Name: זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: חקור את שותפי החלבון MyoD בביולוגיית שרירים באמצעות טיהור זיקה כפול וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת זיהוי שותפים בנוכחות נמוכה בתת-מחלקות גרעיניות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת Ait-Si-Ali נתמכה על ידי האגודה הצרפתית למיופתיות Téléthon (AFM-Téléthon); המכון הלאומי לסרטן (INCa); הסוכנות הלאומית למחקר (ANR), האגודה למחקר בסרטן (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; אוניברסיטת פריז דידרו ו"מי אני?" מעבדת המצוינות #ANR-11- LABX-0071 ממומנת על ידי ממשלת צרפת באמצעות תוכנית "השקעות לעתיד" המופעלת על ידי ANR תחת מענק #ANR-11-IDEX-0005-01. EB נתמך על ידי מענק INCa.

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת מאפשרת זיהוי ממצה של שותפים של גורם שעתוק, Myod. הוא גילה שותפי Myod במערכת Heterologous עמידה בידול נגרם Myod, כלומר תאי הלה-S3. לפיכך, על פי הגדרתו, שותפי Myod מזוהים באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף. אלה כוללים גורמי שעתוק בכלל רצף ספציפי, אנזימי שינוי-הכרומטין, חלבוני עיבוד RNA, קינאזות (לוחות 1 ו -2). מאחר ותאי הלה-S3 עמידים בידול-trans-induced Myod, פעילות Myod היא בעיקר דכאניים השותפים המזוהים צפויים להיות-repressors שיתוף Myod. ה...

