מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

המטרה הכללית של טכניקת הדמיה זו היא לנטר תנודות ברמות הסידן בתוך הלומן של ה-SR בתגובה לחומרים המגייסים סידן, ובמידה ממוקדת בתאי שריר חלק כלי דם. שיטה זו עשויה לסייע בהבנת מחזורי הסידן התאיים באופן ישיר יותר. לדוגמה, חשוב מאוד להכיר את הקשר בין הובלת הסידן ברשת הסרקופלסמית לבין עקה של הרשת האנדופלסמית (ER stress).

היתרון של טכניקה זו הוא שניתן למדוד באופן ישיר את הסידן בתוך הלומן של הרשת הסרקופלזמית, במקום להסיקו ממדידות עקיפות של שינויים בציטופלזמה. גבריאלה זיומק, סטודנטית לתואר מתקדם במעבדה שלי, תדגים טכניקה זו. כדי להתחיל בהליך, הכינו דילול של 1:25 של תערובת חלבונים ב-DMEM.

בשלב הבא, העבירו 200 µL של תערובת חלבון ב-DMEM לכל פלטה עם תחתית זכוכית בנפח 35 mm כדי לכסות במלואם את מעגל הזכוכית הפנימי בתחתית. השאירו את הפלטות בטמפרטורת החדר בתוך קבמינ הבטיחות למשך 30 דקות לפחות. בינתיים, חממו DMEM עם 10% NCS ל-37 °C באמבט מים.

לאחר מכן, הסר את ה-DMEM מבקבוק התרבית באמצעות פיפטת זכוכית. לאחר מכן, שטוף את תחתית הבקבוק עם PBS סטרילי וחם כדי להסיר את שאריות ה-DMEM. כדי לשחרר את תאי השריר החלק המגודלים מתחתית הבקבוק, שטוף את הבקבוק במהירות עם מיליליטר אחד של trypsin והסר אותו.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר נוסף של trypsin. נערו את הבקבוק במשך כ-30 עד 60 שניות כדי להבטיח שהאנזים יבוא במגע עם כל תחתית הבקבוק לפני הוצאתו. לאחר שהתאים השתחררו באמצעות ה-trypsin, הוסיפו לבקבוק DMEM רענן עם 10% NCS כדי לעצור את תגובת ה-trypsin.

העבירו את תמיסת התאים שהתקבלה מהבקרה למבחנה קונית נקייה ומסומנת בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של DMEM טרי בתוספת 10% NCS לכל צלחת המוכנה. לאחר מכן, הפכו בעדינות את המבחנה המכילה את תמיסת התאים מספר פעמים כדי לפרק כל משקע שייתכן ונוצר.

העבירו בפיפטה את הנפח הרצוי של תמיסת התאים, לאחר ערבוב עדין, לכל צלחית. לאחר מכן, סובבו כל צלחית היטב עם כיוון השעון או נגד כיוון השעון כדי להבטיח פיזור שווה של התאים על הזכוכית שבתחתית. יש להוסיף מספיק תאים לצלחית כדי להבטיח שיגיעו לרמת התמזגות (confluency) גבוהה מספיק במהלך 48 השעות הבאות לצורך דימות יעיל.

לאחר הוספת המצע והתמיסת התאים לכל פלטה, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לתאים להיקשר כראוי לתחתית הזכוכית. בדקו את הפלטות תחת מיקרוסקופ במרווחי זמן של 15 דקות עד שהתאים נקשרים בבירור. לאחר מכן, הוציאו את ה-aliquot של Adenavirus D1 SR מאחסון במינוס 80 °C והעבירו אותו לקבינה לבטיחות ביולוגית בתוך אמבט קרח נייד. לאחר מכן.

העבירו בפיפטה את המינון הרצוי של D one SR מקורר לכל צלחת והדגירו את התאים המודבקים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. למחרת, רעננו את התאים באמצעות הוספת one milliliter של DMEM טרי בתוספת ten percent NCS. לאחר מכן, הדגירו את הצלחות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם five percent carbon dioxide למשך הלילה.

לאחר דגירה של לילה, הסר את מצע התרבית מהצלחת. שטוף את צלחת התרבית עם 1 mL של בופר HEPES-PSS פיזיולוגי חם שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף 1 mL של בופר HEPES-PSS חם וטרי מיד לפני ההקלטה.

בצעו הדמיה ראשונית באמצעות יישום ה-FRET SE על ידי פתיחת התוכנה הנלווית למיקרוסקופ הקונפוקאלי. לאחר פתיחת היישום, לחצו על לשונית ההגדרות (setup) כדי להתאים את הגדרות הניסוי הרצויות. שנו ידנית את הגדרות הערוצים כך שהתאים יעוררו ברצף ב-440 nanometers עבור התורם וה-FRET, וב-513 nanometers עבור המקבל.

