Name: מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: למד מדידה ישירה של רמות סידן ברטיקולום sarcoplasmic בתאי שריר חלק כלי דם באמצעות אינדיקטור FRET ומיקרוסקופיית confocal. שיטה זו מאפשרת ניטור תנודות סידן בתגובה לסוכנים מובילי סידן ומסייעת להבנת מחזוריות סידן תוך-תאית וקשרה ללחץ ER.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מן המכון הקנדי לבריאות מחקר [MOP-1112666 כדי CVB &amp; ME].

<ol><li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li>
<li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li>
<li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flickers+steer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+Alzheimer%27s+disease%3A+in+a+state+of+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li>
<li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trip+to+the+ER%3A+coping+with+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li>
<li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells%3A+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2%2B+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333(2013).</li>
<li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li>
<li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear%2C+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li>
<li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר את transfection של VSMCs עם אדנו D1SR ללמוד Ca 2 + ריכוזים בתוך לומן של SR. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של Ca 2 + בתוך אברון זה, כמו גם את התנועה לתוך / מתוך SR כתוצאה היישום של סוכנים שונים נע בסידן. לשיטה זו יתרונות רבים עבור חוקרים עובדים לקראת הבנה מקיפה של כמה שינויים ברמות SR ו cytoplasmic Ca 2+ להשפיע על בריאות הסלולר הכוללת וכיצד שינויים אלה הנם ייחודיים לכל שאר. תצפית מסורתית תנועה תאית Ca 2 + כרוך המעקב של שינוי...

