Name: הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA גין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: למדו שיטה יעילה לבידוד DNA ו-RNA מאבקות לצורך אפיון קהילות חיידקיות באמצעות ריצוף גן 16S rRNA. הפרוטוקול משתמש בחומצה פנול-כלורופורם ומתאים למחקר מיקרוביולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות אליזבת ביירן, דוד Gootenberg, וקריסטינה Gosmann עבור משוב ביקורתי על הפרוטוקול; מייגן בלדריג, סקוט הנדלי, סינדי מונקו, וג&#39;ייסון נורמן להדרכה מדגם הכנה והפגנות; וונדי Garrett, קרטיס Huttenhower, דלג בתולה, וברוס ווקר לייעוץ פרוטוקול ודיונים פוריים; וג&#39;סיקה Hoisington-לופז לתמיכה רצף. עבודה זו נתמכה על ידי קרן ביל ומלינדה גייטס ואת NIAID (1R01AI111918). DSK קיבל תמיכה נוספת מהקרן Wellcome בורוז. MNA נתמכה על ידי מספר פרס T32GM007753 מן NIGMS, ואת פול ודייזי סורוס המלגה. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של NIGMS או NIH.

<ol><li>Huttenhower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+diversity+of+the+healthy+human+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure, function and diversity of the healthy human microbiome.</a> Nature. 486, 207-214 (2012).</li>
<li>O'Hanlon, D. E., Moench, T. R., Cone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+pH+and+microbicidal+lactic+acid+when+lactobacilli+dominate+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Vaginal pH and microbicidal lactic acid when lactobacilli dominate the microbiota.</a> PloS one. 8, e80074(2013).</li>
<li>Aldunate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+concentrations+of+lactic+acid+potently+inactivate+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Vaginal concentrations of lactic acid potently inactivate HIV.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68, 2015-2025 (2013).</li>
<li>Anahtar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervicovaginal+bacteria+are+a+major+modulator+of+host+inflammatory+responses+in+the+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cervicovaginal bacteria are a major modulator of host inflammatory responses in the female genital tract.</a> Immunity. 42, 965-976 (2015).</li>
<li>Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+mouse+model+of+phage-bacterial+host+dynamics+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20236-20241 (2013).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical biochemistry. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+of+human+vaginal+bacteria+and+relationship+with+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Temporal variability of human vaginal bacteria and relationship with bacterial vaginosis.</a> PloS one. 5, e10197(2010).</li>
<li>Dols, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+clinically+relevant+vaginal+bacteria+in+relation+to+bacterial+vaginosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+obstetrics+and+gynecology%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of clinically relevant vaginal bacteria in relation to bacterial vaginosis.</a> American journal of obstetrics and gynecology. 204, 301-307 (2011).</li>
<li>Segata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+microbial+community+profiling+using+unique+clade-specific+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes.</a> Nature methods. 9, 811-814 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+patterns+of+16S+rRNA+diversity+at+a+depth+of+millions+of+sequences+per+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4516-4522 (2011).</li>
<li>16S rRNA Amplification Protocol. Earthmicrobiome Project. , Available from: www.earthmicrobiome.org (2015).</li>
<li>Ravel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+microbiome+of+reproductive-age+women%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vaginal microbiome of reproductive-age women.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).</li>
<li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+in+women+with+bacterial+vaginosis%3A+high+resolution+phylogenetic+analyses+reveal+relationships+of+microbiota+to+clinical+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria.</a> PloS one. 7, e37818(2012).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QIIME+allows+analysis+of+high-throughput+community+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data.</a> Nature methods. 7, 335-336 (2010).</li>
<li>Werner, J. MacQIIME. , Available from: http://www.wernerlab.org/software/macqiime (2015).</li>
