניתוח לוקח פחות משלוש דקות.

סיום ניסוי הדמיית טרשת נפוצה סביבתי עשוי להימשך מספר שעות, תלוי בגודל המדגם, ברזולוציה המרחבית ובספקטרומטר המסה בו נעשה שימוש. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שייצור בדיקה בודדת איכותית הוא שלב המפתח. בנוסף, כוונון ותפעול המכשיר הם קריטיים לביצוע ניסוי מוצלח.

ניתן לפתח שיטות אחרות בהתאם להליכים דומים לאלה המוצגים כאן. לדוגמה, ניתן להוסיף ריאגנטים לממס הדגימה ולבצע ניתוח תאי בודד תגובתי ו-MSI סביבתי כדי לשפר את זיהוי המולקולות מהדגימות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים הן בניתוח תאים בודדים והן במחקרי הדמיית ספקטרומטריית מסה בתנאי סביבה.

טכניקה זו יכולה לשמש פוטנציאלית למחקר ביולוגיה של התא, מחקרי פרמקולוגיה ובדיקות קליניות. אל תשכח שעבודה עם נימי קוורץ חדים ואפוקסי לריפוי UV עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומשקפי בטיחות UV בעת ביצוע הליך זה.