Ca 2 + הוא יון חשוב מאוד למצוא למכביר בתוך כל תא ותא בגוף. יש לו תפקידים משמעותיים רבים תפקודים תאיים שונים, לרבות גידול, התפשטות, הגירה, ו אפופטוזיס 1-4. היא מבוססת היטב כי Ca 2 + יכול להשפיע על תהליכים אלה הם באמצעות פעולות ישירות ועקיפות, ולכן, שינויים לריכוז הנורמלי התאי של יון זה יכול לגרום בקלות תוצאות שליליות עבור תאים חולים. ערך SR נחשב החנות הגדולה התאי Ca 2 + בתוך התא 5. רמות מצב יציב של Ca 2+ הן SR ו הציטופלסמה נשמרות בדרך כלל באמצעות זרימה מתמדת לתוך ומתוך ערוצי -transporting Ca 2+ של אברון זה. התנאים המלחיצים המוטלים תאים בשל כל צורה של פציעה או מחלה הם נפוצים הקשורים שינויים משמעותיים SR Ca 2 + כי להמשיך להיות השפעות ארוכות טווח על שהואalth של התא. בשנת הקשה ביותר של המקרים, את חוסר היכולת של תא הדגיש להתאושש ולשמור Ca SR מצב יציב 2+ רמות אולי אפילו לשיאה למוות על ידי אפופטוזיס 6-8. מחקר נוכחי לתוך דינמיקת הסלולר Ca 2+ מוגבל על ידי העובדה כי בדיקת מחקרים מעטים אברון תוכן החנות 2 + Ca ישירות 9-11. המנהג הנפוץ ביותר במקום כרוך מדידת רמות ציטופלסמית Ca 2 + מדידות עקיפות של שינויים בתוכן SR Ca 2 + 12-14. בניסויים אלה, Ca 2 + מושרת נפוצה להשתחרר מן SR באמצעות סוכנים תרופתיים גורמים הדלדול של אברון (למשל thapsigargin). מסקנות אז נמשכו לגבי שינויי SR Ca 2 + ומתבססים על תנודות הריכוזים ציטופלסמית Ca 2+. למרות היכולת הנותרים לחוקרים להסיק מסקנות כאלה בתוך ma עקיפהnner, שיטה זו של מדידת 2+ SR Ca היא ללא ספק דרך עקיפה כדי ללקט מידע כזה, עם מגבלות רבות בנוגע לפרשנות של הנתונים שנאספו. כדי לעקוף מגבלה ברורה זו, יש צורך למדוד את כמות Ca 2 + מצאה ישירות בתוך הרשת לומינל SR. ויטל לתוצאה הסופית של יכולת להקליט רמות Ca 2+ SR intraluminal ישירות הם כלי תרבית תאים ומחוון Ca 2+ בשימוש. עבור הנתונים הפניה בכתב היד הנוכחית, חשוב לציין כי VSMCs בשימוש בא משושלת תא קפוא. תאים היו בתרבית הבינונית של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) + 10% בת-יומה בסרום (NCS) מעל הקטעים 22-26 עבור הניסויים שתוארו, וטופח על 37 מעלות צלזיוס קבוע עם 5% CO 2 אספקה. באמצעות השיטה הנוכחית, למשל, תאים כבר גדלו מאוד בהצלחה על תערובת חלבון המדמה את תאייםהסביבה של סוגים שונים של רקמות 15. חשוב להצלחה לאורך הוריד של SR Ca 2 + מחקר הוא סוג של תערובת חלבונים המשמשים; במקרה זה, מגוון גורם צמיחה נמוך היה נחוץ כדי למנוע מרכיבי הכלי הזה מאת משפיע על האיתות הרגילה Ca 2+ ותנועות המתרחשות כל זמן בתוך התאים הנבדקים. בעקבות גידול מוצלח של תאי בדיקה, מחוון Ca 2+ חייב גם להיות הציג ביעילות תאים בתרבית אלה. זה הפך להיות אפשרי באמצעות וקטור adenoviral שנושא את SR-המתגורר Ca 2 + אינדיקטור D1SR. כדי להשיג יעילות transfection גבוהה, התאים חייבים להיות מודגרות עם וקטורים ויראליים לפחות 36-48 שעות לפני הדמיה. הכנה זו מספקת כלי אמין למדידת Ca 2 + ארעיים בתוך לומן SR עם דיוק שחזור גבוה. מחוון D1SR להשתמש בפרוטוקול זה היא גרסה שונה של D1ER Ca 2 + indicator כי נוצרה במקור על ידי המעבדה של ד&quot;ר רוג&#39;ר צ&#39;יין באוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו, 9,16 ארה&quot;ב. D1ER המקורי שייך לדור שני של אינדיקטורים מקודדים גנטי Ca 2+ שנקראו cameleons המציגים רגישויות 2+ Ca פני טווח רחב הרבה יותר (0.5-160 מיקרומטר) לעומת מדדים קודמים Ca 2 + 9,16. D1SR גרסה חדשה, מתנה סוג מד&quot;ר וויין חן (מאוניברסיטת אלברטה, קנדה), לעומת זאת, נושא רצף calsequestrin מוטציה (במקום רצף calreticulin כמו D1ER המקורי). Calsequestrin מוטציה יש מופחת מחייב Ca 2 + הפותר את הבעיה של מתחרים עם calsequestrin אנדוגני מחייב Ca 2 + בתוך SR לומן 11. מחוון D1SR נושאת חלבון פלואורסצנטי ציאן משופרת קטום (CFP) ו חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כי לאגד על ידי חלבון מקשר המכיל calmodulin שונה (CAM) ו M13 (tהוא 26-שאריות פפטיד של קינאז אור-שרשרת שרירן הנקשרת רצפים CAM). רצף CAM-M13 שונה כדי למנוע M13 מלהיקשר calmodulin אנדוגני. כמו כן, על מנת להבטיח שימור SR, רצף calsequestrin נוסף על קצה 5&#39;של CFP 11. כאשר חייב Ca 2 +, תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים כי לגרום לעלייה בהעברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, הנרשם כעלייה את עוצמת אות הסריג. מצד השני, כאשר הריכוז של SR לומינל Ca 2 + טיפות, תחום CAM-M13 עובר שינויים מרחביים הפוכים, וכתוצאה מכך ירידת העברת האנרגיה בין CFP האיגוף ו YFP, וירידה משמעותית בעוצמת אות סריג .