<li>Schloss, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+mothur%3A+open-source%2C+platform-independent%2C+community-supported+software+for+describing+and+comparing+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities.</a> Applied and environmental microbiology. 75, 7537-7541 (2009).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPARSE%3A+highly+accurate+OTU+sequences+from+microbial+amplicon+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.</a> Nature. 10, 996-998 (2013).</li>
<li>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer, V1.0 User Manual. Thermo Fisher Scientific. , Available at: http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/ATG/CAD/CAD Documents/Product Manuals & Specifications/Molecular Spectroscopy/UV Visible Spectrophotometers/Spectrophotometer Systems/NanoDrop/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).</li>
<li>AllPrep DNA/RNA Mini Kit. Qiagen. , Available from: https://http://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna-sample-technologies/dna-rna-protein/allprep-dnarna-mini-kit/ - orderinginformation (2015).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of visualized experiments. , (2012).</li>
<li>UltraClean PCR Clean-Up Kit Instruction Manual. MoBio. , Available from: http://www.mobio.com/images/custom/file/12500(1).pdf (2013).</li>
<li>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent. Invitrogen. , Available at: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp07581.pdf (2008).</li>
<li>Quality Scores for Next-Generation Sequencing. Illumina. , Available from: http://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf (2011).</li>
<li>split_libraries_fastq.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html (2015).</li>
<li>DeSantis, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Greengenes%2C+a+chimera-checked+16S+rRNA+gene+database+and+workbench+compatible+with+ARB%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB.</a> Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).</li>
<li>pick_open_reference_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/pick_open_reference_otus.html (2015).</li>
<li>summarize_taxa_otus.py. QIIME. , Available from: http://qiime.org/scripts/summarize_taxa.html (2015).</li>
<li>Vazquez-Baeza, Y., Pirrung, M., Gonzalez, A., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPeror%3A+a+tool+for+visualizing+high-throughput+microbial+community+data%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">EMPeror: a tool for visualizing high-throughput microbial community data.</a> GigaScience. 2, 16(2013).</li>
<li>Comparing categories. QIIME. , Available from: http://qiime.org/tutorials/category_comparison.html (2015).</li>
<li>Eren, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+diversity+of+Gardnerella+vaginalis+in+the+genitourinary+tract+microbiota+of+monogamous+couples+through+subtle+nucleotide+variation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Exploring the diversity of Gardnerella vaginalis in the genitourinary tract microbiota of monogamous couples through subtle nucleotide variation.</a> PloS one. 6, e26732(2011).</li>
<li>Diagnosing and preventing flow cell overclustering on the MiSeq system. Illumina. , Available from: http://support.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/other/miseq-overclustering-primer-770-2014-038.pdf (2015).</li>
<li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature biotechnology. 31, 814-821 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הנה אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי ואפיון של שכיחותם חיידקי יחסיות בתוך משטח וגינאלי האדם. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם עבור סוגי מדגם אחרים, כגון שרפרף מטליות של אתרים אחרים בגוף, ועל דגימות שנאספו ממגוון רחב של גורמים. הפקת חומצות גרעין ממכות חרוז בתמיסה שנאגרה של פנול כלורופורם מאפשרת בידוד של שני DNA ו- RNA, וזה חשוב במיוחד כשעובד עם דגימות יקרות שנאספו באמצעות מחקרים קליניים. ב- DNA של החיידק המבודד מצוין לזיהוי טקסונומי חיידקים והרכבה גנומית, בעוד אוסף סימולטני של רנ&quot;א מספק את ההזדמנות כדי לקבוע חיידקים פונקציונליים, מארח, וכן תרומות ויראלית דרך-seq RNA. הפרוטוקול המתואר משתמש קבוצת פריימר צעד אחד תוקפת כי נפרסה בהצלחה על מגוון רחב של סוגי מדגם, כוללים אדם, כלבים, דגימות סביבתיות 10 </sup&gt;. הזמינות של אלף פריימרים המינימרקטים מאפשרת ריבוב של דגימות וחיסכון עצום בעלויות רצף. העלות המלאה (כולל כל ריאגנטים, ריצת רצף אחד, פריימרים אבל לא ציוד) היא כ -20 $ לדגימה כאשר 200 דגימות multiplexed. בנוסף, יש שחזור גבוה מאוד כאשר מטליות מרובות מאותו אתר מדגם מעובדים באופן נפרד באמצעות הצינור כולו. בסך הכל, הפרוטוקול הוא עלות יעיל, גמיש, אמין, דיר. חלק מיצוי חומצות הגרעין של פרוטוקול זה הוא מוגבל על ידי אמצעי הבטיחות הנדרש כאשר עובדים עם פנול כלורופורם, ואת האתגרים של מיכון הצינור על תפוקה גבוהה, 96-גם בפורמט צלחת. בנוסף, המכות החרוזות הנמרצות המשמשות מזמרת תמוגה מכאנית ב- DNA של החיידק לכ 6 שברי kilobase; אם כבר קטעי דנ&quot;א נדרשים עבור יישומים במורד זרם, המשך של מכות החרוזותhould להתקצר. המגבלות של חלק זיהוי החיידקים של פרוטוקול זה הן אינהרנטי לכל שיטה המסתמכת על רצף גן 16S rRNA. 16S rRNA הרצף אידיאלי לזיהוי חיידקים מהמין ואפילו מינים ברמה, אבל לעתים רחוקות מספק זיהוי רמת מתח. בעוד האזור משתנה V4 הגן 16S rRNA מספק אפליה חזקים בקרב רוב מינים של חיידקים 11, שיטות חישוביות נוספים כגון Oligotyping 31 ייתכן שיהיה צורך להשתמש בהם כדי לזהות מינים מסוימים דווקא, כגון crispatus לקטובצילוס. לבסוף, מידע על היכולות התפקודיות חיידקים המדויקים בתוך מדגם מסוים לא ניתן לקבוע על ידי רצף גן 16S rRNA לבד, אם כי בפרוטוקול זה מאפשר מיצוי של DNA הגנום כולו ו- RNA שיכול לשמש לקראת מטרה זו. השלב הקריטי ביותר להבטחת הצלחה עם פרוטוקול זה הוא לוקח בזהירות רבה כדי למנוע זיהום durאוסף מדגם ing, מיצוי חומצות גרעין, הגברת PCR. להבטיח סטריליות בעת איסוף דגימה ידי לבישת כפפות נקיות בעזרת מקלוני סטרילי, צינורות, ומספריים. כדי להעריך עבור זיהום של חומרים האוספים, לאסוף דגימות בקרה שליליות על ידי נחת מטליות ללא שימוש נוספים ישירות לתוך צינורות הובלה בעת הדגימה. במעבדה, לבצע את כל השלבים טרום הגברה במנדף מעוקר המכיל אספקה ​​לחטא רק ושימוש כיתה מולקולרית רק עם ריאגנטים חינם-DNA. במהלך חילוץ חומצות גרעין, למנוע זיהום צולב באמצעות מלקחיים סטריליות חדשים וכפפות טריות עם כל דגימה, ושמירה על כל הצינורות סגורים אלא בשימוש. עיבוד מטליות בשימוש במקביל מבטיח סטריליות של שני אוסף המדגם וסחיט חומצות גרעין; המטליות בשימוש לא אמורות להניב גלולה לאחר ממטרי isopropanol ושטיפת אתנול. אם גלול אכן מופיע, לבצע הגברת גני 16S rRNA לקבוע מקור אפשרי שלהזיהום (למשל, הנוכחות של סטרפטוקוקוס או סטפילוקוקוס יצביע זיהום בעור). בנוסף, לבצע רחבות PCR ללא תגובות שליטת תבנית במקביל על מנת להבטיח כי ריאגנטים PCR והתגובות לא זוהמו. אם להקה מופיעה אין שליטת תבנית, וזורק את ריאגנטים וחזור ההגברה עם ריאגנטים טריים. נקיטת אמצעי זהירות אלה תבטיח רצף מוצלח של החיידקים של עניין. שלב ההגברה PCR נוטה לחייב את התקלות ביותר. הגברה בקבוצות של שנים עשר דגימות מספק איזון בין יעילות ועקביות. העדר מוחלט של להקות, מעבר לכל הדוגמאות ב סט הגברה נתון מצביע על כשל מערכתי, למשל, שוכח להוסיף מגיב או שגוי תכנות thermocycler. היעדרם של הלהקה מתוך כמה דוגמאות לרוב בשל טעות אנוש, ואת amplifications צריך להיות מחדש run עם אותו הזיווג של מדגם פריימר ההפוך. במקרה של היעדרות המשך להקה, המדגם יכול להיות מחדש מוגבר באמצעות פריימר הפוכה עם ברקוד שונה. כשלי הגברה חוזרים עם פריימרים הפוכים מרובים עשויים להצביע מעכב נוכחי במדגם. במקרה כזה, לנקות את ה- DNA עם טור לעתים קרובות יסיר מעכבים מבלי לשנות שכיחותם בקטריאלי יחסית משמעותי. אם להקות מרובות נובעות לאחר הגברה, מחדש להגביר המדגם עם ברקוד פריימר הפוכה שונים. בנוסף למניעת זיהום סביבה ועל הבטחת הגברה של מוצר ספציפי אחד, רצף מוצלח מסתמך על טיפול בעת הכנת ברכת הספרייה. המטרה היא לשלב כמויות equimolar של כל amplicons של מדגם על מנת להבטיח כ המספר הזהה של רצף קורא לדגימה. אם ריכוזי חומצת הגרעין לפני ההגברה ניתנות להשוואה, פשוט הוסיף כמויות שווות של כל saamplicons של mple מספיק בעת יצירת ברכת הספרייה. עם זאת, אם ריכוזי חומצת הגרעין שונים במידה רבה והוסיפו נפח שווה, המדגם עם ריכוז חומצות גרעין הנמוך ייוצג גרוע עם מספר נמוך של הקורא. במקרה זה, ניתן להוסיף נפח גבוה יותר של amplicons מן מדגם הריכוז הנמוך בהתבסס על העצמה היחסית של להקת ג&#39;ל. לחלופין, אפשר יותר בקפדנות להסיר פריימרים מן amplicons הפרט, לכמת ריכוז amplicon של מדגם בודד באמצעות ערכת כימות dsDNA fluorometric, ודווקא לשלב כמויות equimolar של כל דגימה. לאחר ברכת amplicon מאוזנת היטב מופקת, הוא הופך להיות קריטי כדי למדוד את הריכוז של הברכה בזהירות. דילול זהיר לאחר וספייק-in עם PhiX להגדיל את המורכבות הקריאות היא קריטיות להשגת תוצאות רצף אופטימליות. sequencers תפוקה גבוהה המשתמש sequencing בסינתזה רגיש מאוד לצפיפות מצרר על תא הזרימה. טוען בריכת הספריה מרוכזת מדי תגרום overclustering, עם ציוני איכות נמוכים יותר, פלט נתונים נמוך, ו -32 demultiplexing מדויק. טוען בריכת ספרייה שהיא לדלל מדי יביא גם פלט נתונים נמוכים. בזהירות לכימות ברכת הספרייה לפני הרצף יהיה להבטיח תוצאות אופטימליות. 16S rRNA רצף הגן מספק הערכה מקיפה של החיידקים הנוכחיים בתוך מדגם נתון הוא צעד ראשון קריטי בדור שערה. הנוכחות של מערך עשיר של מטה נוסף מאפשרת לחוקר לבחון את קשר בין מיני חיידקים מסוימים וגרם ביולוגיים חשובים. יתר על כן, אותו המידע 16S יכול לשמש כדי להסיק את פונקציות חיידקים באמצעות כלים כגון PICRUSt 33. המטרה הסופית היא להשתמש 16S אפיון לזהות עמותות רומן כי יכול להיותעוד נבדק ומאומת במערכות מודל, מוסיף גוברת ההבנה שלנו של השפעת Microbiome החיידקים על בריאות אדם ועל מחלותיו.

האדם נמוך במערכת הרבייה, מערכת העיכול, מערכת הנשימה, העור הם יישבו על ידי קהילות חיידקי מורכבות שאינן קריטית לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותמיכה הבריאות של המארח 1. למשל, לקטובצילוס מסוימים ליצור סביבה עוינת עבור פתוגנים על ידי acidifying בכספת הנרתיק, ייצור effectors מיקרוביאלית ויסות חסינות המארח המקומי 2-4. האהדה הגוברת לחשיבות של Microbiome החיידקים גם גדלה עניין באפיון קהילות חיידקים בהקשרים קליניים רבים. כאן נתאר שיטה כדי לקבוע את ההרכב של Microbiome חיידקי מטליות איברי המין. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות עבור דגימות צואה מטליות שנאספו ממקומות אנטומיים אחרים ומינים מארחים אחרים. בשל המגבלות המובנות במספר הדגימות שניתן נאספות ונשמרו מן הרבעה נתונהמשתתף y, פרוטוקול זה נועד לחלץ DNA, RNA, ואפשרות אפילו חלבון מן ספוגית יחידה באמצעות 5,6 שיטת הכאת חרוז המבוססת מותאמת פנול, כלורופורם. השילוב של הפרעה הפיסית של קירות תא חיידק עם הכאת חרוז ושיבוש כימי עם דטרגנטים מאפשר תמוגה מהירה של גראם חיובי, גראם שלילי, וחומצה-מהר חיידקים ללא צעדי עיכול אנזימטי נוספים. כדי להשיג RNA באיכות גבוהה, מומלץ להשתמש מטליות יבשות כי הוחזקו בבית או מתחת ל -4 מעלות צלזיוס מיד לאחר איסוף במהלך ההובלה למעבדה (אם רלוונטי), לטווח ארוך מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את Microbiome החיידקים בתוך מדגם נתון, הליך זה מנצל רצף amplicon גן 16S rRNA, אשר נמצא כעת את האמצעים הכי חסכוני להקצות הטקסונומיה של חיידקים מקיפים ולבצע כימות יחסיות. שיטות חלופיות כוללות ממוקד 7 qPCR, מנהג microarrays 8, ו-הגנום כולו רצף 9. גן 16S rRNA מכיל תשעה אזורי hypervariable, ואין הסכמה לגבי אזור V האופטימלי שממפה ללימודי Microbiome בנרתיק. כאן אנו משתמשים סט פריימר 515F / 806R ולבנות על צינור שעיצב Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. &#39;S 515F / 806R סט פריימר מאפשר ריבוב של מאות דגימות על ריצה רצף יחיד בשל הזמינות של אלפי פריימרים המינימרקטים תוקף ותאימות עם פלטפורמות רצף Illumina. בניגוד פריימר 27 ו / 338R של הפרויקט Microbiome האדם להגדיר 13, 515F / 806R גם ביעילות מגביר Bifidobacteriaceae ובכך במדויק לוכדת Gardnerella vaginalis, חבר חשוב של הקהילה חיידקים בנרתיק אצל חלק מהנשים. לחלופין, זוג פריימר 338F / 806R שמש בהצלחה עבור pyrosequencing של דגימות מנרתיק 14 וזוג פריימר 515F / 926R יש recently מתפרסם עבור סידור הדור הבא 12. לבסוף, פרוטוקול זה מספק הוראות בסיסיות לבצע 16S ניתוח amplicon באמצעות תובנות כמותי לתוך אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME) תוכנה חבילה 15. יישום מוצלח של פקודות QIIME המתוארות כאן מניב טבלה המכילה שכיחותם טקסונומיות חיידקים עבור כל דגימה. רבים צעדים נוספים בקרת איכות, שיטות הסיווג הטקסונומי, וצעדים ניתוח ניתן לשלב ניתוח, כמתואר בפירוט באתר QIIME (http://qiime.org/index.html). אם הניתוח יבוצע על מחשב אפל, חבילת MacQIIME 16 מספקת התקנה קלה של QIIME ויחסי התלות שלה. חבילות תוכנה אלטרנטיביות לניתוח רצף גן 16S rRNA כוללות Mothur 17 UPARSE 18.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>PCR תחנת</td><td></td><td></td> עבודה <td>ניתן להשתמש בכל קולט אדים, למשל, AirClean 600.</td></tr><tr><td>תרמוסייקלר</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מחזור תרמי עם מכסה מחומם, למשל, MJ Research PTC-200.</td></tr><tr>מערכת <td></td><td></td><td>אלקטרופורזה</td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת אלקטרופורזה, למשל מערכת האלקטרופורזה Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>כל שיטת כימות DNA אחרת תספיק</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>אלטרנטיבה היא מכשיר Agilent 2200 TapeStation. לא הכרחי לחלוטין אבל מאוד מועיל.</td></tr><tr><td>MiSeq או HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catch-All אוסף דוגמאות ספוגית</td><td>Epibio</td><td>QEC89100</td><td>ניתן להשתמש במקלונים אחרים, אך ספוגית Catch-All מומלצת על ידי פרויקט המיקרוביום האנושי.</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סינון SteriFlip 50 מ"ל (0.22 & מיקרו; m)</td> <td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0.1 מ"מ חרוזי זכוכית</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינורות מכסה הברגה</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td>להכאת חרוזים</td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>אמביון (Invitrogen)</td> <td>AM9856</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>0.5 מ ' EDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט, 20% תמיסה</td><td>פישר</td><td>BP1311-200</td><td>ביולוגיה מולקולרית בדרגת</td></tr><tr><td>מים מזוקקים UltraPure DNase/RNase</td><td>אמביון</td><td>10977-015</td><td>דרגת ביולוגיה מולקולרית, להכנת חיץ</td></tr><tr><td>2-פרופנול BioReagent, לביולוגיה מולקולרית, &ge; 99.5%</td> <td>Sigma</td><td>I9516-500ML</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: IAA, 25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>אזהרה: רעיל</td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט, pH 5.5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td><td>ביולוגיה מולקולרית כיתה</td></tr><tr><td>מלקחיים חד פעמיים מפוליסטירן סטריליים, PS</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל, שקופים, צינורות נקיים PCR</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>22364120</tr><tr><td>PCR כיתה מים</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>עבור PCR</td></tr><tr><td>Phusion נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0.5mL</td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל PCR 8 צינור עם כובעים שטוחים שקופים מחוברים, טבעי</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>כל רצועות 8 צינורות שהן ללא DNase, RNase, DNA ומעכבי PCR עבודה</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x מאגר TAE</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>DNA כתם ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x טעינת DNA צבע</td><td>תרמו (פישר)</td> <td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 bp GeneRuler סולם</td><td>תרמו (פישר)</td> <td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>ערכת AllPrep DNA/RNA</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי UltraClean PCR</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td>חלופה היא Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td><חזק>פריימרים:</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F (פריימר קדימה) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'סדר</td><td></td><td></td> <td>ב-100 נמול; טיהור: התפלה סטנדרטית. השעיה מחדש ב-100 &micro;M. **<חזק>קריטי: יש לתלות מחדש את הפריימרים עם MoBio PCR Grade Water (ראה לעיל) במכסה המנוע כדי למנוע זיהום.**</td></tr><tr><td>פריימרים הפוכים, עיין בקובץ הקוד המשלים ו: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt</td><td>IDT מומלץ</td><td></td><td>אם מזמינים סטים גדולים של פריימרים, הזמינו כצלחת של 96 בארות בסולם של 100 נמול. השעיה ב-100 &M. הנחיות מלאות להזמנת פריימר והשעיה מחדש ב-http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc.&nbsp; **<חזק>קריטי: יש לתלות מחדש את הפריימרים עם מים בדרגת MoBio PCR (ראה לעיל) במכסה המנוע כדי למנוע זיהום.**</חזק></td></tr><tr><td>קרא 1 פריימר רצף 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCC GCG GTA A-3'25</td><td></td><td></td> <td>nmole; טיהור: התפלה סטנדרטית. השעיה ב-100 ומיקרו-מ'.</td></tr><tr><td>קרא 2 פריימר רצף 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'26</td><td></td><td></td> <td>nmole; טיהור: התפלה סטנדרטית. השעיה ב-100 ומיקרו-מ'.</td></tr><tr><td>פריימר רצף אינדקס 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3'27</td><td></td><td></td> <td>nmole; טיהור: התפלה סטנדרטית. השעיה ב-100 ומיקרו-מ'.</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>נדרש אם מבצעים את הרצף בתוך הבית. אם הריצוף יבוצע על ידי מרכז ריצוף של צד שלישי, כבר יהיה להם PhiX.</td></tr></tbody></table>

הפקת חומצות גרעין יעיל 16s rrna ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

ישנה הערכה גוברת לתפקיד של קהילות חיידקים כמו מאפננים חשובים לבריאות אדם ומחלות. טכנולוגיות רצף תפוקה גבוהה אפשרו לאפיון מהיר ויעיל של קהילות חיידקי באמצעות רצפי גנים 16S rRNA ממגוון מקורות. למרות כלים זמינים עבור ניתוח רצף 16S rRNA יש זרימות עבודה חישובית סטנדרטיות, עיבוד מדגם להפקת DNA נשאר מקור המשך של השתנות בין מחקרים שונים. כאן אנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מ מטליות. אנחנו גם להתוות שיטות במורד הזרם עבור סידור הגן 16S rRNA, כולל דור של ספריות רצף, בקרת איכות נתונים, וניתוח רצף. זרימת העבודה יכולה להכיל סוגי דגימות מרובים, כוללים שרפרף מטליות שנאספו במגוון מיקומים אנטומיים של פונדקאי. בנוסף, התאושש DNA ו- RNA ניתן להפריד ומשומשיםעבור יישומים אחרים, כולל רצף הגנום כולו או-seq RNA. השיטה המתוארת מאפשרת גישת עיבוד משותפת סוגי מדגם מרובים להכיל ניתוח במורד זרם של מידע גנומי, metagenomic ו תעתיק.

<html> הסקירה הכללית של הפרוטוקול המאפשר קביעת שכיחותם חיידקי יחסים מן ספוגית באמצעות רצף גן 16S rRNA, מוצגת באיור 1 .the פרוטוקול כבר מותאמת למשטח מנרתיק אדם, אך ניתן להתאים בקלות עבור אתרי דגימה הרירית ביותר ומארחים אחרים. איור 2 מדגים את ה- DNA באיכות הגבוהה ו- RNA כי ניתן לבודד באמצעות פרוטוקול הכאת חרוז. איור 3 ממחיש הגברת PCR מוצלחת של 12 דגימות, שבו כל הגברה עם מדגם ניב להקה חזקה אחת של הפוליטיקלי גודל כל פקד במים לא ניב להקה. תרשים 4 מתארים את כימות של ברכת הספרייה הסופית לפני הסידור. איור 5 מראה פרופיל איכות רצף טיפוסי אחרי ריצת MiSeq חד סוף -300 נ&quot;ב. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1. סכמטי סקירה כללית של פרוטוקול. ראשית, חומצות גרעין מופק ספוגית ידי הכאת חרוז בתמיסה שנאגרו המכיל פנול, כלורופורם ולאחר isoamyl אלכוהול. אזור משתנה 4 של הגן 16S rRNA מוגבר אז מן חומצות גרעין וכתוצאה מכך באמצעות PCR. amplicons PCR ממרחק של עד מאות דגימות מצורפות יחד להפיק ולרצף על בטווח אחת. רצפים וכתוצאה מכך מותאמות מסד נתונים התייחסות לקבוע שכיחותם בקטריאלי יחסית. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע בעוד כשלושה ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> איור 2. באיכות גבוהה חומצות גרעין חילוץ באמצעות פנול: חרוז כלורופורם מכות Method. (א) איכות DNA, כפי שהוערך באמצעות ספקטרופוטומטר. יחס A260 / A280 בין 1.8 לבין 2.0 מציין חומצות גרעין טהור שאינו מזוהם עם פנול או חלבון. (ב) לאחר טור לנקות, פרוטוקול זה יכול להניב RNA באיכות גבוהה, שמסומן על ידי 16S ו 23S חזק פסגות rRNA. (C) שפלת RNA יכולה להתרחש אם המדגם אינו נשמר קר לאחר איסוף (במהלך הובלה ואחסון) או אם RNases נוכח במהלך עיבוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> אישור איור 3. 16S rRNA מוצלח ג&#39;ין הגברה שימוש 515F ו המינימרקטים 806R פריימר סט. אלקטרופורזה למעלה) ג&#39;ל משמש כדי לאשר את קיומו של להקה אחת כ -380 זוגות בסיסים in כל המדגם היה מוגבר בעזרת תבנית. היעדרם של להקה מציין הגברה מוצלחת; זה בדרך כלל עקב טעויות אנושות תגובת PCR ממדגם כי יש לחזור. תחתי) אין תבנית (מים) שולט לרוץ במקביל עם אותו זוג פריימר לא צריך מתנת להקה. הנוכחות של להקה בבקרת המים מציינת ריאגנטים מזוהמים; להתעלמות ריאגנטים שעשויים להיות מזוהם מחדש לעשות את amplifications PCR היא של חלוקת בקרת התבנית ומים כי זוג פריימר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> איור 4. כימותים של ריכוז ברכת הספרייה הסופית ותיקוף של גודל הספרייה. לאחר איגום amplicons המדגם הבודד, הריכוז דואר של ברכת הספרייה הסופית חייב להיות נחוש. ברכת הספרייה לאחר מכן יש מדוללת יותר כדי להשיג ריכוז 2 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> איור 5. נציגים ברים מגרש של ציוני איכות הרצף במיקום כל של הקריאה. זה נורמלי איכות הרצף לרדת אחרי 200 זוגות בסיסים, אבל תוצאת האיכות הממוצעת צריכה להישאר מעל 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> ברקוד <br/&gt; רצף </td><td colspan="3"> LinkerPrimer סדר פעולות </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> הוֹצָאָה קְבוּצָה </td><td> הַגבָּרָה צַלַחַת </td><td> תֵאוּר </td></tr><tr><td> ניתן למצוא קובץ מיפוי למשל #An בכתובת: http://qiime.org/_static/Examples/File_ פורמטים / דוגמא_ Mapping_ file.txt </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td> cervical סְפוֹגִית </td><td> 1 </td><td> א </td><td></td></tr></tbody></table> תבנית קובץ מיפוי טבלה 1.. Creaטינג קובץ מיפוי מדויק וממצה הוא קריטי לביצוע הפרוטוקול בהצלחה. קובץ המיפוי אינו נדרש רק לביצוע QIIME, אבל זה גם מאפשר לחוקר לשמור על הקשר בין הברקוד המדגם מטה, כדי לנתח את הנתונים עבור כל הטיות שיטתיות (למשל, יצווה אל תצווה וריאציה), ולקבוע מתאמים מעניינים בין מטה ואוכלוסיות חיידקים. קובץ מיפוי חשוף עצמות סופק, אבל משתמשים מעודדים מוסיפים עמודות רבות בעלי metadata ככל האפשר. דוגמאות של metadata נוסף משטח וגינאלי כולל אוסף הגיל, התאריך / השעה של ספוגית של המשתתף, סוג מניעת הורמונליים (אם רלוונטי), תוצאות בדיקות זיהום המועברות במגע מיני, וכו &#39; <img alt="Suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> רשימה משלימה קובץ 1. של המינימרקטים הפוך פריימר רצפים 10 </sup&gt;. השלוש העמודות הראשונות ניתן להשתמש כדי להשלים את קובץ המיפוי, ואת העמודה האחרונה מספקת רצף פריימר כולו להזמנת מטרות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד DNA ו-RNA באיכות גבוהה מדגימות במגב (swabs) ולאחר מכן לקבוע את הרכבם הבקטריאלי באמצעות רצף של הגן 16S rRNA. שיטה זו יכולה לסייע לחוקר לזהות אילו חיידקים נמצאים בדגימה אנושית נתונה ולקבוע קשרים בין חיידקים ספציפיים למאפייני המאכסן או למצב מחלה. למרות ששיטה זו תוכננה לספק תובנות לגבי קהילות חיידקים בנבל האנושי, ניתן להחיל את השיטה גם כדי לחקור קהילות חיידקים מאזורים אחרים בגוף, כגון הנחיריים, הפה, העור והחלק האחורי של המעי (rectum), וכן מאורגניזמים אחרים.שימו לב כי סרטון זה מדגיש את החלקים המורכבים יותר של הפרוטוקול ואינו מכסה את חלק הרצף או את ניתוח הרצף. בריטני באומן, טכנאית מהמעבדה שלי, תדגים את הפעולות. התחילו הליך זה עם משטחי שפשוף (swabs) של צוואר הרחם החיצוני (ectocervical) שנאספו ואוחסנו על קרח רטוב, כפי שמתואר במסמך הנלווה.