אורגניזמים רבים תאי איקריוטיים מורכבים של איברים ורקמות שונים. לכל רקמה תפקודית ביטוי דפוס גן ספציפי, אשר נקבע בכל שלב התמיינות. התמיינות תאים כרוכה הפעלה של גנים ספציפיים, תחזוקת הביטוי שלהם, בדרך כלל, השתקה של סט של גנים כאלה המעורבים התפשטות תאים. בידול שרירי השלד, או myogenesis, הוא אפוא תהליך רב שלבי, המתחיל קביעת תאי גזע mesodermal לתוך myoblasts, ולאחר מכן מוביל בידול הטרמינל של myoblasts אלה לתוך מונו בעלי הגרעין הראשון, ולאחר מכן רב-גרעיני, myotubes . לפיכך, myoblasts הוא &quot;נקבע&quot; תאים, כי הם עדיין מסוגלים להתרבות, אבל הם מחויבים שושלת שרירי השלד, ובכך יכולים להבחין אך ורק לתאי שריר שלד גם במהלך התפתחות עוברית או התחדשות שריר מבוגרת. תהליך מסוף שרירי שלד שונהentiation הוא מתוזמר על ידי תוכנה גנטית מיוחדת שמתחילה ביציאת צמיתת מחזור התא של תאי מבשר myoblast שמוביל השתקה מוחלטת של גנים הקשורים התפשטות, כגון גני מטרת E2F 1. ואכן, במהלך התהליך של בידול הטרמינל, מעצר התפשטות myoblast הוא צעד חיוני שמקדים את הביטוי של גנים ספציפיים שריר שלד ואת ההיתוך של myoblasts לתוך myotubes 2. תכנית כזו מאפשרת תאי גזע שריר בוגרים, המכונים גם תאי לווין, להבדיל במהלך תהליך ההתחדשות בעקבות פציעה בשרירי שלד. Myogenesis יונקים תלויה באופן מכריע משפחה של לולאה בצורת סליל סליל בסיסית myogenic (bHLH) שעתוק גורמי Myod, Myf5, MRF4 ו Myogenin, מכונה לעתים קרובות כמו המשפחה של גורמים נחישות שרירי השלד או MRFs (גורמי תקינה שרירים) 3. כל אחד מהם ממלא תפקיד חיוני במפרט ו DIFferentiation של תאי שריר שלד ושיש לו דפוס ביטוי ספציפי 4 5-7. הפעלת Myf5 ו Myod מהווה את הצעד הקובע כי מתחייב לתאי שושלת myogenic, והביטוי הבא של Myogenin מפעיל myogenesis עם הפעלה של גנים ספציפיים שריר שלד, כגון MCK (שרירים קריאטין קינאז). גורמי שעתוק bHLH myogenic פעולה עם בני משפחת MEF2 בהפעלת גנים שריר מ לוקוסים שותק בעבר 8. הם גם מגרים שעתוק הגנים שרירי השלד כמו heterodimers עם חלבונים bHLH בכל מקום, E12 ו E47, המכונה חלבונים E, המחייבים כביכול E-תיבות 8 גנים רגולטוריים שונים אזורים. טוויסט, זיהוי (מעכב של בידול) וגורמים נוספים שלילי לווסת את התהליך הזה, על ידי מתחרה עם Myod עבור חלבוני E מחייבים 8. Myod נחשב לשחקן המרכזי מפעילת בידול מסוף שרירים 9 </sעד&gt; מאז יש לו את היכולת להשפיע על קביעת myogenic / בידול (טרנס-דיפרנציאציה) תכנית ברבים באופן מלא מערכות בדיל הלא שריר 10-13. אכן, ביטוי כפוי של Myod ומשרה את בידול טרנס מסוגים סלולריים שונים גם אלה נגזרו אחר ממוצא embryologic 12. לדוגמה, Myod יכול להמיר hepatocytes, פיברובלסטים, מלנוציטים, neuroblasts, ו adipocytes לתאים דמויי שריר. הפעולה חוצה בהתפלגותו של Myod כרוכה הפעלה תקינה של התכנית הגנטית myogenic (גני המטרה שלה בעיקר) בסביבה לא-שרירי, במקביל כדי השתקת התכנית הגנטית המקורית (בעיקר, גני התפשטות). בשנת מתרבים myoblasts, Myod מתבטאת אך אינו מסוגל להפעיל גנים היעד שלה גם כאשר הוא נקשר היזמים שלהם 14-16. לכן, הדרישה Myod להתבטא ברציפות myoblasts מובחן נשאר elu למדיsive. Myod יכול להדחיק גני ליעדו בשל הגיוס של אנזימי שינוי-הכרומטין דיכוי ב מתרבה myoblasts לפני הטעינה של הפעלת שיפוץ הכרומטין אנזימי 14,17. לדוגמה, ב מתרבים myoblasts, Myod קשורה תעתיק שיתוף מדכא KAP-1, deacetylases היסטון (HDACs) ו methyltransferases ליזין הדיכוי (KMTs), כולל היסטון H3 ליזין 9 או H3K9 ו H3K27 KMTs, פעיל לדכא ביטוי גנים היעד שלה על ידי הקמת 14,17 מבנה הכרומטין מקומית דיכוי. חשוב לציין כי הדו&quot;ח האחרון עולה כי Myod הוא עצמו מפוגל ישירות על ידי H3K9 KMT G9a וכתוצאה מכך עיכוב של transactivating שלה פעילות 16. המנגנונים אפיגנטיים המעורבים טרנס-הבחנה זו של תאים שאינם שריר ידי Myod הם ידועים ברובם. יש לציין, שורות תאים בעלי עמידות בידול טרנס-induced Myod. לכן, תאי הלה, Myod הוא גם פעיל אואפילו יכול לתפקד כמו מדכא ולא activator של שעתוק בשל חוסר ביטוי של למקטע BAF60C של הכרומטין שיפוץ המורכב SWI / SNF 18. מודל זה ולכן יכול להיות בחירה לאפיין את המנגנונים טובים יותר של דיכוי גני מושרה Myod. זה מתאים גם כדי assay את היכולת של Myod לגרום סביבת הכרומטין דיכוי בבית לוקוסי היעד שלה עם השותפים הקשורים אליו ולכן לחשוף את מנגנוני הדיכוי תלוי Myod ב מתרבה myoblasts מכוונן בידול סופנית. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי שותפי Myod באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון. השימוש בתאי הלה-S3 להביע ביציבות הדגל-HA-Myod רשאי לקבל מספיק חומר כדי לטהר את מתחמי Myod מתמציות גרעיניות מופרדות. זיהוי שותפי Myod במערכת Heterologous לווה validatiעל במערכת רלוונטית.