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (גלוקוז גבוה, פירובאט)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>11995-065</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor מופחת, 5 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>356230</td><td>שמור בטמפרטורה של -20 ומעלות; C עד ממש לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום עגלים לתינוקות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>יש לשמור על -20 מעלות; C עד ממש לפני השימוש</td></tr><tr><td>צלחות עם תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל 0.2 &mu; בקבוק מכסה אטם תקע כחול מאוורר M</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>25200056</td><td>לשמור על -20 מעלות; C עד ממש לפני השימוש</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A מתנה</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>פלורוניק F-127</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-23917</td><td>שמור בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד ממש לפני השימוש</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה שחורים</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite 2.6.3 (עם יישום FRET SE Wizard)</td> <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה confocal

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

שמירה על רמות סידן במצב יציב (Ca2+) ברטיקולום הסרקופלזמי (SR) של תאי שריר חלק בכלי הדם (VSMCs) חיונית לבריאותם הכללית. חלק ניכר מתכולת Ca2+ התוך-תאית נמצא במאגרי ה-SR ב-VSMCs. בתור האברון התוך-תאי היחיד עם קשר הדוק לחלל החוץ-תאי שמסביב דרך צמתים של קרום פלזמה-SR, ה-SR יכול להיחשב כקו התגובה הראשון לכל אי סדירות במעבר Ca2+, או מתח שחווה התא. בין תפקידיו הרבים, אחד החשובים ביותר הוא תפקידו בהעברת אותות מווסתים Ca2+ ברחבי התא כדי לגרום לתגובות נוספות ברחבי התא במורד הזרם. השימוש הנפוץ יותר באינדיקטורים ציטופלזמיים Ca2+ בהקשר זה אינו מספיק בסך הכל למחקר על השינויים הדינמיים ביותר במאגר SR Ca2+ התוך-לומינלי שטרם אופיינו במלואם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט למדידה ישירה וברורה של SR Ca2+ לומינלי. כלי זה שימושי לחקירת השינויים הניואנסים ב-SR Ca2+ שיש להם השפעות משמעותיות לאחר מכן על התפקוד התקין והבריאות של התא. תנודות בתכולת SR Ca2+ באופן ספציפי יכולות לספק לנו כמות משמעותית של מידע הנוגע לתגובות תאיות למחלות או למצבי לחץ שחווה התא. בשיטה זו, נעשה שימוש בגרסה שונה של מחוון Ca2+ ממוקד SR, D1SR, לאיתור תנודות Ca2+ בתגובה להכנסת חומרים לתאי שריר חלק אבי העורקים של חולדות מתורבתות. לאחר הדגירה עם מחוון D1SR, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית והדמיה מבוססת העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) משמשות לצפייה ישירה בשינויים ברמות SR Ca2+ תוך-לומינליות בתנאי בקרה ובתוספת חומרים אגוניסטים המתפקדים כדי לגרום לתנועה תוך-תאית Ca2+.

סעיף זה מספק דוגמאות של התוצאות ניתן להשיג באמצעות השיטה המתוארת ללכוד SR לומינל Ca 2+ נתוני ריכוז, בהשוואה לאופן מועסק בדרך של בעקיפין מדידת שינויי אברון ריכוזי החנות 2 + Ca ידי התבוננות תנודות ציטופלסמית Ca 2+ . איור 1 א מציג תמונת מצב של אזור של עניין (ROI) של התרבות SMC טרנספקציה עם אדנו D1SR בע...

