Name: יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: למד כיצד לבצע הדמיית ספקטרומטריית מסה בתנאי הסביבה וניתוח תא יחיד חי באמצעות מכשיר Single-probe. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות וחקר התפלגות מולקולות ברקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לד"ר לסקין (המעבדה הלאומית של צפון מערב האוקיינוס השקט) על שיתוף תוכנת בקרת הבמה הממונעת ותוכנית ההדמיה של MSI. אנו מודים גם לד"ר מאו (אוניברסיטת אוקלהומה) על מתן דגימות איברים של עכברים, ולמר צ'אד קנינגהם (אוניברסיטת אוקלהומה) על הסיוע בעיבוד שבבי ובאלקטרוניקה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר של קמפוס נורמן של אוניברסיטת אוקלהומה, פרס האגודה האמריקאית לחקר ספקטרומטריית מסה (בחסות תאגיד ווטרס), מרכז אוקלהומה לקידום המדע והטכנולוגיה (מענק HR 14-152) והמכונים הלאומיים לבריאות (R01GM116116).

<ol><li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+depth+profiling+by+mass+spectrometry-SIMS%2C+MALDI+or+DESI%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and depth profiling by mass spectrometry-SIMS, MALDI or DESI?</a> Analyst. 136 (11), 2199-2217 (2011).</li>
<li>Schwamborn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mass+spectrometry+in+biomarker+discovery+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Imaging mass spectrometry in biomarker discovery and validation.</a> J. Proteomics. 75 (16), 4990-4998 (2012).</li>
<li>Schwamborn, K., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+-+Painting+Molecular+Pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">MALDI Imaging Mass Spectrometry - Painting Molecular Pictures.</a> Mol Oncol. 4 (6), 529-538 (2010).</li>
<li>Kraft, M. L., Klitzing, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+lipids+with+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging lipids with secondary ion mass spectrometry.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1841 (8), 1108-1119 (2014).</li>
<li>Wiseman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desorption+electrospray+ionization+mass+spectrometry%3A+Imaging+drugs+and+metabolites+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18120-18125 (2008).</li>
<li>Nemes, P., Woods, A. S., Vertes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+small+metabolites+and+lipids+in+rat+brain+tissues+at+atmospheric+pressure+by+laser+ablation+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of small metabolites and lipids in rat brain tissues at atmospheric pressure by laser ablation electrospray ionization mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 82 (3), 982-988 (2010).</li>
<li>Laskin, J., Heath, B. S., Roach, P. J., Cazares, L., Semmes, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Imaging+Using+Nanospray+Desorption+Electrospray+Ionization+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Imaging Using Nanospray Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84 (1), 141-148 (2012).</li>
<li>Wu, C., Dill, A. L., Eberlin, L. S., Cooks, R. G., Ifa, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+imaging+under+ambient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass.+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry imaging under ambient conditions.</a> Mass. Spectrom. Rev. 32 (3), 218-243 (2013).</li>
<li>Altschuler, S. J., Wu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity%3A+do+differences+make+a+difference%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity: do differences make a difference?</a> Cell. 141 (4), 559-563 (2010).</li>
<li>Amantonico, A., Urban, P. L., Fagerer, S. R., Balabin, R. M., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+MALDI-MS+as+an+Analytical+Tool+for+Studying+Intrapopulation+Metabolic+Heterogeneity+of+Unicellular+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-Cell MALDI-MS as an Analytical Tool for Studying Intrapopulation Metabolic Heterogeneity of Unicellular Organisms.</a> Anal. Chem. 82 (17), 7394-7400 (2010).</li>
<li>Passarelli, M. K., Ewing, A. G., Winograd, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lipidomics%3A+characterizing+and+imaging+lipids+on+the+surface+of+individual+Aplysia+californica+neurons+with+cluster+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell lipidomics: characterizing and imaging lipids on the surface of individual Aplysia californica neurons with cluster secondary ion mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 85 (4), 2231-2238 (2013).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+metabolite+and+lipid+analysis+of+Xenopus+laevis+eggs+by+LAESI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Subcellular metabolite and lipid analysis of Xenopus laevis eggs by LAESI mass spectrometry.</a> PLoS One. 9 (12), e115173(2014).</li>
<li>Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+single-cell+video-mass+spectrometry+for+cellular+and+subcellular+molecular+detection+and+cell+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification.</a> J. Mass. Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+metabolic+analysis+of+single+plant+cells+by+capillary+microsampling+and+electrospray+ionization+mass+spectrometry+with+ion+mobility+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation.</a> Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Tissue+Imaging+Using+the+Single-probe+Mass+Spectrometry+under+Ambient+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High Resolution Tissue Imaging Using the Single-probe Mass Spectrometry under Ambient Conditions.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 26 (6), 986-993 (2015).</li>
<li>Pan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-probe%3A+a+miniaturized+multifunctional+device+for+single+cell+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis.</a> Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).</li>
<li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+High+Resolution+Spatial+Mass+Spectrometric+Data+during+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%222012+Annual+International+Conference+of+the+Ieee+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society+%28Embc%29%22%5BJournal%5D)">Visualization of High Resolution Spatial Mass Spectrometric Data during Acquisition.</a> 2012 Annual International Conference of the Ieee Engineering in Medicine and Biology Society (Embc). , 5545-5548 (2012).</li>
<li>Luxembourg, S. L., Mize, T. H., McDonnell, L. A., Heeren, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-spatial+resolution+mass+spectrometric+imaging+of+peptide+and+protein+distributions+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-spatial resolution mass spectrometric imaging of peptide and protein distributions on a surface.</a> Anal. Chem. 76 (18), 5339-5344 (2004).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OSW-1%3A+a+natural+compound+with+potent+anticancer+activity+and+a+novel+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">OSW-1: a natural compound with potent anticancer activity and a novel mechanism of action.</a> J Natl Cancer Inst. 97 (23), 1781-1785 (2005).</li>
<li>Rao, W., Pan, N., Tian, X., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Ambient+MS+Imaging+of+Negative+Ions+in+Positive+Ion+Mode%3A+Using+Dicationic+Reagents+with+the+Single-Probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Ambient MS Imaging of Negative Ions in Positive Ion Mode: Using Dicationic Reagents with the Single-Probe.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 27 (1), 124-134 (2016).</li>
<li>Ostrowski, S. G., Kurczy, M. E., Roddy, T. P., Winograd, N., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+ion+MS+imaging+to+relatively+quantify+cholesterol+in+the+membranes+of+individual+cells+from+differentially+treated+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secondary ion MS imaging to relatively quantify cholesterol in the membranes of individual cells from differentially treated populations.</a> Anal. Chem. 79 (10), 3554-3560 (2007).</li>
</ol>

אין לנו ניגוד אינטרסים להצהיר על העבודה המוצגת כאן.