לאחר מכן, הגדירו את אורכי גל הפליטה ל-488 nanometers עבור התורם ו-535 nanometers עבור FRET והמקבל. בהמשך, הגדירו את עוצמת האור ל-15 אחוזי תמסורת, עם זמן חשיפה לעירור של 150 milliseconds לתאים ומרווחים של 10 seconds בין החשיפות. לאחר מכן, ייצבו את הפלטה על במה המיקרוסקופ.

השתמשו בכפתור live כדי לבדוק את רזולוציית התמונה. התאימו את ההגדרות באופן נוסף כדי להשיג את הרזולוציה הרצויה. תחת לשונית setup, צלמו את הדגימה באמצעות כפתור capture image.

כעת, לאחר מעבר ללשונית ההערכה (evaluation), בחרו את השיטה המתאימה לחישוב יעילות ה-FRET עבור הניסויים המבוצעים. שיטה שלוש, המשתמשת בחישוב יחס (ratiometric calculation), מומלצת לניסויים הכוללים Cameleons, כגון האינדיקטור D1 SR. לאחר מכן, עברו ללשונית הגרף (graph) כדי לצפות בערכי העוצמה המוקלטים בגרף.

במידת הצורך, סמנו ROI בצופה התמונות כדי לצפות בעוצמה הממוצעת של אזור עניין זה על הגרף. התחילו בהקלטה כדי לאסוף נתונים למשך שלוש דקות לפחות, כדי להבטיח אות בסיס יציב לפני הכנסת הגורם הנבדק. לאחר מכן, הכניסו גורם המניע סידן, ככלי לריקון סידן מה-SR, על ידי הוספתו ישירות לתוך הפלטה בקרבת אזור העניין המוקלט.

המשיכו בהקלטה למשך הזמן הרצוי לאחר הטיפול. לאחר מכן, צלמו סדרת תמונות FRET רציומטריות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך תוך שימוש באפליקציית FRET SE. בשלב זה, כדי להכין את פלטות התרבית של תאי שריר חלק של אבי העורקים של חולדה, שטפו את פלטת התרבית עם מיליליטר אחד של בופר HEPES-PSS פיזיולוגי חם שלוש פעמים.

לאחר מכן, ערבבו את האינדיקטור עם מיליליטר אחד של HEPES-PSS חם והעמיסו אותו על פלטות התרבית. דגרו את תאי השריר החלק עם האינדיקטור למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, הסירו את האינדיקטור מפלטת התרבית ושטפו אותה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של תמיסת HEPES-PSS פיזיולוגית חמה.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של באפר HEPES-PSS חם וטרי מיד לפני ההקלטה. צלמו סדרת תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. לאחר מכן, הכניסו את חומר התניידות הסידסיום (calcium moving agent) ככלי לריקון סידסיום מה-SR והמשיכו בהקלטה למשך פרק הזמן הרצוי לאחר הטיפול.

כאן מוצגים צילומי נקודות זמן מייצגים של תא שריר חלק שעבר טרנספקציה עם מד D one SR, תוך שימוש במסנני Band pass עבור CFP, FRET ו-YFP. איור זה מציג צילומי נקודות זמן בפסאודו-צבע בזמן אמת של תאי שריר חלקים מזוקקים של אבי העורקים של חולדה שעברו טרנספקציה עם D one SR. טיפול בריכוז של 2 µM של Thapsigargin הוביל לירידה בעוצמת האות, המעידה על ירידה משמעותית בתוכן הסידן ב-SR עקב שחרור סידן המושרה על ידי Thapsigargin. גרף זה מציג את עקבה המייצגת עבור יחס D one SR מנורמל בתאי שריר חלקים מזוקקים שטופלו ב-2 µM Thapsigargin, דבר שאישר ירידה משמעותית בסידן ב-SR.

להלן תצריפי תמונה מייצגים של תאי שריר חלק של אבי העורקים של חולדה שהוצאו מתרבית, נטענו בחומר מדעי לסימון סידן ציטופלזמי ועובדו עם 2 µM Thapsigargin. כפי שניתן לראות, Thapsigargin גורם לעלייה משמעותית בעוצמת האות בתוך הציטופלזמה כתוצאה משחרור סידן מה-SR. וגרף זה מציג עקומה מייצגת של יחס Fluo four AM מנורמל בתאי שריר חלק מתרבית שעובדו עם 2 µM Thapsigargin. העלייה המוצגת באות הסידן נחשבת כפרופורציונלית לכמות הסידן ששוחררה מה-SR. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כ-48 שעות מההתחלה ועד לסיום, במידה והיא מבוצעת כראוי.

במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על התאים בתנאים המתוארים כדי להבטיח את תקינותם לפני התעתוק (transfection) של אינדיקטור הסידן. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה ברורה כיצד להכין תאים בתרבית כדי לאפשר מדידה של רמות הסידן בלומן של ה-SR באמצעות אינדיקטור D one SR.