<table><tbody><tr><td><חזק>קווי תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספינר</td><td></td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר:&nbsp; הומוגנייזר Dounce&nbsp;</td><td>Wheaton</td><td>432-1273 ו- 432-1271</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר תסיסה לספינרים</td><td>Bellco</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>UCD 200</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Marienfeld Superior&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קשירה נמוכה</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>עמוד ספין ריק</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-פוליאקרילאמיד 4-12%&nbsp; ג'ל</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>מאגר טעינה פי 4&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10x חומר הפחתה</td><td>Life technologies</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת כסף</td> Life <td>technologies</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>יחידות סינון צנטריפוגליות, 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G חרוזי אגרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A/G&nbsp; שרף</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>שרף דגל (ג'ל זיקה נגד דגל M2-agarose)</td><td>שרף Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA (אגרוז מונוקלונלי נגד HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד ללא דגל (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td><td>השעיה של עד 4 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris-HCl, pH 7.8</td></tr><tr><td>פפטיד נטול HA (YPYDVPDYA)</td> <td>שירות Ansynth BV</td><td>סינתזה מותאמת אישית</td><td>השעיה של עד 4 מ"ג/מ"ל ב-50 מ"מ Tris-HCl, ערכת בדיקת</td></tr><tr><td>חלבון מבוססת חומצה ביסינצ'ונינית</td> pH 7.8: ערכת BCA <td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>מעכבי פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>כימילומינסנציה משופרת מבוססת לומינול (ECL) HRP מצע טכנולוגיות</td><td>חיים</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>DNA זרע סלמון גזוז (חומצה דאוקסיריבונוקלאית מלח נתרן מאשכי סלמון)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>ספרמין טטרהידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS פועל מאגר</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (גלוקוז גבוה)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>טרום חם&nbsp; ב-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05% פנול אדום</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>GE healthcare מדעי החיים&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>כל מנה של סרום צריכה להיבדק תחילה עבור התאים שלך.</td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן, 0.4%</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>מים (מסוננים סטריליים)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים>נוגדנים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA מחולדה (12CA5)</td><td>דגל 11583816001</td><td></td><td></td>רוש</tr><tr><td></td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>לשימוש עבור כתמים מערביים</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>לשימוש עבור משקעים חיסוניים וכתם מערבי</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>טובולין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>אקטין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG עכבר</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG ארנב</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד חולדות -HRP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב -HRP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר -HRP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של myod interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

בידול מסוף שרירי שלד מתחיל עם המחויבות של תאי מבשר mesodermal פלוריפוטנטיים כדי myoblasts. תאים אלה עדיין את היכולת להתרבות או שהם יכולים להבדיל הפתיל לתוך myotubes multinucleated, אשר לְהַבשִׁיל נוספת ליצירת myofibers. בידול מסוף שריר השלד בניצוחו של פעולה מתואמת של גורמי שעתוק שונים, בפרט חברי גורמים רגולטוריים שרירים או MRFs (Myod, Myogenin, Myf5, ו MRF4), המכונה גם משפחת גורמי שעתוק bHLH myogenic. גורמים אלה לשתף פעולה עם מתחמי שיפוץ-הכרומטין בתוך רשת רגולצית תעתיק משוכללת להשיג myogenesis שלד. לפי גישה זו, Myod נחשבת גורם שעתוק מאסטר myogenic המעוררים בידול מסוף שריר. רעיון זה מתחזק לנוכח היכולת של Myod להמיר תאים שאינם שרירים לתאי שריר שלד. כאן אנו מתארים גישה המשמשת לזיהוי Myodשותפי חלבון באופן ממצה על מנת להבהיר את הגורמים השונים המעורבים בידול מסוף שרירי שלד. המטרה לטווח הארוכה היא להבין את המנגנונים אפיגנטיים מעורבים בויסות גני שרירי שלד, כלומר., מטרות Myod. שותפי Myod מזוהים באמצעות טיהור טנדם זיקה (תג TAP) ממערכת Heterologous מצמידה ספקטרומטריית מסה (MS) אפיון, ואחריו אימות של תפקיד שותפים רלוונטיים במהלך בידול מסוף שרירי שלד. צורות Aberrant גורם myogenic, או התקנה הסוטה שלהם, קשורות עם מספר הפרעות שריר: מיאסטניה מולד, ניוון myotonic, ראדומיוסרקומה וליקויי התחדשות שריר. ככזה, גורמי myogenic לספק מאגר של מטרות טיפוליות פוטנציאליות בהפרעות שריר, הוא לעניין המכאניזם שיוצר מחלה עוצמה, מנגנון שיקום שיכול לשפר את הטיפול במחלה. לפיכך, להבין.&quot; המפורטדינג של האינטראקציות מולקולאריים ואת התוכניות הגנטיות בשליטת גורמי myogenic חיוני תכנון רציונל של טיפולים יעילים.