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

המטרה הכללית של טכניקת הדמיה זו היא לנטר תנודות ברמות הסידן בתוך הלומן של ה-SR בתגובה לחומרים המגייסים סידן, ובמידה ממוקדת בתאי שריר חלק כלי דם. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת מחזורי הסידן התאיים באופן ישיר יותר. לדוגמה, חשוב מאוד להכיר את הקשר בין הובלת הסידן ברשת הסרקופלסמית לבין עקה של הרשת האנדופלסמית (ER stress).היתרון של טכניקה זו הוא שניתן למדוד באופן ישיר את הסידן בתוך הלומן של הרשת הסרקופלזמית, במקום להסיקו ממדידות עקיפות של שינויים בציטופלזמה. גבריאלה זיומק, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדה שלי, תדגים טכניקה זו. כדי להתחיל בהליך, הכינו דילול של 1:25 של תערובת חלבונים ב-DMEM.בשלב הבא, העבירו 200 µL של תערובת חלבון ב-DMEM לכל פלטה עם תחתית זכוכית בנפח 35 mm כדי לכסות במלואם את מעגל הזכוכית הפנימי בתחתית. השאירו את הפלטות בטמפרטורת החדר בתוך קבמינ הבטיחות למשך 30 דקות לפחות. בינתיים, חממו DMEM עם 10% NCS ל-37 °C באמבט מים.לאחר מכן, הסר את ה-DMEM מבקבוק התרבית באמצעות פיפטת זכוכית. לאחר מכן, שטוף את תחתית הבקבוק עם PBS סטרילי וחם כדי להסיר את שאריות ה-DMEM. כדי לשחרר את תאי השריר החלק המגודלים מתחתית הבקבוק, שטוף את הבקבוק במהירות עם מיליליטר אחד של trypsin והסר אותו.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר נוסף של trypsin. נערו את הבקבוק במשך כ-30 עד 60 שניות כדי להבטיח שהאנזים יבוא במגע עם כל תחתית הבקבוק לפני הוצאתו. לאחר שהתאים השתחררו באמצעות ה-trypsin, הוסיפו לבקבוק DMEM רענן עם 10% NCS כדי לעצור את תגובת ה-trypsin.העבירו את תמיסת התאים שהתקבלה מהבקרה למבחנה קונית נקייה ומסומנת בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי בתוספת 10% NCS לכל צלחת המוכנה. לאחר מכן, הפכו בעדינות את המבחנה המכילה את תמיסת התאים מספר פעמים כדי לפרק כל משקע שייתכן ונוצר.העבירו בפיפטה את הנפח הרצוי של תמיסת התאים, לאחר ערבוב עדין, לכל צלחית. לאחר מכן, סובבו כל צלחית היטב עם כיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להבטיח פיזור שווה של התאים על הזכוכית שבתחתית. יש להוסיף מספיק תאים לצלחית כדי להבטיח שיגיעו לרמת התמזגות (confluency) גבוהה מספיק במהלך 48 השעות הבאות לצורך דימות יעיל.לאחר הוספת המצע והתמיסת התאים לכל פלטה, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לתאים להיקשר כראוי לתחתית הזכוכית. בדקו את הפלטות תחת מיקרוסקופ במרווחי זמן של 15 דקות עד שהתאים נקשרים בבירור. לאחר מכן, הוציאו את ה-aliquot של Adenavirus D1 SR מאחסון במינוס 80 °C והעבירו אותו לקבינה לבטיחות ביולוגית בתוך אמבט קרח נייד. לאחר מכן.העבירו בפיפטה את המינון הרצוי של D one SR מקורר לכל צלחת והדגירו את התאים המודבקים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. למחרת, רעננו את התאים באמצעות הוספת one milliliter של DMEM טרי בתוספת ten percent NCS. לאחר מכן, הדגירו את הצלחות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם five percent carbon dioxide למשך הלילה.לאחר דגירה של לילה, הסר את מצע התרבית מהצלחת. שטוף את צלחת התרבית עם 1 mL של בופר HEPES-PSS פיזיולוגי חם שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף 1 mL של בופר HEPES-PSS חם וטרי מיד לפני ההקלטה.בצעו הדמיה ראשונית באמצעות יישום ה-FRET SE על ידי פתיחת התוכנה הנלווית למיקרוסקופ הקונפוקאלי. לאחר פתיחת היישום, לחצו על לשונית ההגדרות (setup) כדי להתאים את הגדרות הניסוי הרצויות. שנו ידנית את הגדרות הערוצים כך שהתאים יעוררו ברצף ב-440 nanometers עבור התורם וה-FRET, וב-513 nanometers עבור המקבל.