The-בדיקה האחת היא מכשיר רב תכליתי, שניתן להשתמש בם עבור שני ניסויי MSI ו- SCMS. ההתקנה חד הבדיקה (כולל מערכות במת תרגום, מיקרוסקופים, מקורב ממשק מקור יון, וכו &#39;) נועדה לשמש מרכיב הרחבה כי ניתן להתאים בגמישות ספקטרומטר המסה הקיימת. חילופי דברים מהירים בין התקנה חד החללית לבין מקור יון ESI קונבנציונלי יכול להיות מושלם בתוך דקה אחת. באופן עקרוני, באמצעות מקורבות הממשק המתאימות יון המקור, ההתקנה חד הבדיקה יכולה להיות מותאמת לכל ספקטרומטרים המוני אחרים. בנוסף, ממס הדגימה המכיל מגוון של חומרים כימיים ניתן להשתמש עם ההתקנה יחידה בדיקה לניסויי MSI ו- SCMS תגובתי, אשר משפרת באופן משמעותי האיתור של טווח רחב של ביומולקולות. בנוסף לרקמות חית שורות תאים, את החללית היחידה היא גם מסוגלת לנתח מערכות ביולוגיות אחרות כגון צמחים. לכן, עם אותה התקנה ניסיונית ואימון משתמש דומה, מגוון רחב של מחקרים יכול להתבצע באמצעות מכשיר יחיד על ידי אותם משתמשים, המאפשר ניסויים יעילים צדדיים כדי להיות מושלמים עם זמן ההכשרה המינימאלי ועלות מכשור. המרכיב העיקרי של הטכניקה MS חד החללית היא החללית עצמה. איכות-בדיקה אחת יש השפעה משמעותית על תוצאות הפעילות שלה, אשר קובע במידה רבה את איכות הן ניסויים MSI ו- SCMS. כאשר בודה-בדיקות יחידות, לוודא כי הנימים הפנימיות של הצינורות הכפולים הנישאים מודבקות היטב לחסל את הסיכוי של דליפה ממסה במהלך הניסויים. זה קריטי כדי להשתמש במינימום של אפוקסי לריפוי UV, כך הנקבים והנימים אינם סתומים במהלך ייצור הבדיקה. הסינגל-החללית נעשה שימוש כדי לנהל MSI הסביבה ברזולוציה מרחבית גבוהה המונית על דגימות ביולוגיות 15. היתרון העיקרי של סביבת MSI עלשיטות שאינן סביבה היא כי הכנת מדגם נשמרת לכל הפחות ללא צורך בסביבת דגימת ואקום, מאפשר מדגם להיות מנותחים במצב 8 יליד קרוב. אחד המכשולים העיקריים עבור טכניקת סביבת MSI ביותר האחרת כבר חוסר של רזולוצית מרחבית 1. בהשוואת desorption המבוסס MSI טכניקות (כגון דסי ו LAESI), בגודל טיפ הקטן של-הבדיקה היחידה מאפשר שאיבת מייקרו נוזלי משטח חזקה יותר ויעילה להתבצע על פני שטח קטן, שתוביל לפתרון מרחבית גבוה של 8.5 מיקרומטר, אשר הוא בין אלה הגבוהים ביותר מושגת באמצעות טכניקות MSI סביבת 15. בנוסף, התאמת הרכיבים של ממס הדגימה מספק גמישות נוספת כדי לבצע את הניסויים. לדוגמא, דגימת ממסים המכילים חומרים כימיים (למשל, תרכובות dicationic) שמשה לביצוע ניסויי MSI תגובתי, המאפשר גידול משמעותי במספר מטבוליטים PE המזוהיםr ניסוי 20. היתרון השני של-הבדיקה אחת הוא העיצוב המשולב, אשר מספק את קלות התפעול במהלך תהליך רכישת נתונים כולו. בגלל המרחק בין קצה משטח רקמות רגיש מאוד עבור עוצמת אות יון ויציבות, קבלת קטע רקמה שטוחה וניצוח משטח משטחת התאמה כדי למזער את שונות המרחק הוא מפתח לניסויי MSI באיכות גבוהה. מכאן נובע כי טכניקות MSI חד החלליות אינן מתאימות כדי להשיג תמונות MS מרחבית גבוהות של משטחים לא ישרים. בנוסף בודה בדיקה באיכות גבוהה, בזהירות כוונון כלי חיוני עבור ניסוי MSI מוצלח. בין כל שלבי הכוונון, התאמת גובה הטיפ חד החללי מעל פני קטע הרקמה היא אחד הקריטי ביותר. כאשר התאמת גובה הבדיקה, לשאוב ממס הדגימה ולהדליק את מתח היינון, כך אותות יון רקע הממס רק יכולים להיות observed. ולאחר מכן לעקוב אחר השינוי של הספקטרום ההמוני תוך בחינה זהירה צמצום המרחק-פני בדיקה על ידי הרמת Z-הבמה מהמונע עד אותות יון חזקים ויציבה מן קטע רקמה ניתן לצפות; גובה בדיקה זו תשמש לאיסוף נתונים MSI במהלך הניסוי. בנוסף, קצב זרימה ממס אופטימיזציה חיוני ניסויי MSI. התאם את קצב הזרימה עם גובה הבדיקה המותאמת. ודאו שאין התפשטות ממיס על פני שטח הרקמות (כלומר, קצב זרימה הוא גבוה מדי) או היווצרות בועה בתוך פולט ננו-ESI (כלומר, קצב זרימה נמוך מדי). The-בדיקה האחת היא מכשיר רב תכליתי עבור bioanalysis. בנוסף ניסויים MSI, הוא מסוגל לנהל כמעט בזמן אמת ב- situ SCMS להבהיר מידע כימי מפורט מתאי איקריוטיים חי 16, וזה יתרון גדול לעומת ואקום אחרים טכניקות SCMS מבוסס (כגון MALDI 10 ו SIMS 21 </sup&gt;). גדליו הקטנים של הקצה החללי מספקים את היכולת להיות מוכנס לתוך תא אוקריוטים חיים ולמיצוי ליינן התרכובות התאיות לניתוח MS מיידי. באופן דומה, ממסי הדגימה המכילים חומרים כימיים (למשל, תרכובות dicationic) יכולים לשמש בניסויי SCMS, ומגוון רחב של מרכיבים הסלולר ניתן לאתר בתא בודד חי מאשר אי פעם בעבר (מחקר מתמשך, נתונים אינם מוצגים). למרות שהניתוח בזמן האמת יספק את הפרופילים הכימיים של תאי בודדים חיים, בגלל החדירה לתא של קרום וסחיטת תוכן סלולארי, התא תחת החקירה ייהרג לאחר הניסוי, רומז כי טכניקת SCMS חד החללית נמצאת כעת עדיין שיטה הרסנית. בנוסף, את הקצה החללי הפולט ננו-ESI ב-הבדיקה האחת יכולים להיות סתומים בקלות עבור משתמשים לא מנוסים. כדי להקטין את הסיכוי של סתימת המכשיר, להבטיח כדי להימנע ממגע הגרעין כאשר הכנסת קצה חד החללית לתוך cell. אם סתימה מתרחשת, המכשיר יכול להיות מחדש על ידי מתחמם את הקצה החללי הסתום או ננו-ESI פולט באמצעות סליל חימום מהרכבת 16. מגבלה נוספת של הטכניקה SCMS חד החללית היא שתאי דבק בלבד (כלומר, תאים המחוברים משטחים) ניתן לנתח באמצעות תוכנית ההתקנה הנוכחית. עם זאת, על ידי שילוב מערכת מניפולצית תא לתוך מנגנון MS חד החללי, סוגים רחבים יותר של תא יכולים להיחקר בעתיד. בדומה לניסוי MSI, קבלת בדיקה באיכות גבוהה ושער זרימת ממס אופטימיזציה הוא קריטי עבור מחקרי SCMS. כאשר כוונון קצב הזרימה הממס, הקצה חד החללי ממוקם מעל המדגם (כלומר, ללא מגע עם המדיום הסלולרי או תרבות), ולוודא כי אין מטפטף ממס מקצה הבדיקה או היווצרות בועה בתוך ננו-ESI פולט.

הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) היא טכניקת הדמיה מולקולרית חדשה יחסית המספקת את ההתפלגות המרחבית של התרכובות המעניינות על משטחים. במהלך ניתוח MSI, מדידות ספקטרומטריית מסה (MS) נרשמות על פני השטח על בסיס פיקסל בודד כדי ליצור תמונה דו-ממדית של המין המעניין 1. לטכניקות MSI יש את היכולת לספק התפלגות תכונות מרחבית עבור מגוון גדול של מטבוליטים, מה שמאפשר לקבל כמות גדולה בהרבה של מידע מדגימה מאשר משימוש בטכניקות הדמיה מולקולרית מסורתיות, ויש להן פוטנציאל לשפר מאוד את ניתוח הדגימות הביולוגיות למחקרים ביולוגיים ופרמקולוגיה 2. ניתן להפריד את MSI באופן נרחב לגישות לא-סביבתיות וסביבתיות. טכניקות ניתוח MSI שאינן סביבתיות, כגון יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI) MS 3 וזמן טיסה יון משני MS (ToF SIMS) 4, מסוגלות לרזולוציה מרחבית גבוהה (בסביבות 5 מיקרומטר ו-100 ננומטר, בהתאמה) ורגישות גבוהה. עם זאת, שיטות אלו דורשות הכנת דגימה נרחבת, כגון יישום מולקולות מטריצה על פני הדגימה, וסביבת דגימת ואקום, שיכולה להכניס חפצים לנתונים המתקבלים. טכניקות סביבה כגון יינון אלקטרו-ספריי ספיגה (DESI) MS 5, יינון אלקטרו-ספריי אבלציה בלייזר (LAESI) MS 6 וננו-DESI MS 7 מסוגלות ל-MSI של דגימות עם מעט או ללא הכנה מוקדמת בסביבה הסביבתית, המסוגלת לייצר תמונות MS שעלולות לשקף את הדגימה במצבה המקורי ביותר. עם זאת, רוב הטכניקות הללו בדרך כלל חסרות את הרזולוציה המרחבית הגבוהה ורגישות הזיהוי בהשוואה לטכניקות שאינן סביבתיות, כאשר ניסויים נערכים בדרך כלל בסביבות 150 מיקרומטר לפיקסל 8.
ניתוח תאים בודדים (SCA) הוא תחום צומח שיש לו את היכולת לאפיין את ההרכב הכימי של דגימות ביולוגיות ברמה התאית. SCA מאפשר ניתוח של מערכות ביולוגיות ברמה בסיסית יותר מטכניקות ניתוח תאים מסורתיות, המייצרות תוצאה ממוצעת של אוכלוסיית תאים, מה שעשוי לספק תובנות שבעבר היו בלתי פתירות 9. טכניקות MS יושמו לאחרונה על SCA (המכונה ספקטרומטריית מסה של תא בודד או SCMS) באמצעות טכניקות לא סביבתיות כגון MALDI MS 10 ו-ToF SIMS 11 שבהן תאים מטופלים מראש לפני הניתוח, ועם טכניקות סביבה כגון LAESI MS 12 ושיטות מיצוי ישירות, כגון וידאו חי של תא יחיד-MS 13, 14לנתח מגוון רחב של סוגי תאים כגון ביצים, צמחים וסרטן., לטכניקות הסביבה יש יתרון בכך שהן מיושמות על תאים חיים, מה ששוב ממזער את החפצים, מה שמוביל לייצוג טוב יותר של המטבוליטים בתאים החיים. עם זאת, השיטות המבוססות על מיצוי ישיר שתוארו לעיל מבצעות את תהליך מיצוי וניתוח הדגימה בשני שלבים שונים, מה שמביא לפער זמן במהלך הניתוח שעלול לשנות את המטבוליטים הקיימים בתוך הדגימה. 
הגשושית היחידה, מכשיר רב תכליתי ממוזער המסוגל להוביל MSI סביבתי ברזולוציה מרחבית גבוהה על מקטעי רקמה ביולוגית 15 וכמעט בזמן אמת SCMS באתרם על תאים בודדים חיים 16. לבדיקה היחידה יש מבנה משולב המורכב מנימי קוורץ כפול קדח משוך יחד עם כניסת ממס המספקת ופולט ננו-ESI העשוי מנימי סיליקה התמזגו, המאפשר לבצע אספקת ממס ומיצוי אנליטים ממכשיר יחיד. במצב MSI הסביבתי, הגשושית היחידה ממוקמת על רקמת הדגימה ומתרחשת מיקרו-מיצוי פני השטח, מה שמאפשר ליצור תמונת MS עם רסטר ברזולוציה מרחבית גבוהה. במיוחד, הקצה המחודד של הגשושית הבודדת קטן מספיק כדי להיות מוחדר לתאים אוקריוטיים חיים לניתוח SCMS באתר, כאשר זיהוי המטבוליטים לוקח פחות משתי שניות בין החדרת הגשושית לזיהוי טרשת נפוצה, מה שמאפשר לקחת מידע כימי כמעט בזמן אמת. להלן הפרוטוקולים לייצור התקן הבדיקה היחידה ולביצוע מצבי MSI ו-SCMS הסביבתיים באמצעות טכניקות MS של בדיקה יחידה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ייצור בדיקה יחידה</חזק</td></tr><tr><td>>צינורות קוורץ כפולים, 1.120' &rsquo; וזמנים; 0.005 אינץ' וזמנים; 12 אינץ'</td><td>פרידריך & דימוק, בע"מ, מילוויל, ניו ג'רזי&nbsp;</td><td>MBT-005-020-2Q</td><td></td></tr><tr><td>חולץ לייזר מיקרופיפטה&nbsp;</td><td>סאטר אינסטרומנט ושות', נובאטו, קליפורניה&nbsp;</td><td>דגם P-2000</td><td></td></tr><tr><td>נימי סיליקה התמזגו, ID: 40&nbsp; ומיקרו; מ', OD: 110&nbsp; ומיקרו; m</td><td>Molex, Lisle, IL</td><td>TSP040105</td><td></td></tr><tr><td>שרף ריפוי UV&nbsp;</td><td>Prime Dental, Prime-Dent, שיקגו, IL, ארה"ב</td><td>פריט מס' 006.030</td><td></td></tr><tr><td>מנורת LED UV</td><td>פושאן ליאנג יה ציוד שיניים, גואנגדונג, סין</td><td>LY-C240</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי</td><td>Devcon, Danvers, MA&nbsp;</td><td>חלק מס' 20945</td><td></td></tr><tr><td>מיקרופילטר מוטבע&nbsp;</td><td>IDEX בריאות & Science LLC, לייק פורסט, אילינוי</td><td>M-520</td><td></td></tr><tr><td>Microunion&nbsp;</td><td>IDEX בריאות & Science LLC, לייק פורסט, IL</td><td>M-539</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ (זכוכית)</td> <td>C & A Scientific - בכורה, Manassas, VA&nbsp;</td>מזרק <td>9105</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>המילטון, רינו, NV</td><td>1725LTN 250UL</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ספקטרומטר מסה</חזק></td></tr><tr><td>LTQ Orbitrap Mass Sprectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA&nbsp;</td><td>LTQ Orbitrap XL</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 2.1 תוכנה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, בע"מ, וולת'אם, MA&nbsp;</td><td></td><td></td>XCALIBUR21</tr><tr><td>Fance Stage Control</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, ריצ'לנד, וושינגטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSI QuickView</td><td>Pacific Northwest National Laboratory, ריצ'לנד, וושינגטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>התקן סגירת מגע</חזק></td></tr><tr><td>USB-6009 רב תכליתי DAQ</td><td>National Instruments, אוסטין, טקסס</td><td>779026-01</td><td></td></tr><tr><td>DR-5V SDS ממסר</td><td>פנסוניק, קדומה, יפן&nbsp;</td><td>DR-SDS-5</td><td></td></tr><tr><td>Logic Gates דוחף קו 50 אוהם</td><td>Texas Instruments, דאלאס, טקסס&nbsp;</td><td>SN74128N</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">הגדרת בדיקה יחידה</חזקה></td></tr><tr><td>שלב ליניארי ממונע ובקר (3 סטים)</td><td>ניופורט, אירווין, קליפורניה</td><td>Conex-MFACC</td><td></td></tr><tr><td>שלב XYZ מיניאטורי</td><td>ניופורט, אירווין, CA</td><td>MT-XYZ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>שלב XY תרגום</td><td>ThorLab, Newton, NJ</td><td>PT1 ו-PT102</td><td></td></tr><tr><td>Thermo LTQ XL אוגן ממשק מקור יונים</td><td>מטרה חדשה, Woburn, MA&nbsp;</td><td>PV5500</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו דיגיטלי, 250X - 2,000X</td><td>שנזן D& F Co., שנזן, סין</td><td>Supereyes T004</td><td></td></tr><tr><td>USB מיקרוסקופ צילום דיגיטלי&nbsp;</td><td>DX.com, הונג קונג, סין</td><td>S02 25 ~ 500X&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Chemyx Inc., סטפורד, טקסס&nbsp;</td><td>Nexus 3000</td><td></td></tr><tr><td>לוח לחם אופטי מאלומיניום מוצק, 8 אינץ' x 8 אינץ' x 1/2 אינץ'</td> <td>Thorlabs, ניוטון, ניו ג'רזי</td><td>MB810</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מהדק גמיש</td><td>Siskiyou, Grants Pass, OR&nbsp; &nbsp;</td><td>MXB-3h</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>ממסים</חזקים</td></tr><tr><td>>Methol&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, MO</td><td>34860 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, MO</td><td>34967 Chromasolv</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">תרבית תאים</strong</td></tr><tr><td>>Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS)</td><td>Gibco/Life Technologies, לונג איילנד, ניו יורק</td><td>10100-139</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"מ HEPES (pH 7.4)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט חומצה (PBS)&nbsp;</td><td>Cellgro, Manasas, VA</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA&nbsp;</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 12 בארות&nbsp;</td><td>קורנינג בע"מ, קורנינג, ניו יורק&nbsp;</td><td>בקבוק פלקון 351143</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>קורנינג בע"מ, קורנינג, ניו יורק&nbsp;</td><td>משקפי Falcon 3055</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover, עגולים, מס' 1</td><td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (דימתיל סולפוקסיד)</td> <td>VWR International, Radnor, PA&nbsp;</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>הדמיית רקמות</חזקה></td></tr><tr><td>Cyro-Cut Microtome</td><td>American Optical Coporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek, טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)&nbsp;</td><td>סאקורה פינטק בע"מ, טורנס, קליפורניה</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ (פוליקרבונט)</td><td>פתרונות אספקה מדעיים, כפר אלק גרוב, אילינוי</td><td>P11011P</td><td></td></tr></tbody></table>

