זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין באופן ממצה שותפים לחלבון MyoD. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של שרירי השלד כגון ויסות מולקולרי של עיוות טונאלי של שרירי השלד על ידי גורם שעתוק השרירים המרכזי, MyoD. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחשוף שותפי MyoD שיש להם שפע נמוך מבחינה אלקטיבית, אחד הממוקם בתא תת-גרעיני ספציפי אחד.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות התמיינות השרירים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון כל רקמה אחרת, במיוחד התמיינות גרעינית. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר לוריאן פריטש, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. בפרוטוקול זה, קומפלקסים של MyoD יטוהרו מתאי HeLa S3 המבטאים ביציבות MyoD עם תגי גלוטן FLAG.

תאי HeLa S3 שהומרו עם הווקטור הריק ישמשו כבקרה. שני קווי התאים גודלו, נאספו ואוחסנו בעבר בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, כמתואר בטקסט הפרוטוקול. במהירות, הפשירו את כדורי התא באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

יש לקרר מראש את כל המאגרים וההומוגנייזרים ולבצע את כל ההליך הזה בחדר קר. בדרך כלל, 20 גרם תאים משמשים לכל נקודת ניסוי, אך למטרות הדגמה זו יעובדו רק 10 גרם, או כ -10 מ"ל תאים. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מאגר היפוטוני A, על ידי שימוש ב-5 מ"ל של המאגר בהתחלה.

לאחר מכן, הוסיף 2.5 מ"ל, ואחריו עוד 2.5 מ"ל. שטפו היטב את הפיפטה עם חיץ טרי כדי לקבל את מקסימום התאים. העבירו 20 מ"ל מתלה התאים להומוגניזטור המקורר מראש בעזרת עלי הדוק.

הומוגניזציה של התאים ב -20 פעימות. העבירו את מתלה התאים לצינור של 50 מיליליטר. להתאוששות מקסימלית של תאים, יש לשטוף את ההומוגנייזר עם 3.5 מ"ל של מאגר סוכרוז.

העבירו תרחיף זה במהירות לצינור של 50 מ"ל כדי לשמר את הגרעינים ולהגביל את הדליפה. מכתים 30 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 30 מיקרוליטר של 4% טריפן כחול ומנתחים תחת המיקרוסקופ כדי לקבוע את יעילות הליזיס. כל הגרעינים צריכים להיות כחולים אם הליזיס מצליח.

במידת הצורך, חזור על ההומוגניזציה. צנטריפוגה למשך שבע דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את הגרעינים. שמור את הסופרנטנט כשבר ציטופלזמי.

התחל בהליך הכנת החלק הניתן למיצוי מלח גרעיני על ידי השעיית גלולת הגרעינים ב-4 מ"ל של מאגר סוכרוז. לאחר מכן, הוסף 4 מ"ל של מאגר מלח גבוה טיפה אחר טיפה תוך ערבוב יסודי על מערבולת כדי לקבל ריכוז סופי של 300 מ"מ נתרן כלורי. דוגרים במשך 30 דקות על קרח עם ערבוב כל חמש דקות.

לאחר מכן, הפחיתו את ריכוז הנתרן הכלורי ל-150 מ"מ על ידי הוספת 8 מ"ל של מאגר סוכרוז. צנטריפוגה למשך 10 דקות בחום של 13, 000 x גרם וארבע מעלות צלזיוס. אספו את הסופרנטנט שהוא החלק הניתן למיצוי המלח והשאירו אותו על הקרח.

כדי להכין את השבר הקשור לכרומטין יש להשעות את הגלולה בקפידה ב-3.5 מ"ל של מאגר סוכרוז. מוסיפים סידן כלורי לריכוז סופי של 1 מ"מ ומערבבים. הסידן הכלורי יפעיל את המיקרוקוק נוקלאז שיתווסף מאוחר יותר.

מחממים את ההשעיה למשך דקה אחת בחום של 37 מעלות צלזיוס. הוסף 35 מיקרוליטר של 5 יחידות למלאי מיקרוקוק נוקלאז כדי לקבל ריכוז סופי של 25 10 אלפיות יחידה למיקרוליטר. דוגרים בדיוק 12 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

מערבבים כל ארבע דקות. לאחר 12 דקות, הניחו מיד את התגובה על קרח. כדי לעצור את פעילות המיקרוקוק נוקלאז, הוסף 56 מיקרוליטר של 5 מולארי EDTA pH 8.0 לריכוז סופי של 4 מ"מ ומערבולת.

דגירה במשך חמש דקות על קרח. סוניקציה חמש פעמים למשך דקה אחת בכל פעם במשרעת גבוהה המאפשרת הפסקה של דקה אחת בין סוניקציות. שנה צנטריפוגה הן את השברים הניתנים למיצוי המלח והן את השברים המועשרים בנוקלאוזום למשך 30 דקות ב-85,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס.

אספו את הסופרנטנטים. השבר הניתן למיצוי מלח צריך להיות כ -13 מ"ל. והשבר המועשר בנוקלאזום צריך להיות בערך 6 מ"ל.

קומפלקסים של חלבון MyoD יטוהרו על ידי טיהור זיקה כפולה. מכיוון שהנהלים לטיהור מבוסס FLAG ומבוסס HA דומים, רק הטיהור מבוסס FLAG יודגם. לאחר הוספת TEGN העבירו את הנפח המתאים של שרף FLAG לצינור של 50 מ"ל.

יש צורך ב-300 מיקרוליטר של שרף FLAG משרף FLAG מסחרי של 50% שטיפה מוקדמת עבור כל נקודת ניסוי. צנטריפוגה למשך שתי דקות ב -1, 000 x גרם. הסר את הסופרנטנט, הוסף TEGN קר ושוב צנטריפוגה.

שוטפים את שרף ה-FLAG עם TEGN קר בסך הכל חמש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את שרף ה- FLAG בנפח שווה של TEGN. עבור כל נקודת ניסוי, מערבבים 300 מיקרוליטר של שרף FLAG שטוף ותמצית החלבון המתאימה.

השתמש בצינור של 15 מ"ל עבור השבר המועשר בנוקלאזום ובצינור של 50 מ"ל עבור החלק הניתן למיצוי מלח. דגרו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה את כל הצינורות למשך שתי דקות בטמפרטורה של 1,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס.

יש לאסוף את הסופרנטנטים ולשמור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד לקבלת תוצאת בדיקת יעילות הטיהור. עבור הדגימות הניתנות למיצוי מלח, השעו מחדש את שרף ה-FLAG ב-4 מ"ל של TEGN והעבירו לצינור של 15 מ"ל. חזור על שלב זה שלוש פעמים, בכל פעם העביר לאותם 15 מ"ל כדי למנוע אובדן חרוזים.

צנטריפוגה למשך שתי דקות בחום של 1, 000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף 13 מ"ל של TEGN לשרף ה-FLAG ולצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1,000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס. שוטפים את השרף שבע פעמים בצורה זו.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את השרף ב -1 מ"ל של TEGN והעבירו לצינור כריכה נמוך של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה למשך שתי דקות והסר את הסופרנטנט. השעו מחדש את השרף עבור כל נקודת ניסוי ב-100 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד FLAG ב-4 מ"ג/מ"ל ב-pH 7.8 ערבבו היטב והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר TEGN.

דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לחסל חלבונים קשורים. צנטריפוגה למשך שתי דקות ומעבירים את השרף והסופרנטנט לעמוד ספין ריק המונח בצינור של 2 מ"ל. צנטריפוגה את העמוד למשך דקה אחת ב 6, 000 x גרם.

אוספים את שאריות הסופרנטנט בצינור של 2 מ"ל. לאחר מכן נבדקת יעילות הטיהור כמתואר בטקסט הפרוטוקול, לפני שממשיכים בטיהור מבוסס HA. מוצגות כאן תוצאות מייצגות של קומפלקסים מטוהרים של MyoD עם זיקה כפולה משברים הניתנים למיצוי מלח גרעיני או מועשרים בנוקלאזום של קו תאי HeLa S3 המבטאים ביציבות את FLAG HA MyoD.

צביעת כסף זיהתה את FLAG HA MyoD המסומן על ידי החץ שנעדר מקו התא המדומה. קומפלקסי ה-MyoD המטוהרים בזיקה כפולה חולקו על שיפועי גליצרול. כתמים מערביים של השברים באמצעות נוגדנים נגד FLAG חשפו את תת-הקומפלקסים של MyoD בשני התאים התת-גרעיניים.

בפרט, MyoD הניתן למיצוי מלח מופץ בשלושה תת-קומפלקסים ואילו MyoD הקשור לכרומטין שייך בעיקר לקומפלקס אחד. ניתוח ספקטרומטריית מסה של אינטראקטורים MyoD שבודדו משברים הניתנים למיצוי מלח גרעיני ומועשרים בנוקלאוזום זיהו סדרה של שותפים ידועים ושותפים חדשים של MyoD. כאן האינטראקטורים של MyoD שנמצאים בשני השברים או, במיוחד עבור אחד השברים, מקובצים על סמך ההערות הפונקציונליות שלהם.

חלק מספקטרומטריית המסה שגילתה אינטראקטורים אושרו על ידי כתם מערבי על קומפלקסים של MyoD. אלה כוללים את גורמי השעתוק CBF, תת-היחידה SWI/SNF BAF47 וחלבוני HP1. מכיוון שתאי HeLa אינם תאי שריר ואינם מבטאים בדרך כלל MyoD, יש צורך לאשר אינטראקציות בין אינטראקטורים שזוהו לאחרונה לבין MyoD ומיובלסטים.

תמציות גרעיניות מריבוי והתמיינות של מיובלסטים של עכברים שימשו למשקעים חיסוניים ולניתוח מערבי עם הנוגדנים שצוינו. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לחדד את התוצאות המתקבלות במיובלסטים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפלה של השותף המסוים במערכת רלוונטיות כמו מיובלסטים, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו משמעות פונקציונלית של האינטראקציה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטיקה הביולוגית ההתפתחותית לחקור את רשת הוויסות של חמישה גורמי שעתוק ברוב מערכות הגוף. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות את השותפים של גורם השעתוק על ידי ביצוע פיצול תאים ואחריו טיהור זיקה טנדם יחד עם ספקטרומטריית מסה.