לאחר מכן, הגדירו את אורכי גל הפליטה ל-488 nanometers עבור התורם ו-535 nanometers עבור FRET והמקבל. בהמשך, הגדירו את עוצמת האור ל-15 אחוזי תמסורת, עם זמן חשיפה לעירור של 150 milliseconds לתאים ומרווחים של 10 seconds בין החשיפות. לאחר מכן, ייצבו את הפלטה על במה המיקרוסקופ.השתמשו בכפתור live כדי לבדוק את רזולוציית התמונה. התאימו את ההגדרות באופן נוסף כדי להשיג את הרזולוציה הרצויה. תחת לשונית setup, צלמו את הדגימה באמצעות כפתור capture image.כעת, לאחר מעבר ללשונית ההערכה (evaluation), בחרו את השיטה המתאימה לחישוב יעילות ה-FRET עבור הניסויים המבוצעים. שיטה שלוש, המשתמשת בחישוב יחס (ratiometric calculation), מומלצת לניסויים הכוללים Cameleons, כגון האינדיקטור D1 SR. לאחר מכן, עברו ללשונית הגרף (graph) כדי לצפות בערכי העוצמה המוקלטים בגרף.במידת הצורך, סמנו ROI בצופה התמונות כדי לצפות בעוצמה הממוצעת של אזור עניין זה על הגרף. התחילו בהקלטה כדי לאסוף נתונים למשך שלוש דקות לפחות, כדי להבטיח אות בסיס יציב לפני הכנסת הגורם הנבדק. לאחר מכן, הכניסו גורם המניע סידן, ככלי לריקון סידן מה-SR, על ידי הוספתו ישירות לתוך הפלטה בקרבת אזור העניין המוקלט.המשיכו בהקלטה למשך הזמן הרצוי לאחר הטיפול. לאחר מכן, צלמו סדרת תמונות FRET רציומטריות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך תוך שימוש באפליקציית FRET SE. בשלב זה, כדי להכין את פלטות התרבית של תאי שריר חלק של אבי העורקים של חולדה, שטפו את פלטת התרבית עם מיליליטר אחד של בופר HEPES-PSS פיזיולוגי חם שלוש פעמים.לאחר מכן, ערבבו את האינדיקטור עם מיליליטר אחד של HEPES-PSS חם והעמיסו אותו על פלטות התרבית. דגרו את תאי השריר החלק עם האינדיקטור למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הסירו את האינדיקטור מפלטת התרבית ושטפו אותה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של תמיסת HEPES-PSS פיזיולוגית חמה.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של באפר HEPES-PSS חם וטרי מיד לפני ההקלטה. צלמו סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. לאחר מכן, הכניסו את חומר התניידות הסידסיום (calcium moving agent) ככלי לריקון סידסיום מה-SR והמשיכו בהקלטה למשך פרק הזמן הרצוי לאחר הטיפול.כאן מוצגים צילומי נקודות זמן מייצגים של תא שריר חלק שעבר טרנספקציה עם מד D one SR, תוך שימוש במסנני Band pass עבור CFP, FRET ו-YFP. איור זה מציג צילומי נקודות זמן בפסאודו-צבע בזמן אמת של תאי שריר חלקים מזוקקים של אבי העורקים של חולדה שעברו טרנספקציה עם D one SR. טיפול בריכוז של 2 µM של Thapsigargin הוביל לירידה בעוצמת האות, המעידה על ירידה משמעותית בתוכן הסידן ב-SR עקב שחרור סידן המושרה על ידי Thapsigargin. גרף זה מציג את עקבה המייצגת עבור יחס D one SR מנורמל בתאי שריר חלקים מזוקקים שטופלו ב-2 µM Thapsigargin, דבר שאישר ירידה משמעותית בסידן ב-SR.להלן תצריפי תמונה מייצגים של תאי שריר חלק של אבי העורקים של חולדה שהוצאו מתרבית, נטענו בחומר מדעי לסימון סידן ציטופלזמי ועובדו עם 2 µM Thapsigargin. כפי שניתן לראות, Thapsigargin גורם לעלייה משמעותית בעוצמת האות בתוך הציטופלזמה כתוצאה משחרור סידן מה-SR. וגרף זה מציג עקומה מייצגת של יחס Fluo four AM מנורמל בתאי שריר חלק מתרבית שעובדו עם 2 µM Thapsigargin. העלייה המוצגת באות הסידן נחשבת כפרופורציונלית לכמות הסידן ששוחררה מה-SR. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-48 שעות מההתחלה ועד לסיום, במידה והיא מבוצעת כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על התאים בתנאים המתוארים כדי להבטיח את תקינותם לפני התעתוק (transfection) של אינדיקטור הסידן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה כיצד להכין תאים בתרבית כדי לאפשר מדידה של רמות הסידן בלומן של ה-SR באמצעות אינדיקטור D one SR.