כדי להבין את הסדרת פעילות Myod, ניטלנו האפיון הממצה של מתחמי Myod באמצעות טיהור ביוכימיים, מבוסס על immunopurification של צורה מתויגת כפולה של Myod ואחריו ספקטרומטריית מסה (MS). השימוש קו תא הלה-S3 להביע Myod דגל-HA-tagged וקו תאים בלתי מבוקרת להביע היתרי דגל-HA להשיג מספיק חומר כדי לטהר את מורכבות Myod ידי ביצוע טיהור פעמיים זיקה של דגל-HA-Myod. א...

MyoD הוא גורם שעתוק מיוגני בעל יכולת חזקה לגרום לטרנסדיפרנציאציה מיוגנית של קווי תאים רבים שאינם שריר מובחנים לחלוטין. המנגנונים האפיגנטיים המעורבים בטרנסדיפרנציאציה זו אינם ידועים ברובם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור זיקה כפולה ואחריה ספקטרומטריית מסה כדי לאפיין באופן ממצה שותפי MyoD.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין באופן ממצה שותפים לחלבון MyoD. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של שרירי השלד כגון ויסות מולקולרי של עיוות טונאלי של שרירי השלד על ידי גורם שעתוק השרירים המרכזי, MyoD. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחשוף שותפי MyoD שיש להם שפע נמוך מבחינה אלקטיבית, אחד הממוקם בתא תת-גרעיני ספציפי אחד.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות התמיינות השרירים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון כל רקמה אחרת, במיוחד התמיינות גרעינית. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר לוריאן פריטש, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. בפרוטוקול זה, קומפלקסים של MyoD יטוהרו מתאי HeLa S3 המבטאים ביציבות MyoD עם תגי גלוטן FLAG.תאי HeLa S3 שהומרו עם הווקטור הריק ישמשו כבקרה. שני קווי התאים גודלו, נאספו ואוחסנו בעבר בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. במהירות, הפשירו את כדורי התא באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.יש לקרר מראש את כל המאגרים וההומוגנייזרים ולבצע את כל ההליך הזה בחדר קר. בדרך כלל, 20 גרם תאים משמשים לכל נקודת ניסוי, אך למטרות הדגמה זו יעובדו רק 10 גרם, או כ -10 מ"ל תאים. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מאגר היפוטוני A, על ידי שימוש ב-5 מ"ל של המאגר בהתחלה.לאחר מכן, הוסיף 2.5 מ"ל, ואחריו עוד 2.5 מ"ל. שטפו היטב את הפיפטה עם חיץ טרי כדי לקבל את מקסימום התאים. העבירו 20 מ"ל מתלה התאים להומוגניזטור המקורר מראש בעזרת עלי הדוק.הומוגניזציה של התאים ב -20 פעימות. העבירו את מתלה התאים לצינור של 50 מיליליטר. להתאוששות מקסימלית של תאים, יש לשטוף את ההומוגנייזר עם 3.5 מ"ל של מאגר סוכרוז.העבירו תרחיף זה במהירות לצינור של 50 מ"ל כדי לשמר את הגרעינים ולהגביל את הדליפה. מכתים 30 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 30 מיקרוליטר של 4% טריפן כחול ומנתחים תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע את יעילות הליזיס. כל הגרעינים צריכים להיות כחולים אם הליזיס מצליח.במידת הצורך, חזור על ההומוגניזציה. צנטריפוגה למשך שבע דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הגרעינים. שמור את הסופרנטנט כשבר ציטופלזמי.התחל בהליך הכנת החלק הניתן למיצוי מלח גרעיני על ידי השעיית גלולת הגרעינים ב-4 מ"ל של מאגר סוכרוז. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של מאגר מלח גבוה טיפה אחר טיפה תוך ערבוב יסודי על מערבולת כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מ נתרן כלורי. דוגרים במשך 30 דקות על קרח עם ערבוב כל חמש דקות.