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

הדמיית ספקטרומטריית מסה (MSI) וניתוח ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) בתנאי סביבה הם שני תחומים מתפתחים עם פוטנציאל גדול לניתוח ספקטרומטריית מסה מפורטת (MS) של ביומולקולות מדגימות ביולוגיות. הבדיקה היחידה, מכשיר ממוזער עם יכולות דגימה ויינון משולבות, מסוגל לבצע גם ניתוח MSI סביבתי וגם ניתוח SCMS באתר. עבור MSI סביבתי, הגשושית היחידה משתמשת במיקרו-מיצוי פני השטח כדי לבצע ניתוח MS באופן רציף של הדגימה, וטכניקה זו מאפשרת יצירת תמונות MS ברזולוציה מרחבית גבוהה (8.5 מיקרומטר) מדגימות ביולוגיות כגון קטעי מוח וכליות של עכבר. ל-Ambient MSI יש את היתרון בכך שיש צורך בהכנת דגימה מועטה או בכלל לפני הניתוח, מה שמפחית את כמות החפצים הפוטנציאליים הקיימים ברכישת נתונים ומאפשר לרכוש ניתוח מייצג יותר של המדגם. עבור SCMS באתר, ניתן להכניס את קצה הבדיקה היחידה ישירות לתאים אוקריוטיים חיים כגון תאי HeLa, בשל גודל קצה הדגימה הקטן (< 10 מיקרומטר), וטכניקה זו מסוגלת לזהות מגוון רחב של מטבוליטים בתוך תאים בודדים כמעט בזמן אמת. SCMS מאפשר לרכוש רגישות ודיוק גדולים יותר של מידע כימי ברמת התא הבודד, מה שיכול לשפר את ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים ברמה בסיסית יותר ממה שהיה אפשרי בעבר. ניתן לשלב את מכשיר הבדיקה היחידה עם מגוון ספקטרומטרים מסה עבור טווחים רחבים של מחקרי MSI ו-SCMS.

הסינגל-החללית שימש בהצלחה לניתוח MSI הסביבה של רקמת כליה עכבר מחולק 15. המכשיר משתמש במנגנון של שאיבת מייקרו נוזלי משטח (איור 1 א), המספק חילוץ אנליטי יעיל ביותר מאזור קטן, שמוביל עוצמות אותות יון בשפע בתוצאות MSI. לדוגמא, עוצמת האות של יותר מ -10 7 הושגה כמה מטבוליטים בשפע (איור 2 א). מספר רב של מטבוליטים התגלו באופן זה, כולל מספר ספינגומיילין (SM) ו phosphatidylcholine (PC) מינים כגון [SM (34: 1) + Na] + (725.5575 m / z), PC [(32: 0) + H] + (734.5700 m / z), [PC (34: 1) + Na] + (782.5696 m / z), ו [PC (38: 5 + Na)] + (814.5726 m / z). תרכובות אלה זוהו עם רזולוציה גבוהה המונית ודיוק המוני כאשר מצמידי tOA ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה. לדוגמא, זיהוי הושג עם פחות מ -4 עמודים לדקה m / דיוק המוני z (כלומר, ההבדל בין הערכים שנצפו ותיאורטי) עבור כל המטבוליט (איור 2b) בתוצאות שהוצג כאן. בנוסף, בד בבד MS מנתח (כלומר, MS / MS) נערכו גם לזיהוי בטוחים יותר מינים של עניין. 15 בשל היכולת לבצע שאיבת מייקרו נוזלית יעילה על שטח קטן, המכשיר חד הבדיקה שניתן להשתמש בם כדי לבצע ניסויי MSI ברזולוציה מרחבית גבוהים בתנאי סביבת 15. לדוגמא, תמונות MS מפורטים סעיפי כליות עכבר התקבלו הממחישות את הפריסה המרחבית של מטבוליטים נבחרים (איור 2 ג). הרזולוציה המרחבית של התמונה MS היה נחוש בדעתו להיות 8.5 מיקרומטר, בעקבות מדד בשימוש נרחב של בעל transiti. על הנקודה של תכונה חדה נקבעה בתוך שינוי עוצם 20-80% של אות MS 18 במקרה של פוספוליפידים [PC (38: 5 + Na)] + על סעיף כליות עכבר, המעבר בתכונות בין לשד הפנימי ואת לשד החיצוני מתקיים ברחבי מחזור סריקה אחד chronogram, מראה שינוי ביתר שאת מאשר 20-80 טווח%. בהתבסס על מהירות תנועה המדגם (10.0 מיקרומטר / sec) וקצב רכישת נתונים MS (0.85 שניות / ספקטרום), המדגם נע מרחק ב- MS אחד לסרוק מחזור (8.5 מיקרומטר), כלומר, את הרזולוציה המרחבית MSI, ניתן לחשב (איור 2d). רזולוציה מרחבית זהו מהגבוהים עדיין המושגים עבור טכניקות MSI סביבה שנערכו על דגימות ביולוגיות. לקבלת SCMS את החללית היחידה הצליחה להשיג את הניתוח של תאי הלה חיים פרט 16. גודל הקצה-הבדיקה האחת הוא בדרך כלל פחות מ -10 מיקרומטר (איור3a יור), שהוא קטן מספיק כדי להיות מוזן ישירות לתוך סוגים רבים של תאים איקריוטיים, מתוכם הקוטר הוא ~ 10 מיקרומטר, להפקה וניתוח MS. תהליך החדרת קצה חד החללית לתא ניתן לנטר ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו דיגיטלי (איור 3 ב), ואת החדירה קרום התא ניתן לאשר באמצעות שינוי מהיר ומשמעותי של ספקטרה המונית מן PBS (או תרבית תאים טריים בינוני) לתרכובות תאיות (3C דמויות 3D). הניסויים ניתן לבצע הן מצבי יון חיוביים ושליליים לזהות סוגים רחבים של מינים מולקולריים. לדוגמא, 18 מיני שומנים שונים זוהו במצב החיובי, כוללים ספינגומיילין (SM) ו phosphatidylcholines (PC), ואילו פוספטים אדנוזין (AMP, ADP, ו- ATP) התגלו במצב היונים השלילי (3C הדמוי ד). השהיית הזמן בין ה- i ההחדרה חד החלליתn כדי התא ואת גילוי אותות היה בדרך כלל פחות משתי שניות, המאפשר זיהוי כמעט בזמן אמת של מטבוליטים הסלולר. SCMS הוחלה גם בניסויים שבהם התאים טופלו עם תרופות אנטי-סרטניות (למשל, OSW-1, פקליטקסל, ודוקסורוביצין) 19]. התרופות המקבילות ניתן זוהו בתוך תאי הלה לאחר הטיפול של 4 שעות בכל סדרה של ריכוזים (כלומר, 10 ננומטר, 100 ננומטר, 1 מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר) ב DMSO (sulfoxide דימתיל), באמצעות בתאים שלא טופלו (להוסיף DMSO רק כמו) הבקרות. אותות MS של תרופות לא היו נוכחים בתוך PBS התאי או באמצעות השלט (איור 3E), אך אותרו בתוך התאים הבודדים באמצעות טכניקת MS חד בדיקה (רק 100 תוצאות טיפול ננומטר מוצגות 3F איור). מכיוון שתאים היו שטופים עם PBS (או תרבית תאים בינוני טרי) להסיר תרכובות וזיהומים תאיים, זיהוי של מטבוליטים אנדוגני (למשל, שומני תאפוספטים ד אדנוזין) ותרכובות אקסוגניים (למשל, תרופות נגד סרטן) עולה כי הטכניקה MS חד בדיקה שניתן להשתמש בהם כדי לנתח תרכובות תאיים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig1.jpg" /> ייצור והתקנה באיור 1. של-בדיקה אחת לניתוח MSI ו- SCMS הסביבה. א) הליכי ייצור של-בדיקה אחת. ב) תצלום של המצורפת חד החללית מפוברק לשקופית זכוכית. ג) צילום של יחיד התקנת בדיקה מצורפת מסת ספקטרומטר. ד) תרשים של ההתקנה חד בדיקה יחד עם ספקטרומטר מסה. במהלך ניסוי, ממס הדגימה מסופק ברציפות מן המזרק, מתח היינון מוחל על איחוד המוליך מן ספקטרומטר המסה, שני מיקרוסקופים דיגיטליים משמשים לניטור מיקום מדגם, הבמה XYZ מהמונעתמערכה משמשת לשליטת מדגם תנועה, ספקטרומטר מסה משמש לניתוח. ה) תצלום של מערכת סטריאוסקופ הדיגיטלית אישית. f) התצלום שבו נראה סטריאוסקופ הדיגיטלית מחוברת המקורב ממשק מקור יון דרך לוח אופטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig2.jpg" /> איור 2. תוצאות ממחקר MSI סביבה של קטע כליות עכבר עם רזולוציה מרחבית גבוהה המונית. א) ספקטרום המוני נציג מן-הבדיקה היחידה MSI. העוצמת המרבית של מטבוליטים זוהה יכול להגיע 3.39 x 10 7 (יחידות שרירותיות). ב) מבחר של מטבוליטים שזוהו מוצג עם דיוק המסה שלהם. ג)תמונות MS של [PC (32: 0) + H] + ו [PC (34: 1) + Na] + שנלקחו קטע כליות העכבר ב -8.5 מיקרומטר ברזולוציה מרחבית. PC: phosphatidylcholine. סרגל קנה מידה: 2 מ&quot;מ; 0.20 מ&quot;מ (הבלעה) ד) קביעת רזולוציה מרחבית של התמונה MS עבור. [PC (38: 5) + Na] + (מותאם באישור התייחסות 15). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53911/53911fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות מניתוח SCMS סביבה של תאים הלה מטופלים בתרופה עם רזולוציה גבוהה המונית. א) זום-אין תצלום של הקצה חד הבדיקה מראה בגודל טיפוסי של &lt;10 מיקרומטר קוטר. ב) צולמו בנקודה החדרה חד חללית לתוך תא הלה. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.ג) ספקטרום המוני במצב יון חיובי טיפוסי עם זיהוי של מספר PC (phosphatidylcholine) מינים. ד) רשימה מייצגת של מטבוליטים שזוהו מניתוח SCMS של תאי הלה הוא מצבי היון החיוביים ושליליים. EF) Mass ספקטרום עבור השליטה ומטופל (100 ננומטר OSW-1) תאים (מותאם באישור התייחסות 16). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> איור S1. מעגל דיאגרמה של המכשיר האלקטרוני המשמש לייצור אות סגירת מגע עבור ספקטרומטר מסה כדי לאסוף נתונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53911/53911figS1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לראות או להוריד את המספר הזה.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לביצוע הדמיית ספקטרומטריית מסה סביבתית (MSI) של רקמות וניתוח MS של תא יחיד (SCMS) באתרו באמצעות בדיקה יחידה, שהיא מכשיר רב תכליתי ממוזער לניתוח טרשת נפוצה.

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור התקן דגימה בקנה מיקרו, ה-Single-probe, לצורך ניתוח תאים בודדים חיים באמצעות ספקטרומטריית מסות בתנאים סביבתיים, ולביצוע דימות בספקטרומטריית מסות סביבתית של רקמות ביולוגיות ברזולוציה מרחבית גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח במחקרים ביולוגיים ופרמצבטיים.כגון אילו מולקולות נוכחות בתאים בודדים חיים, וכיצד הן מפוזרות ברקמות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהגשש הבודד הוא התקן רב-תכליתי שניתן להשתמש בו הן לניתוח תאים בודדים חיים והן לניסויי דימיג מספקטרומטריית מסות סביבתית ברזולוציה גבוהה. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו לניתוח תאים בודדים ורקמות, ניתן להחילה גם על מערכות אחרות שבהן דגימה בקנה מידה מיקרוסקופי היא רצויה, כגון ניתוח מרחבי של כימיקלים, מיקרו-מושבות וביופילמים חיים.את הפרוצדורה ידגים יחד איתי Wei Rao, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. הניחו איבר שלם של עכבר, המעניין אתכם, למרכזו של באר פלסטיק קטנה. טבלו את האיבר בתרכובת להטמעת רקמות עד לגובה של כ-10mm.העבירו מיד את הרקמות לחנקן נוזלי להקפאה מהירה (flash freezing). להכנת חיתוך של רקמת עכבר, קחו את איבר העכבר הקפוא והמיסו אותו עד לטמפרטורה של 15 degrees Celsius במיקרוטום קריוגני (cryo-microtome) בעל בקרת טמפרטורה. קבעו את הרקמה לבסיס פלדה באמצעות כ-500 microliters של תרכובת לקיבוע רקמות (tissue embedding compound), והניחו אותה על מתקן החיתוך של המיקרוטום הקריוגני כך שהכיוון הרצוי לחיתוך יהיה מופנה אל הלהב.בצעו חיתוך של הרקמה לעובי של 12 מיקרון. לאחר מכן, הניחו את פרוסות הרקמה החתוכות על שקופיות מיקרוסקופ מפוליקרבונט והשאירו אותן להתייבש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. השיגו דגימת תאים, כגון 1 מיליליטר של HeLa Cell Suspension, והוסיפו אותה ל-9mL של מצע תרבית תאים מלא בצלחת תרבית תאים סטנדרטית של 10 ס"מ.שמרו את התאים בתרבית בטמפרטורה של 37 °C, עם 5% CO2 למשך יומיים עד שלושה ימים, עד ששטח הצמיחה בצלחת תרבית התאים יהיה מכוסה ב-70-80%. בצעו מעבר תאים (passaging) בצלחת תרבית התאים. לשם כך, שאבו את מצע הצמיחה ושטפו את התאים עם 5 mL של 1x phosphate buffered saline.הסיר את ה-PBS באמצעות טיפ שאיבה סטרילי והדגר את התאים עם 2.5mL של trypsin למשך כ-5 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי לנתק את התאים מלוח התרבית. עצור את פעילות ה-trypsin על ידי הוספת 7.5mL של מצע גידול תאים מלא, ולאחר מכן, השהה את התאים באופן אחיד. כדי להכין את דגימות התאים לניסוי ספקטרומטריית מסות של תא בודד (single-cell mass spectrometry), או SCMS, הנח תחילה כיסויות מיקרוסקופיות בודדות לתוך בארות של לוח בעל 12 בארות.לאחר מכן, הוסף לבאר 1.8mL של מצע גידול לתאים ו-0.2mL של תרחיף תאים. ערבב בעדינות את התאים על ידי ניעור קל של הפלטה לפני הדגרה בסביבה של 5%CO2 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, למשך כ-24 שעות. כדי לבצע טיפול תרופתי בתאים המגודלים, הוסף תמיסת תרכובת תרופתית לפלטת גידול התאים בעלת 12 הבארים.הניחו את צינור הקוורץ בעל הלומן הכפול במכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות לייזר, ומשכו מחט קוורץ בעלת לומן כפול. כנקודות התחלה, הגדירו את החום ל-400, את הפילמנט ל-3, את המהירות ל-80, את ההשהיה ל-150, ואת המשיכה ל-250. חתכו את קצה המשיכה כך שיישאר כ-5mm של קפילרית קוורץ בעלת לומן כפול שלא נמשכה בקצה השני.חתוך מקטע של 80mm של קפילרית סיליקה מותכת (fused silica) שתשמש כקפילרית לספק הממס. לאחר מכן, הכנס את הקפילרית לאחד החורים בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים. השתמש בלהבה כדי למתוח קפילרית סיליקה מותכת כפולט nanoESI, חתוך אותה לאורך של 7-10mm והכנס אותה לחור השני בקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים.מרחו כמות מינימלית של שרף הקשחה ב-UV על הקצה השטוח של מחט הקוורץ בעלת שני החורים. הקשיחו את השרף באמצעות מנורת LED UV למשך כ-20 שניות, כדי לקבע את הנימי המספק את הממס ואת פולט ה-nanoESI. לאחר מכן, חיתכו למחצית לאורכו שקופית זכוכית סטנדרטית למיקרוסקופ.לאחר מכן, הניחו את ה-single-probe על קצה אחד של השקף, כך שהפולט של ה-nanoESI פונה החוצה. מרחו אפוקסי רגיל על גוף ה-single-probe כדי להצמידו לשקף, והשאירו למשך לילה להקשחה. מערכת זו כוללת אঢাকার ממשק מותאמים אישית של מקור יונים בספקטרומטר המסה, ולוח אופטי מאלומיניום המחובר למיקרוסקופ דיגיטלי USB, במה של תרגום XYZ ידני מיניאטורי ובמערכת תרגום XYZ ממונעת.שנו את אבחורי הממשק של מקור היונים בספקטרומטר המסה והכינו את המעמד של הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. חברו ללוח האופטי מאלומיניום את הסטריאומיקרוסקופ הדיגיטלי המשונה, מיקרוסקופ דיגיטלי USB, במה XYZ ידנית מיניאטורית עם מחזיק סריג גמיש, ואת מערכת במי XYZ הממונעת. השתמשו במחזיק הסריג הגמיש כדי לקבע את זכוכית המיקרוסקופ שעליה מחובר Probe בודד.לאחר מכן, חברו את מערך הפרובה הבודדת לספקטרומטר המסה. כוונו את מחזיק התפס הגמיש ואת במת ה-XYZ המיניאטורית כדי למקם את הפולט של הפרובה הבודדת מול פתח הכניסה של ספקטרומטר המסה. הפשיתו את נתח הדגימה בטמפרטורה של החדר, והניחו אותו על מערכת במת ההזזה הממוטרת XYZ שמתחת לפרובה הבודדת.כוון את מיקום הדגימה על ידי שינוי הקואורדינטות בתוכנת הבקרה. השתמש במזרק כדי להזרים את ממס הדגימה בקצב המתאים. לאחר מכן, גרם למתח היינוז.כווננו את גובה הגשש הבודד כך שיישען מעט מעל פני הדגימה, באופן שיאפשר ביצוע חילוץ שCח של מטבוליטים. הרימו בזהירות את במת ה-Z, ולאחר מכן השתמשו במיקרוסקופ הדיגיטלי המחובר ב-USB כדי לנטר את שינוי המרחק בין קצה הגשש הבודד לפני השטח של הרקמה. הגדירו את הפרמטרים לסריקה רסטריית (rastering) על פני החלק הרלוונטי בדגימה.עבור חתיכות הכליות של העכבר המוצגות כאן, השתמשו במהירות סריקה של 10 micrometer per second ובמרחק של 20 micrometer בין הקווים. הגדירו את פרמטרי הסריקה על פני החלק הרלוונטי בדגימה. עבור חתיכות הכליות של העכבר המוצגות כאן, השתמשו במהירות סריקה של 10.0 micrometer per second ובמרחק של 20 micrometer בין הקווים.הגדירו שיטה לרכישה אוטומטית של ספקטראלים של MS ממספקטרומטר המסות. עבור MSI ברזולוציית מסה גבוהה על דגימה של כליה של עכבר, השתמשו ברזולוציית מסה של 60,000, במצב חיובי של 5kV, ב-1 microscan, בזמן הזרקה מקסימלי של 150 milliseconds, ובבקרת הגבר אוטומטית (AGC) פעילה. התחילו ברכישת נתוני ה-MSI, ולאחר מכן הפיקו תמונות MS מקבצי MS גולמיים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.הקימו את מערכת הפרובה הבודדת (single-probe system) לפי ההוראות עבור MSI וכווננו את קצב זרימת הממס. שטפו את התאים המטופחים המודבקים לשקופיות הזכוכית מסוג microcover glass באמצעות PBS כדי להסיר את מצע התרבית ומרכיבי תרופה חוץ-תאיים. לאחר מכן, הניחו את שקופית הזכוכית המכילה את התאים על מערכת במה עם תנועה מוטורית בצירי XYZ לצורך הניסוי.מקדו את הסטריאומקרוסקופ הדיגיטלי שמעל הדגימה, על קצה הגשש הבודד (single-probe), כדי לעקוב אחר חדירת התא במהלך האנליזה. השתמשו במיקרוסקופ הדיגיטלי בחיבור USB הממוקם בצד הגשש הבודד כדי לעקוב אחר תנאי העבודה של פולט ה-nanoESI שעל הגשש. השתמשו בתוכנת הבקרה של במת ה-XYZ הממונעת ובסטריאומקרוסקופ הדיגיטלי כדי לאתר תא רלוונטי ולממקם במדויק את קצה הגשש הבודד מעל הדגימה.התחילו את רכישת נתוני ה-MS לפני השחלת קצה הפרובה הבודדת אל התא. הורידו את הפלטה המכילה את התא כדי למשוך את קצה הפרובה הבודדת החוצה מהתא. לבסוף, אפשרו לממס לזרום במשך כשלושה דקות, כדי לשטוף לחלוטין את הפרובה הבודדת.בוצע דימות ספקטרומטריה של מסות בסביבה נקייה (ambient mass spectrometry imaging) של חתכי כליה של עכבר, וניתן היה לזהות מספר רב של מולקולות הנוכחות על פני השטח של הרקמה. מופו ההתפלגות המרחבית והשפעיות היחסיות של מולקולות מרובות על פני השטח של הרקמה. רזולוציה מרחבית של 8.5 microns הושגה באמצעות תצפיות במעברים חדים של מאפיינים הנוכחים בנתוני הספקטרומטריה של המסות.ייצור הגשש הבודד בעל קצה חד ותעלות פתוחות הוא קריטי לאנליזה של תא בודד. מיקרוסקופים נחוצים כדי לאתר את תאי המטרה ולנטר את תהליך החדירה לתא. שינוי האות מספקטרה של מסות מספק מידע נוסף לאישור החדירה לתא.מספר רב של מולקולות זוהו מתאים בודדים חיים. כאשר נעשה שימוש בניסויים אלו למחקר תרופות נגד סרטן, משתמשים בניסויי תאי בקרה כדי להראות את ההבדל הנובע מהטיפול בתרופה נגד הסרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מיוצרת הפרובה הבודדת (single-probe), וכיצד מכשיר זה משמש לאנליזה של תא בודד באמצעות ספקטרומטריית מסות, ולדימיון מסות סביבתי (ambient mass spectrometry imaging) של רקמות ביולוגיות.באופן כללי, אנשים המתנסים בשיטה זו בפעם הראשונה עשויים להתקשות, כיוון שנדרשות הוראות מפורטות כדי לייצר את התקן בעל הגשש הבודד, להקים את המערכת כולה ולהפעיל את המכשירים. לאחר השליטה בשיטה, ניתן לבצע ניתוח של תאים בודדים באופן רצף עבור תאים רבים. כל ניתוח נמשך פחות משלוש דקות.סיום ניסוי של דימוי MS בסביבה רגילה עשוי להימשך מספר שעות, בהתאם לגודל הדגימה, הרזולוציה המרחבית והספקטרומטר למסות שבו נעשה שימוש. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי ייצור של גשש בודד באיכות גבוהה הוא השלב המכריע. בנוסף, כיוון ותפעול המכשיר הם קריטיים להצלחת הניסוי.ניתן לפתח שיטות אחרות בהתאם לנהלים דומים לאלו המוצגים כאן. לדוגמה, ניתן להוסיף ריאגנטים לממס הדגימה ולבצע אנליזה ריאקטיבית של תא בודד ו-MSI בתנאי סביבה כדי לשפר את הגילוי של מולקולות מהדגימות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים הן בניתוח תאים בודדים והן במחקרי דימיון בספקטרומטריית מסות בתנאי סביבה.ניתן להשתמש בטכניקה זו פוטנציאלית למחקרי ביולוגיה של התא, לימודי פרמקולוגיה ולבדיקות קליניות. יש לזכור כי עבודה עם קפילרות קוורץ חדות ואפוקסי המתקשח תחת UV עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון חבישת כפפות והרכבת משקפי מגן ל-UV בעת ביצוע הליך זה.

applications-single-probe-mass-spectrometry-imaging-single-cell

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוח תא יחיד מבוצע על ידי ספקטרומטריית מסה בתאי צמחים ובעלי חיים בלחץ אטמוספרי באמצעות סיב אופטי מחודד המדגם תאים יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ספקטרומטריית מסה.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

ניתן לגדל שורות תאי סרטן הונצחו כתרביות תאי 3D, מודל רב-ערך למחקר ביולוגי. פרוטוקול זה מתאר הדמיה ספקטרומטר מסה של תרביות תאי 3D, כולל שיפורים בפלטפורמת הכנת מדגם. המטרה של פרוטוקול זה היא להנחות את המשתמשים כדי להכין תרביות תאי 3D לניתוח הדמיה ספקטרומטר מסה.

לדוגמא הכנת אסטרטגיות להדמית ספקטרומטריית המסה של מודלי תרבית תאי 3D

אנו מתארים צעדים המאפשרים דיגום מהיר בתוך באתרו של חלק קטן של תא יחיד עם דיוק גבוהה, הפלישה מינימלי באמצעות נימי מיקרו-דגימה, כדי להקל על אפיון כימי של תמונת מצב של פעילות מטבולית חיים העוברים באמצעות אלקטרופורזה נימי תא בודד לפי הזמנה ספקטרומטר מסה פלטפורמה.

Microprobe נימי אלקטרופורזה ספקטרומטריית עבור מטבולומיקס תא בודד ב- Live צפרדע (צפרדע רפואית זריזה) העוברים

שיטה של הכנת הדוגמא פותחה כדי להתאים coculture תאים ורקמות לזהות מולקולה קטנה exchange באמצעות ספקטרומטר מסה הדמיה.

לכידת תקשורת מולקולה קטנה בין רקמות ותאים באמצעות הדמיה ספקטרומטר מסה

פלטפורמת מניפולציה משולבת תא מפותחת לשימוש בשילוב עם התקנה בודדת המסה בדיקה מאסיבית עבור ניתוח מקוון של תאים ההשעיה בודדים תחת תנאי הסביבה.

משולב תאים מניפולציה פלטפורמה ביחד עם יחיד-בדיקה עבור ניתוח ספקטרומטר המסה של תרופות מטבוליטים בתאים ההשעיה יחיד

מאמר זה מציג שיטות הכנה לדוגמה עבור שיטה אנליטית ייחודית בזמן אמת המבוססת על ספקטרומטר מסה סביבתי. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח בזמן אמת של המולקולות הביולוגית בvivo ללא כל טיפול מיוחד.

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

בפרוטוקול זה אנו מתארים כיצד להכין תאי יונקים לניתוח פרוטאומיקה חד-תאית באמצעות ספקטרומטריית מסה באמצעות ריאגנטים וציוד זמינים מסחרית, עם אפשרויות לפיפטציה ידנית ואוטומטית כאחד.

הכנה לפרוטאומיקה חד-תאית לניתוח ספקטרומטריית מסה באמצעות ליזיס הקפאת חום ונשא איזוברי

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוMS לספקטרומטריית מסה MALDI-2 חד-תאית מונחית פלואורסצנטית, המאפשרת פרופיל מולקולרי משופר של תאי עצב ראשוניים של חולדות.

ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריצה פלואורסצנטית עם ספקטרומטריית מסה פוסטיוניזציה המושרה בלייזר של תאים עצביים בודדים של חולדה

פרוטוקול זה נועד לשמר מטבוליטים של תאים עבור ספקטרומטריית מסה של תא בודד (SCMS) על ידי שילוב של שטיפת תמיסת מלח נדיפה, מרווה חנקן נוזלי מהיר, ייבוש בהקפאה ואחסון של -8 מעלות צלזיוס. הוא מדגים כי כיבוי חנקן נוזלי חיוני לשמירה על פרופילי מטבוליטים, בעוד שיש למזער אחסון קר ממושך כדי למנוע שינויים מטבוליים.

הכנת מדגם למחקרי מטבולומיקה של ספקטרומטריית מסה של תא בודד: שטיפת תאים משולבת, מרווה, ייבוש ואחסון

פרוטוקול זה מתאר הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית של תאי OVCAR-8 באמצעות יינון אלקטרוספריי דספורפציה המחובר לספקטרומטרי מסה Orbitrap לניתוח מטבולומי ברזולוציה מרחבית גבוהה.

הדמיית ספקטרומטריית מסה חד-תאית באמצעות יינון אלקטרוספריי בדסורפציה המשולבת לספקטרומטרי מסה של Orbitrap

למד כיצד לבצע הדמיית ספקטרומטריית מסה בתנאי הסביבה וניתוח תא יחיד חי באמצעות מכשיר Single-probe. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של דגימות ביולוגיות וחקר התפלגות מולקולות ברקמות.

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

גלה סרטונים נוספים