כהכנה להפקת חומצות גרעין, נקה את כל משטחי המנדף ואת כל הפריטים המוכנסים למנדף באמצעות תמיסת הכלור, ולאחר מכן באמצעות חומר דקונטמינציה המסיר RNases, DNases ו-DNA. הנח במנדף שפופרת עם כדור (bead beading tube) אחת עבור כל דגימה. לכל שפופרת, הוסף 500 µL של בופר NaCl-Tris-EDTA, 210 µL של 20% SDS, ו-500 µL של phenol chloroform isoamyl alcohol.טיפול זהיר במטב שפשוף הוא קריטי להשגת תוצאות ברורות בפרוטוקול זה. נדרש מעט תרגול כדי להעביר את המטב מבלי להפילו, והדבר קל יותר אם משתמשים במטב בעל מוט חלל כמו זה. באמצעות פינצטה סטרילית, העבירו את המטב מבקבוק ההובלה אל מבחנת ה-bead beading.שפשפו ביסודיות את ראש המטוש כנגד הדפנות הפנימיות של המבחנה למשך 30 שניות לפחות. הניחו את המבחנה על קרח. לאחר מכן, החליפו כפפות וחזרו על הליך הדגימה עם הדגימה הבאה.לאחר שכל הדגימות ששפשפו בעוצמה, יש להניח להן להתקרר על קרח למשך 10 דקות לפחות. לאחר 10 דקות, כדי להוציא את המקלון, אחזו בידית באמצעות פינצטה סטרילית, ובעזרת טיפ P200 נקי, לחצו את ראש המקלון כנגד הדופן הפנימית של המבחנה. תהליך זה ישחרר נוזל מהמקלון ויגדיל את השחזור של חומצות הגרעין.הניחו את מבחורת הפיסוח (bead beading tube) בתוך מכשיר הפיסוח (bead beader) והומוגניзиру את הדגימה למשך שתי דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, סבבו את מבחורת הפיסוח בcentrifuge במהירות של 6,000 gs ובטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש דקות, כדי לשקע את השאריות ולהפריד בין הפאזה המימית לפאזה הפנולית. לאחר הסבב, ניתן בדרך כלל להבחין בשלושה שלבים.השכבה העליונה היא הפאזה המימית, המכילה את ה-DNA וה-RNA. השכבה התחתונה היא הפאזה האורגנית, המכילה ליפידים ושיירי תאים ומטשים. השכבה הלבנה הדקה במרכז, הנקראת האינטרפאזה, מכילה חלבון.העבירו את השלב המימי, כ-500 עד 600 µL, לפרועט סטרילי בנפח 1.5 mL. הוסיפו נפח שווה של פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול. ערבבו באמצעות היפוך וסחרור קצר במערבל וורטקס (vortex).סובב את המבחנה בצנטריפוגה למשך חמש דקות. לאחר הסבב, העבר את הפאזה המימית למבחנה סטרילית חדשה בנפח 1.5 מיליליטר. הקפד שלא להעביר חומר מהפאזה הבין-פאזית (interphase) או מפאזת הפנול שמתחתיה.יש לרשום את הנפח שהועבר ולשמור את פאזת הפנול לצורך בידוד חלבונים בעתיד. לאחר מכן, יש להוסיף 0.8 נפח של איזופרופנול ו-0.1 נפח של סודיום אצטט בריכוז three molar. יש לערבב היטב על ידי הפיכה קצרה ו-vortexing קצר.שקיעו את החומצה הגרעינית על ידי קירור המבחנה בטמפרטורה של 20 °C למשך שעתיים לפחות ועד ללילה שלם. לאחר השקיעה, סובבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך 30 דקות. לאחר הסבב, הסירו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) בעזרת פיפטה, תוך שמירה על שלמות המשקע (pellet).הוסיפו 500 µL של 100% ethanol. שחררו את המשקע באמצעות vortexing עדין או פיפוט ללא מגע במשקע. סובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות.בעזרת פיפט P10, הסירו והשליכו כמה שיותר אתנול מבלי להפריע למשקע. ייבשו את המשקע באוויר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. השעיקו מחדש את המשקע ב-20 microliters של UltraPure 0.1X-Tris-EDTA buffer.יש להניח לדגימה להתקרר על קרח למשך 10 דקות ולשאוב עם פיפטה באופן חוזר כדי להבטיח רסספנסיה מלאה. מדוד את ריכוז החומצות הגרעיניות באמצעות ספקטרופוטומטר. במידת הצורך, הפרד את ה-DNA מה-RNA באמצעות ערכה לניקוי בעזרת עמודה (column cleanup kit), בהתאם לפרוטוקול של היצרן.הכנת ה-PCR היא שלב קריטי בהליך זה. חשוב מאוד לצמצם את הזיהום על ידי הבטחת סטריליות של הרכיבים, מנף ה-PCR והכפפות. עבדו במהירות אך בזהירות, והשתמשו בטכניקה נכונה בעת העברת פריטים אל תוך המנף ומחוצה לו.מקמו במCתא מקרר שולחני נקי עבור מבחנות למיקרוצנטריפוגה ומקרר עבור פלטות PCR. סמנו מבחנות רצועה בעלות 8 בארות עם מכסים נפרדים והניחו אותן במקרר ה-PCR. יש לבצע את ההגברה בשלוש חזרות, ויש לכלול בקר מים ללא תבנית עבור כל זוג פריימרים.הנח מבחנה למיקרוצנטריפוגה במקרר עבור תערובת ה-master mix. לאחר מכן, עבור כל דגימה, שלב UltraPure water, 5X HF buffer, DNTPs, פריימר קדימה 515F ו-3%DMSO כפי שמתואר במסמך המצורף. לאחר מכן, הוסף פולימראז לתערובת ה-master mix וערבב באמצעות פיפטור.לבאר הראשונה, הוסף 90 microliters של תערובת המאסטר (master mix) ושני microliters של הפריימר ההפוך (reverse primer), וערבב היטב. לאחר מכן, לבאר הרביעית, המשמשת כביקורת ללא תבנית (no template control), הוסף 23 microliters מהמאסטר ושני microliters של מים וערבב. לבסוף, הוסף שישה microliters של הדגימה המתאימה לבאר הראשונה.ערבב היטב והעבר 25 µL לבאר השנייה. החלף טיפים, ולאחר מכן העבר 25 µL נוספים מהבאר הראשונה לבאר השלישית. סגור את כל הבארים היטב.הקפידו לא לגעת בחלק הפנימי של הבארות או במכסה. לאחר מכן, חזרו על תהליך זה עבור כל דגימה. לאחר הכנת כל הדגימות, סובבו במהירות את מבחנות הפס (strip tubes), העבירו אותן לטרמוסייקלר (thermocycler) והפעילו את התוכנית.לאחר השלמת ההרצה, סובבו את המבחנות במהירות (spin) כדי לרכז את הנוזל מהדפנות. לאחר מכן, על משטח עבודה נקי, העבירו את תגובות ה-PCR בשלוש חזרות מכל דגימה אל מבחנה סטרילית של מיקרוצנטריפוגה עם סימון. העבירו 25 µL מכל בקרת "ללא תבנית" (no template control) למבחנה סטרילית נפרדת.אל תאחדו עדיין אמפליקונים מדגימות שונות. כדי לאמת הגברה מוצלחת של ה-PCR, העמיסו 5 µL מכל דגימה על ג'ל agarose בריכוז 1.5% ובצעו אלקטרופורזה במתח של 120 volts למשך 30 עד 60 דקות. צפו בג'ל תחת אור UV.אששו את הצלחת ההגברה של כל דגימה על ידי זיהוי פס חזק בודד באזור של 380 base pairs. אם מופיע פס כפול, הגבירו שנית את הדגימה עם ברקוד הפוך (reverse barcode) שונה. אם לא מופיע פס כלל, הגבירו שנית את הדגימה תוך שימוש באותו ברקוד הפוך או בפריימר עם ברקוד הפוך חדש.אם ההגברה החוזרת אינה מצליחה, ייתכן שבדגימה קיימים מעכבי PCR; במקרה זה, יש לבצע ניקוי DNA מבוסס עמודה כדי להסיר את מעכבי ה-PCR. יש לאחסן את 70 µL הנותרים של האמפליקון בטמפרטורה של 20 °C. יש להשליך את 20 µL הנותרים של בקרת ה-no template, בהנחה שלא התקבל פס.כדי ליצור את מאגר האמפליקונים, ערבבו בין שניים לחמישה מיקרוליטרים מכל אמפליקון בתוך פרועת סטרילית אחת. אם הפס של דגימה מסוימת חלש, הוסיפו כמות כפולה בנפח בהשוואה לשאר הדגימות. לאחר מכן, הסירו את פריימרי ה-PCR באמצעות ערכה.במידת הצורך, שלבו את מאגרי האמפליקונים ללא הפריימרים כדי ליצור את הספריה הסופית. קבעו את ריכוז ה-DNA של הספריה באמצעות ספקטרופוטומטר או מערכת פלואורומטרית. לבסוף, דללו את הדגימות ל-2 nM ושלחו אותן לריצוף.מידע מפורט על ניתוח הרצפים מסופק במסמך המצורף. DNA ו-RNA באיכות גבוהה בודדו, וה-DNA שימש כתבנית להגברה באמצעות PCR של אזור V4 בגן 16S rRNA כפי שמתואר בסרטון זה. כדי לאשר את נוכחותו של פס אחד באזור של 380 base pairs בכל דגימה שהוגברה עם תבנית, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל.בביסרות השליטה ללא תבנית (no template controls), שנערכו במקביל עם אותו זוג פריימרים, לא הופיעה פס. לאחר מכן, אמפליקוני ה-PCR אוחדו לשפרופה אחת, כמותם נקבעה והם דוללו לפני הריצוף. מוצג כאן תרשים עמודות מייצג של ציוני איכות הריצוף בכל מיקום בקריאה.מצב שבו איכות הרצף יורדת לאחר 200 זוגות בסיסים הוא תקין, אך ציון האיכות הממוצע צריך להישאר מעל 30. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בידוד DNA ו-RNA ממטריות דגימה באמצעות סחטה מבוססת פנול-כלורופורם, הגברה של אזור V4 של הגן המקודד ל-16S rRNA, והכנת ספרייה לריצוף בעלות תפוקה גבוהה.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד מאוד למנוע זיהום במהלך איסוף הדגימות, מיצוי חומצות הגרעין וההגברה ב-PCR. זכרו כי עבודה עם פנול-כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע פרוצדורה זו, כגון עבודה במכסה עם פליטה למערכת אוורור ולבישת כפפות עמידות, משקפי מגן עם מגיני צד וחלוק מעבדה.

efficient-nucleic-acid-extraction-16s-rrna-gene-sequencing-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה של טיסה (MALDI-TOF MS) וטכניקות מולקולריות (ריצוף גנים 16S rRNA) מאפשרות זיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים באבחון שגרתי. מטרת פרוטוקול זה טמונה בשילוב של שתי הטכניקות מה שמוביל לנתונים מדויקים ואמינים יותר.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

מסופק פרוטוקול לכימות גנים ותעתיקים של חיידקים 16S rRNA ממשקעי חוף באמצעות PCR בזמן אמת. המתודולוגיה כוללת מיצוי משותף של DNA ו-RNA; הכנת RNA נטול DNA; וכימות גן rRNA 16S וכימות תעתיק באמצעות RT-q-PCR, כולל בניית עקומה סטנדרטית.

הפקת DNA-RNA סימולטני החוף משקעים וכימות של 16S rRNA גנים תעתיקי ידי בזמן אמת PCR

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

אנו מציגים את תהליך הבידוד, ההתרבות והאפיון של חיידקים מפרקים פחמימנים מבתי גידול מימיים. הפרוטוקול מתאר בידוד חיידקים, זיהוי בשיטת 16S rRNA, ובדיקת פוטנציאל פירוק הפחמימנים שלהם. מאמר זה יסייע לחוקרים לאפיין מגוון ביולוגי מיקרוביאלי בדגימות סביבתיות, ובמיוחד לסנן מיקרובים בעלי פוטנציאל לריפוי ביולוגי.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

כלי ו chemistries מתוארים ברצף כדי לבודד חומצות גרעין ואחריו חלבונים ממדגם ללא צורך בחשמל. כלי מורכב sorbent שנערך בתוך פיפטה העברת בעוד chemistries בידוד מבוססים על עקרונות מוצק בשלב החילוץ. מקרומולקולות את בודדים ניתן לנתח על ידי מבחני חיסונית מבוססי PCR מבוסס.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

למדו שיטה יעילה לבידוד DNA ו-RNA מאבקות לצורך אפיון קהילות חיידקיות באמצעות ריצוף גן 16S rRNA. הפרוטוקול משתמש בחומצה פנול-כלורופורם ומתאים למחקר מיקרוביולוגי.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג'ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

גלה סרטונים נוספים