לאחר מכן, הפחיתו את ריכוז הנתרן הכלורי ל-150 מ"מ על ידי הוספת 8 מ"ל של מאגר סוכרוז. צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 13, 000 x גרם וארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט שהוא החלק הניתן למיצוי המלח והשאירו אותו על הקרח.כדי להכין את השבר הקשור לכרומטין יש להשעות את הגלולה בקפידה ב-3.5 מ"ל של מאגר סוכרוז. מוסיפים סידן כלורי לריכוז סופי של 1 מ"מ ומערבבים. הסידן הכלורי יפעיל את המיקרוקוק נוקלאז שיתווסף מאוחר יותר.מחממים את ההשעיה למשך דקה אחת בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף 35 מיקרוליטר של 5 יחידות למלאי מיקרוקוק נוקלאז כדי לקבל ריכוז סופי של 25 10 אלפיות יחידה למיקרוליטר. דוגרים בדיוק 12 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.מערבבים כל ארבע דקות. לאחר 12 דקות, הניחו מיד את התגובה על קרח. כדי לעצור את פעילות המיקרוקוק נוקלאז, הוסף 56 מיקרוליטר של 5 מולארי EDTA pH 8.0 לריכוז סופי של 4 מ"מ ומערבולת.דגירה במשך חמש דקות על קרח. סוניקציה חמש פעמים למשך דקה אחת בכל פעם במשרעת גבוהה המאפשרת הפסקה של דקה אחת בין סוניקציות. שנה צנטריפוגה הן את השברים הניתנים למיצוי המלח והן את השברים המועשרים בנוקלאוזום למשך 30 דקות ב-85,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס.אספו את הסופרנטנטים. השבר הניתן למיצוי מלח צריך להיות כ -13 מ"ל. והשבר המועשר בנוקלאזום צריך להיות בערך 6 מ"ל.קומפלקסים של חלבון MyoD יטוהרו על ידי טיהור זיקה כפולה. מכיוון שהנהלים לטיהור מבוסס FLAG ומבוסס HA דומים, רק הטיהור מבוסס FLAG יודגם. לאחר הוספת TEGN העבירו את הנפח המתאים של שרף FLAG לצינור של 50 מ"ל.יש צורך ב-300 מיקרוליטר של שרף FLAG משרף FLAG מסחרי של 50% שטיפה מוקדמת עבור כל נקודת ניסוי. צנטריפוגה למשך שתי דקות ב -1, 000 x גרם. הסר את הסופרנטנט, הוסף TEGN קר ושוב צנטריפוגה.שוטפים את שרף ה-FLAG עם TEGN קר בסך הכל חמש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את שרף ה- FLAG בנפח שווה של TEGN. עבור כל נקודת ניסוי, מערבבים 300 מיקרוליטר של שרף FLAG שטוף ותמצית החלבון המתאימה.השתמש בצינור של 15 מ"ל עבור השבר המועשר בנוקלאזום ובצינור של 50 מ"ל עבור החלק הניתן למיצוי מלח. דגרו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה את כל הצינורות למשך שתי דקות בטמפרטורה של 1,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס.יש לאסוף את הסופרנטנטים ולשמור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לקבלת תוצאת בדיקת יעילות הטיהור. עבור הדגימות הניתנות למיצוי מלח, השעו מחדש את שרף ה-FLAG ב-4 מ"ל של TEGN והעבירו לצינור של 15 מ"ל. חזור על שלב זה שלוש פעמים, בכל פעם העביר לאותם 15 מ"ל כדי למנוע אובדן חרוזים.צנטריפוגה למשך שתי דקות בחום של 1, 000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף 13 מ"ל של TEGN לשרף ה-FLAG ולצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים את השרף שבע פעמים בצורה זו.לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את השרף ב -1 מ"ל של TEGN והעבירו לצינור כריכה נמוך של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה למשך שתי דקות והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את השרף עבור כל נקודת ניסוי ב-100 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד FLAG ב-4 מ"ג/מ"ל ב-pH 7.8 ערבבו היטב והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר TEGN.דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לחסל חלבונים קשורים. צנטריפוגה למשך שתי דקות ומעבירים את השרף והסופרנטנט לעמוד ספין ריק המונח בצינור של 2 מ"ל. צנטריפוגה את העמוד למשך דקה אחת ב 6, 000 x גרם.אוספים את שאריות הסופרנטנט בצינור של 2 מ"ל. לאחר מכן נבדקת יעילות הטיהור כמתואר בטקסט הפרוטוקול, לפני שממשיכים בטיהור מבוסס HA. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של קומפלקסים מטוהרים של MyoD עם זיקה כפולה משברים הניתנים למיצוי מלח גרעיני או מועשרים בנוקלאזום של קו תאי HeLa S3 המבטאים ביציבות את FLAG HA MyoD.צביעת כסף זיהתה את FLAG HA MyoD המסומן על ידי החץ שנעדר מקו התא המדומה. קומפלקסי ה-MyoD המטוהרים בזיקה כפולה חולקו על שיפועי גליצרול. כתמים מערביים של השברים באמצעות נוגדנים נגד FLAG חשפו את תת-הקומפלקסים של MyoD בשני התאים התת-גרעיניים.בפרט, MyoD הניתן למיצוי מלח מופץ בשלושה תת-קומפלקסים ואילו MyoD הקשור לכרומטין שייך בעיקר לקומפלקס אחד. ניתוח ספקטרומטריית מסה של אינטראקטורים MyoD שבודדו משברים הניתנים למיצוי מלח גרעיני ומועשרים בנוקלאוזום זיהו סדרה של שותפים ידועים ושותפים חדשים של MyoD. כאן האינטראקטורים של MyoD שנמצאים בשני השברים או, במיוחד עבור אחד השברים, מקובצים על סמך ההערות הפונקציונליות שלהם.חלק מספקטרומטריית המסה שגילתה אינטראקטורים אושרו על ידי כתם מערבי על קומפלקסים של MyoD. אלה כוללים את גורמי השעתוק CBF, תת-היחידה SWI/SNF BAF47 וחלבוני HP1. מכיוון שתאי HeLa אינם תאי שריר ואינם מבטאים בדרך כלל MyoD, יש צורך לאשר אינטראקציות בין אינטראקטורים שזוהו לאחרונה לבין MyoD ומיובלסטים.תמציות גרעיניות מריבוי והתמיינות של מיובלסטים של עכברים שימשו למשקעים חיסוניים ולניתוח מערבי עם הנוגדנים שצוינו. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחדד את התוצאות המתקבלות במיובלסטים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפלה של השותף המסוים במערכת רלוונטיות כמו מיובלסטים, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו משמעות פונקציונלית של האינטראקציה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה הביולוגית ההתפתחותית לחקור את רשת הוויסות של חמישה גורמי שעתוק ברוב מערכות הגוף. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות את השותפים של גורם השעתוק על ידי ביצוע פיצול תאים ואחריו טיהור זיקה טנדם יחד עם ספקטרומטריית מסה.

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

זרימת עבודה זו מתארת את ביצועי הזמן והעשרת העלויות היעילות של שינויים מרובים בחלבון שלאחר ההעברה (לפטין) בו זמנית עבור ניתוח פרוטמית גלובלי כמותי. הפרוטוקול מנצל את העשרה ברמת הפפטיד PTM עם נוגדנים מרובה מצוחים, ואחריו נתונים עצמאיים רכישה המסה ניתוח ספקטרומטר מאסה כדי לקבל תובנות ביולוגיות לתוך הוצלב PTM.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

אנו מציגים את פרוטוקול התיוג הממוטב המותאם לשני הכוללים מידע מפורט עבור כל אחד מהצעדים הבאים: חילוץ חלבונים, כימות, משקעים, עיכול, תיוג, הגשה למתקן הפרוטאוניקס וניתוחי מידע.

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

חקור את שותפי החלבון MyoD בביולוגיית שרירים באמצעות טיהור זיקה כפול וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת זיהוי שותפים בנוכחות נמוכה בתת-מחלקות גרעיניות שונות.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים