הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג'ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד DNA ו-RNA באיכות גבוהה ממקלונים ולאחר מכן לקבוע את הרכב החיידקים שלהם באמצעות ריצוף גנים 16S rRNA. שיטה זו יכולה לעזור לחוקר לזהות אילו חיידקים כלולים בדגימה אנושית נתונה ולקבוע קשרים בין חיידקים מסוימים למאפייני המארח או למצב המחלה. למרות ששיטה זו נועדה לספק תובנה לגבי קהילות חיידקים בנרתיק אנושי, ניתן ליישם את השיטה גם לחקר קהילות חיידקים מאתרי גוף אחרים, כגון נרס, הפה, העור והחלחולת ומאורגניזמים אחרים.

שים לב שסרטון וידאו זה מדגיש את החלקים המורכבים יותר של הפרוטוקול ואינו מכסה את חלק הרצף או את ניתוח הרצף. בריטני באומן, טכנאית מהמעבדה שלי, תדגים. התחל הליך זה עם ספוגיות אקטוצרביות שנאספו ואוחסנו על קרח רטוב כמתואר במסמך הנלווה.

כהכנה למיצוי חומצות גרעין, נקו את כל משטחי מכסה המנוע ואת כל הפריטים שהוכנסו למכסה המנוע עם אקונומיקה ואחריה חומר מטהר שמסיר RNases, DNases ו-DNA. במכסה המנוע, הנח צינור חרוזי חרוזים אחד לכל דגימה. לכל צינור, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר NaCl-Tris-EDTA, 210 מיקרוליטר של 20% SDS ו-500 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם.

טיפול זהיר במטושים הוא קריטי להשגת תוצאות ברורות עם פרוטוקול זה. צריך קצת תרגול כדי להעביר את הספוגית מבלי להפיל אותה וזה קל יותר אם אתה משתמש בספוגית חלולה כמו זו. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את הספוגית מבקבוקון ההובלה לתוך צינור חרוזי החרוזים.

שפשפו היטב את ראש הספוגית על הקירות הפנימיים של הצינור למשך 30 שניות לפחות. הניחו את הצינור על קרח. לאחר מכן החלף כפפות וחזור על הליך הדגימה עם הדגימה הבאה.

לאחר שפשוף נמרץ של כל הדגימות הניחו להן להתקרר על הקרח למשך 10 דקות לפחות. לאחר שחלפו 10 דקות להסרת הספוגית, החזק את הידית בפינצטה סטרילית, ובעזרת קצה P200 נקי, לחץ את הראש על החלק הפנימי של דופן הצינור. תהליך זה עם שחרור נוזלים מהספוגית, מגביר את התאוששות חומצות הגרעין.

הנח את צינור חרוזי החרוזים לתוך חרוז החרוזים והומוגניזציה של הדגימה למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צנטריפוגה של צינור חרוזי החרוזים ב-6,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי לגלול את הפסולת ולהפריד בין השלבים המימיים והפנולים. לאחר הסיבוב ניתן לראות בדרך כלל שלושה שלבים.

השכבה העליונה היא הפאזה המימית, המכילה את ה-DNA וה-RNA. השכבה התחתונה היא השלב האורגני, המכילה שומנים ופסולת מהתאים והספוגיות. השכבה האמצעית הלבנה הדקה, הנקראת אינטרפאזה, מכילה חלבון.

העבירו את השלב הימי, כ -500 עד 600 מיקרוליטר, לצינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. הוסף נפח שווה של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם. ערבוב על ידי היפוך ומערבולת קצרה.

צנטריפוגה את הצינור למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, העבירו את השלב המימי לצינור סטרילי חדש של 1.5 מיליליטר. הקפד לא להעביר חומר מהאינטרפאזה או משלב הפנול הבסיסי.

שימו לב לנפח המועבר ושמרו את שלב הפנול לבידוד חלבון עתידי. לאחר מכן, הוסף 0.8 נפח איזופרופנול ו-0.1 נפח של שלוש נתרן אצטט מולארי. מערבבים היטב על ידי היפוך ומערבולת קצרה.

זרז את חומצת הגרעין על ידי קירור הצינור ב-20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות ולמשך הלילה. לאחר המשקעים, צנטריפוגה את הצינור למשך 30 דקות. לאחר הסיבוב, השתמש בזהירות בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט, והשאיר את הגלולה שלמה.

הוסף 500 מיקרוליטר של 100% אתנול. עקור את הגלולה בעזרת מערבולת עדינה או פיפטינג מבלי לגעת בגלולה. צנטריפוגה למשך חמש דקות.

בעזרת פיפטה P10, הסר והשליך כמה שיותר אתנול מבלי להפריע לגלולה. יבש את הגלולה באוויר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר של מאגר UltraPure 0.1X-Tris-EDTA.

הניחו לדגימה להתקרר על קרח למשך 10 דקות ופיפטה שוב ושוב כדי להבטיח השעיה מלאה. מדוד את ריכוז חומצות הגרעין באמצעות ספקטרופוטומטר. אם תרצה, הפרד DNA מ-RNA באמצעות ערכת ניקוי עמודות בהתאם לפרוטוקול היצרן.

הגדרת ה-PCR היא שלב קריטי בהליך זה. חשוב מאוד למזער את הזיהום על ידי הבטחת סטריליות של הריאגנטים, מכסה המנוע של ה-PCR והכפפות. עבדו במהירות אך בזהירות והשתמשו בטכניקה נכונה בעת העברת פריטים לתוך מכסה המנוע והחוצה ממנו.