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אותות סידן משחקת תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הישרדות ביטוי גנים בידול. כאן אנו מדגימים כיצד לבצע הדמיה סידן באמצעות Fura, 02:00. הדמיה סידן הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ויסות סידן תוך תאי בזמן אמת ורגולציה של מפלי איתות.

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה...

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

אנו מציגים שיטה לבודד מהירה (מיקרו) האירועים סידן והנתיבים איטי יותר בתאים חיים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית confocal. שיטה מודד תנודות בעוצמת הקרינה של אינדיקטורים סידן על ידי קו סריקות הקלטה מאות פיקסלים מספר בתא. ניתוח היסטוגרמה מאפשר לנו לבודד את הכף זמן של והנתיבים סידן שונים.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

סידן תאיים מיחזור שמשחק תפקיד בוויסות של תפקוד סיסטולי, דיאסטולי אצל cardiomyocytes. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להעריך sarcoplasmic רשת Ca2 + שמורת ובפונקציה הסרת סידן הדיאסטולי ב cardiomyocytes מאת סידן מערכת הדמיה.

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

הפרוטוקול מתאר את השיטה של העמסת צבע סידן פלואורסצנטי דרך העצב החתוך לתוך מסופי העצבים המוטוריים של העכבר. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לרישום ארעי סידן מהירים בקצות העצבים ההיקפיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

רישום של סידן חולף בצומת נוירומוסקולרי עכבר עם רזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הכנה ושימוש בפרוסות ריאה חתוכות באופן מדויק על ידי עכברים כדי להעריך את התכווצות השריר החלק של דרכי הנשימה והעורקים התוך-פולמונריים בסביבה כמעט in vivo .

שימוש בפרוסת הריאה החתוכה באופן מדויק כדי לחקור את ויסות ההתכווצות של שריר חלק עורקי דרכי הנשימה והפנים-פולמונרי

למד מדידה ישירה של רמות סידן ברטיקולום sarcoplasmic בתאי שריר חלק כלי דם באמצעות אינדיקטור FRET ומיקרוסקופיית confocal. שיטה זו מאפשרת ניטור תנודות סידן בתגובה לסוכנים מובילי סידן ומסייעת להבנת מחזוריות סידן תוך-תאית וקשרה ללחץ ER.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

גלה סרטונים נוספים