הנח מתלה קירור ספסל נקי לצינורות מיקרוצנטריפוגה ומצנן צלחות PCR במכסה המנוע. סמן צינורות רצועה עם 8 בארות עם כובעים בודדים והנח אותם במקרר ה-PCR. יש לבצע הגברה בשלוש עותקים ולכלול בקרת מים ללא תבנית עבור כל זוג פריימר.

הניחו צינור מיקרו-צנטריפוגה בצידנית לתערובת המאסטר. לאחר מכן, עבור כל דגימה, שלב מים UltraPure, מאגר 5X HF, DNTPs, פריימר קדימה 515F ו-3% DMSO כמתואר במסמך הנלווה. לאחר מכן, הוסיפו פולימראז לתערובת המאסטר וערבבו על ידי פיפטינג.

לבאר הראשונה מוסיפים 90 מיקרוליטר מתערובת המאסטר ושני מיקרוליטר מהפריימר ההפוך, מערבבים היטב. ואז לבאר הרביעית, המשמשת כבקרת ללא תבנית, מוסיפים 23 מיקרוליטר של המאסטר ושני מיקרוליטר מים ומערבבים. לאחר מכן, הוסף שישה מיקרוליטר מהדגימה המתאימה לבאר הראשונה.

מערבבים היטב ומעבירים 25 מיקרוליטר לבאר השנייה. החלף טיפים ואז העביר עוד 25 מיקרוליטר מהבאר הראשונה לבאר השלישית. יש לסגור היטב כל באר.

הקפד לא לגעת בחלק הפנימי של הבארות או במכסה. לאחר מכן, חזור על תהליך זה עבור כל דגימה. לאחר הכנת כל הדגימות, סובב במהירות את צינורות הרצועה, העבר אותם למחזור תרמי והפעל את התוכנית.

לאחר סיום הריצה, סובב במהירות את הצינורות כדי לאסוף נוזלים מהקירות. לאחר מכן, על ספסל מעבדה נקי, שלב את תגובות ה-PCR המשולשות מכל דגימה בצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי מסומן. העבירו 25 מיקרוליטר מכל בקרת תבנית ללא תבנית לצינור סטרילי נפרד.

אל תשלב אמפליקונים מדגימות שונות עדיין. כדי לאמת הגברת PCR מוצלחת, טען חמישה מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל אגרוז של 1.5% ובצע אלקטרופורזה ב-120 וולט למשך 30 עד 60 דקות. צפו בג'ל תחת אור UV.

ודא הגברה מוצלחת של כל דגימה על ידי ציון פס חזק יחיד סביב 380 זוגות בסיסים. אם יש פס כפול, הגבירו מחדש את הדגימה עם ברקוד הפוך אחר. אם אין פס כלל, הגבר מחדש את הדגימה באמצעות אותו ברקוד הפוך או פריימר עם ברקוד הפוך חדש.

אם הגברה מחדש לא מצליחה, מעכבי PCR עשויים להיות נוכחים בדגימה, ובמקרה זה, לבצע ניקוי DNA מבוסס עמודות כדי להסיר מעכבי PCR. אחסן את 70 המיקרוליטר הנותרים של אמפליקון בחום של 20 מעלות צלזיוס. השלך את 20 המיקרוליטרים הנותרים של הפקד ללא תבנית, בהנחה שהוא לא הניב רצועה.

כדי ליצור את בריכת האמפליקון שלב שניים עד חמישה מיקרוליטרים מכל אמפליקון בצינור סטרילי אחד. אם הרצועה מהדגימה חלשה, הוסף פי שניים מהווליום ביחס לשאר הדגימות. לאחר מכן הסר את פריימרים ה-PCR באמצעות ערכה.

אם רלוונטי, שלב את מאגרי המגדילים ללא פריימר כדי ליצור את הספרייה הסופית. קבע את ריכוז ה-DNA של הספרייה באמצעות ספקטרופוטומטר או מערכת פלואורומטרית. לבסוף, יש לדלל את הדגימות לשתי ננו-מולריות, ולשלוח אותן לריצוף.

מידע מפורט על ניתוח רצף מסופק במסמך הנלווה. DNA ו-RNA באיכות גבוהה בודדו וה-DNA שימש כתבנית להגברת PCR של אזור הגן 16S rRNA V4 כמתואר בסרטון זה. אלקטרופורזה של ג'ל שימשה כדי לאשר את נוכחותה של פס יחיד בסביבות 380 זוגות בסיסים בכל דגימה שהוגברה עם תבנית.

לפקדי ה-no template הפועלים במקביל לאותו זוג פריימר לא הייתה להקה. לאחר מכן שולבו אמפליקוני ה-PCR לצינור יחיד, כומתו ודוללו עוד יותר לפני הריצוף. מוצגת כאן תרשים עמודות מייצג של ציוני איכות הרצף בכל מיקום של הקריאה.

זה נורמלי שאיכות הרצף יורדת לאחר 200 זוגות בסיסים. אבל ציון האיכות הממוצע צריך להישאר מעל 30. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד DNA ו-RNA ממקלונים באמצעות מיצוי מבוסס פנול כלורופורם, להגביר את אזור V4 של גן ה-RNA הריבוזומלי 16SR, ולהכין ספרייה לריצוף בתפוקה גבוהה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להקפיד מאוד על מניעת זיהום במהלך איסוף דגימות, מיצוי חומצות גרעין והגברת PCR. אל תשכח שעבודה עם פנול כלורופורם עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד אמצעי זהירות כגון עבודה במכסה מנוע מאוורר ולבישת כפפות אטומות, משקפי בטיחות עם מגני צד וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.