נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים
9 באפריל 2016
נוהל תכנון הניסויים המוצג כאן מאפשר להעריך פלוקולנטים שונים מבחינת יכולתם לצבור חלקיקים מפוזרים בתמציות צמחים, ובכך להפחית את העכירות ואת עלויות העיבוד במורד הזרם.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות פלוקולנטים (חומרי פלוקולציה) שיכולים לשפר את הסרת חלקיקים מפוזרים מתוך תמציות צמחים. דבר זה מושג באמצעות תכנון ניסויי לזיהוי הפולימרים והפרמטרים היעילים ביותר השולטים באגרגציה של חלקיקים מפוזרים אלו. השלב השני מגדיר את זרימת העבודה, התואמת את פעולות היחידה המשמשות ביישום בקנה מידה גדול.
בשלב הבא, תכיני תמציות עלים עבור פלוקולנטים תחת תנאים שונים, אשר ינותחו במטרה למדוד את העכירות ואת התשוא של המוצר. התוצאות מציגות את תנאי הפלוקולציה והפולימרים האופטימליים על בסיס הערכת מודל של תכנון ניסויים, אותו נקצר כ-DoE. היתרון העיקרי של טכניקה זו בהשוואה להבהרה מסורתית באמצעות סינון עומק בלבד, הוא שניתן להגדיל את קיבולת המסנן פי כמה, ובכך להפחית את עלויות התהליך הכוללות.
פלוקולציה (התגבשות) יכולה להגדיל את הקוטר האפקטיבי של החלקיקים ולהקל על הסרתם באמצעות סרטיפוגציה או סינון. לכן, יש לזהות תחילה את פרמטרי התהליך הסביבתיים הרלוונטיים להליך הפלוקולציה. בדרך כלל, קיימים מספר פרמטרים כאלה.
לפיכך, גישת DoE היא הולמת בהינתן המחסור במודלים מכניסטיים. ה-DoE מוגדר על ידי בחירת פרמטרים המבוססים על נתוני ספרות וידע קודם. פרמטרים טיפוסיים כוללים את זמן האינקובציה, כמו גם את סוג הפולימר והריכוז שלו.
התוצאות הניסיוניות המשמשות להערכת יעילות הפלוקולציה, כגון יכולת סינון (filtratability), מוגדרות אף הן לפני הניסוי. מידע זה מוזן לאחר מכן למודל DoE המתאים למספר הגורמים שייבחנו ולרמת הידע שנצברה כבר על המערכת. פותח תזרים עבודה המקיף את כל השלבים הרלוונטיים לפלוקולציה ולעיבוד של תמציות צמחים בקנה מידה מעבדתי.
נפח המנה (aliquot) צריך להיות קטן מספיק כדי לאפשר תפוקת דגימות גבוהה. ביצועי הציוד המעבדתי צריכים להיות תואמים לאלו של המכשירים בקנה מידה תעשייתי. הצמחים גודלים באופן המייצג את התהליך הסופי.
וכל הכלים והעזרים מוכנים לפני תחילת ניסויי המיצוי והפלוקולציה. תמיסות המלאי של הפלוקולנטים מוכנות בקפידה, תוך התחשבות בדילול מוקדם שבוצע על ידי היצרן. בחירה בריכוז מלאי זהה עבור כל הפלוקולנטים מפשטת את הפעולות הבאות של פיפטור ומפחיתה את הסבירות לטעויות.
מרכיבי הבאפר, ה-pH והמוליכות עבור כל תמיסת מלאי טרייה של פלוקולנט מוכנים כך שיתאימו לתנאים של התמציות. לוח הזמנים של ה-DoE מומר לסכימת פיפטינג המגדירה את נפחי תמיסות המלאי שיש להוסיף לדגימות תמצית הצמח. דגימות תמצית צמח מוכנות מעלי טבק שנאספו, תוך שימוש בבאפרים התואמים לתנאים שייבחנו ב-DoE.
בעוד התמצית נערבבת, מכינים מנות (aliquots) בהתאם לנפח שהוגדר מראש. פעולה זו תבטיח התפלגות הומוגנית של החלקיקים בכל הדגימות. לכל מנה מתווסף באפר מיצוי, כך שלכל דגימה יהיה אותו נפח לאחר הוספת תמיסת מקור של פלוקולנט.
נפח תמיסת המלאי שהוגדר ב-DoE מתווסף לדגימה באופן רצפי כפי שצוין בסדר ההרצות המגורבל. הפולימר מופץ באופן הומוגני בכל הדגימה על ידי ניעור המבחנה מיד לאחר הוספת הפולימר, דבר שיבטיח גם שהתוצאות של הפלוקולציה יהיו הדירות.
אך יש ליישם זאת ב-DoE. היווצרות פלוקים (Flocs) דורשת בדרך כלל זמן דגירה של 3 עד 30 דקות. היצמדות לזמני הדגירה שהוגדרו ב-DoE הכרחית להשגת תוצאות הדירות.
ניתן להשתמש במהירות השקיעה של הפלוקים או בעכירות של התסננים ובקיבולת הסינון כדי להעריך את ביצועי הפלוקולנט. חשוב גם לוודא שהפולימרים אינם מפריעים למוצרים כגון חלבונים. לאחר אישור איכות הנתונים, ניתן להעביר את המידע לתוכנת ה-DoE.
הנתונים הניסיוניים מנותחים באמצעות הכלים המובנים בתוכנת ה-DoE, כולל כלים לטרנספורמציה של נתונים, בחירת גורמים ובקרת איכות. בנוסף לשימוש בכלים אלו, המודל הסופי צריך להתאימו גם לחוקי הפיזיקה והתרמודינמיקה הבסיסיים. לאחר אישור איכות המודל, ניתן להשתמש בו כדי לחזות את התנאים האופטימליים לפלוקולציה.
על בסיס תחזיות המודל, ניתן לצמצם את מרחב התכנון לאזור הרלוונטי ביותר עבורו ניתן להקים DoE חדש, תוך חזרה על הפרוצדורה שתוארה קודם לכן. לאחר מכן, ניתן לאשש את התוצאות בקנה מידה של פיילוט או ייצור. במחקר מייצג זה, נבדקו ביצועיהם של 23 פלוקולנטים סינתטיים שונים וארבעה פלוקולנטים טבעיים לבחינת יכולתם לגרום לפלוקולציה של תמציות עלי טבק באמצעות גישת DoE.
תוך התחשבות בפרמטרים ספציפיים לפולימר, כגון ריכוז וסוג הפולימר, אך גם בפרמטרים של התהליך, כגון זמן הדגרה, טמפרטורה, pH של הבאפר ומוליכות. באמצעות סדרה של ארבעה תכנונים מקננים מסוג IV-optimal, שכללו סך הכל כ-200 מנות תמצית של 20 mL, מצאנו כי Polymin P היה הפלוקולנט היעיל ביותר עבור תמציות טבק בטווח pH של ארבע עד שמונה, כל עוד הטמפרטורה הייתה בין 4 ל-30 °C. זמן הדגרה של 15 דקות הספיק לפלוקולציה, אך היעילות פחתה במוליכויות הגבוהות מ-40 mS/cm.
עם זאת, גישת ה-DoE הראתה כי Catiofast VSH השלים את Polymin P, והשיג פלוקולציה יעילה במוליכויות הגבוהות מ-40 mS per cm. כאשר פלוקולנטים אלו הוכנסו לתהליך העיבוד של תמציות טבק (downstream processing), קיבולת מסנני העומק שהופעלו עלתה פי 3.2 עד 5.7, ובכך הופחתה עלות המוצר לשלב זה בהתאם. אישרנו כי הפלוקולנטים לא הפחיתו את התשואה של חלבוני מטרה, כולל נוגדן מונוקלונלי, חלבון פלואורסצנטי, לקטין ומועמדים שונים לוואקצינים.
תנאי הפלוקולציה האופטימליים אושרו גם במיכל בקנה מידה פיילוטי של 100 L. תוצאות ה-DoE הועברו בהצלחה גם לתמציות טבק שהוכנו באמצעות מכבש ברגים במקום הומוגניזטור מבוסס להבים, מה שמדגיש עד כמה המידע שנאסף הוא בעל יישום רחב. כמו כן, התאמנו את השיטה לבדיקת שילובים של חומרי פלוקולציה שפעלו באותה מידה של יעילות.
לאחר צפייה בסרטון זה, עליך להבין כיצד להקים ניסויי פלוקולציה עבור תמציות צמחים באמצעות גישת DoE.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה של תכנון ניסויים להערכת חומרים פלוקולנטים שונים ואת יעילותם בצבירה של חלקיקים מפוזרים בתמציות צמחים. המטרה היא להפחית את העכירות ולשפר את היעילות של תהליכי עיבוד המשך.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביוטכנולוגיה
- מדעי הסביבה
- הנדסת תהליכים
רקע
- פלוקולנטים (Flocculants) הם חומרים המעודדים התגבשות של חלקיקים.
- הפחתת העכירות היא קריטית לשיפור האיכות של תמציות צמחים.
- שיטות מסורתיות של הבהרה עשויות להיות לא יעילות ויקרות.
- תכנון ניסויים (DoE) מאפשר הערכה שיטתית של משתנים מרובים.
מטרת המחקר
- זיהוי פלוקולנטים יעילים להסרת חלקיקים מפוזרים מתמציות צמחים.
- אופטימיזציה של התנאים לפלוקולציה.
- הערכת הכדאיות הכלכלית של השיטה המוצעת בהשוואה לטכניקות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון ניסויי להערכת פלוקולנטים שונים.
- הכנת תמציות עלים תחת תנאים שונים.
- מדידת עכירות והשבת מוצר.
- ניתוח תוצאות באמצעות מודל תכנון ניסויי.
תוצאים עיקריים
- זיהוי תנאי הפלוקולציה האופטימליים.
- הערכה של הפולימרים היעילים ביותר עבור אגרגציה.
- הדגמה של קיבולת סינון מוגברת בהשוואה לסינון עומק.
- הפחתה בעלויות העיבוד הכוללות באמצעות שיפור היעילות.
מסקנות
- גישת תכנון הניסויים (design-of-experiments) מזהה ביעילות פלוקולנטים מתאימים.
- תנאים אופטימליים יכולים לשפר באופן משמעותי את תהליך ההבהרה.
- שיטה זו מציעה חלופה חסכונית לטכניקות סינון מסורתיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
הבהרה של תמציות צמחים היא צוואר בקבוק קריטי בעיבוד במורד התהליך (downstream processing) עבור ביולוגים המופקים מצמחים, כאשר עכירות גבוהה מעלה את עלויות הסינון והצנטריפוגציה ומקטינה את התפוקה. גישה זו של תכנון ניסויים (DoE) מאפשרת סריקה אמפירית מהירה של פלוקולנטים כדי לייעל את ההפרדה בין מוצק לנוזל ללא הסתמכות על מודלים מכניסטיים, ובכך תומכת ישירות בהפחתת עלויות וב khả năng הרחבה (scalability) של התהליך בייצור ביו-פרמצבטי. באמצעות זיהוי שילובים חסונים של פולימרים ותנאים השומרים על התשואת של המוצר, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בפעולות יחידה של הבהרה ומקלה על העברת טכנולוגיה (tech transfer) מקנה המעבדה לקנה מידה פיילוטי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה אמפירית של מנגנוני פלוקולציה במטריצות צמחיות מורכבות שבהן מודלים תיאורטיים אינם זמינים.
- ערך תפעולי: תומך בסריקה מהירה של ספריות פולימרים בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית, במטרה להפחית סיכונים באסטרטגיות הבהרה בשלבים מוקדמים של פיתוח התהליך.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של עכירות ויכולת סינון לצורך דירוג ביצועי פלוקולנטים על פני מספר משתני תהליך.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הערכת הפלוקולציה באמצעות תוכניות פיפטאג המבוססות על DoE, דבר המשפר את השחזוריות ומפחית שונות התלויה במפעיל.
- ערך אסטרטגי: מזהה זוגות פלוקולנטים משלימים (למשל, Polymin P ו-Catiofast VSH) המרחיבים את טווחי המוליכות התפעוליים, ובכך מגדילים את הגמישות של הפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על התאוששות חלבון המטרה (כולל נוגדנים מונוקלונליים ומועמדים לוואקסים) תחת תנאי פלוקולציה אופטימליים, ובכך מבטיח את שלמות המוצר.
- ערך תפעולי: מדגים העברה מוצלחת של תנאים שעברו אופטימיזציה בשיטת DoE מקנה מידה של מעבדה (20 mL) לסדרות בקנה מידה פיילוט (100 L), ובכך תומך בהעברה טכנולוגית ניתנת להרחבה (scalable tech transfer).
- ערך אסטרטגי: מפחית את תדירות החלפת מסנני העומק על ידי הגדלת הקיבולת פי 3.2 עד 5.7, מה שמוריד את עלות המוצרים ומשפר את רציפות התהליך.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטה זו משתלבת בשלב ההבהרה (clarification) של תהליך ייצור תרופות ביולוגיות ממקור צמחי, ומגשרת בין הכנת התמצית הראשונית לבין סינון עומק (depth filtration) על ידי שיפור איכות זרם ההזנה והארכת זמני הפעולה של המסנן.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות הנוגעות לאינטראקציות בין פולימרים לחלקיקים בתמציות מורכבות, באמצעות שינוי שיטתי של pH, מוליכות, טמפרטורה וזמן אינקובציה.
- סריקה: מספק פלטיים מוכנים לבדיקה, כולל הפחתה בעכירות וצלילות התסנין, המאפשרים השוואה ראש בראש של יעילות הפלוקולנט תחת תנאים מוגדרים.
- אנליטיקה: מספקת תחזיות מבוססות-מודל לתנאי פלוקולציה אופטימליים, המאפשרות לצוותים לצמצם את מרחב התכנון ולתעדף ניסויי אישור.
- מחקר תרגומי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לייצור פרה-קליני, על ידי תיקוף לכך שהפלוקולציה אינה פוגעת ביבול או באיכות של הביומולקולות המטרה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מסגרת DoE הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למיני צמחים, רקמות או סוגי תמציות אחרים, ובכך מקדם סטנדרטיזציה בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביעילות ההבהרה על ידי קישור בחירת הפלוקולנט לתוצאות תהליך מדידות, כגון קיבולת הסינון והעכירות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות זמני דגירה סטנדרטיים, הוספה מבוקרת של ריאגנטים וביצוע ניסויי מונחה DoE.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מקסום ניצול תשתית הסינון הקיימת וצמצום נטל החומרים המתכלים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם-סיכון של מועמדים מ nguồn צמחי על ידי מזעור צווארי בקבוק ושונות בתהליכי העיבוד במורד הזרם (downstream processing).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון ניסויים (DoE), מדידת עכירות וטיפול בפולימרים.
- תלוי בגישה לתוכנת DoE, לצנטריפוגות או למערכות סינון, ולכלים אנליטיים למדידת גודל חלקיקים או עכירות.
- מחייב תיאום בין-צוותי בין הנדסת ביו-תהליכים לפיתוח אנליטי לצורך הגדרה עקבית של פרמטרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר בין מיני צמחים, סוגי רקמות או שיטות מיצוי (לדוגמה, הומוגניזציה באמצעות להב לעומת מכבש בורג).
- מוגבל על ידי האופי האמפירי של ה-DoE, המזהה תנאים אופטימליים בתוך הטווחים שנבדקו אך אינו מבצע אקסטרפולציה מעבר למרחב התכנון ללא תיקוף מחדש.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
1:19
Develop an Adequate Experimental Strategy
2:34
Prepare the Flocculation Experiments
4:35
Flocculate the Plant Extracts with Different Polymers
6:17
Evaluate the DoE
7:36
Results
10:14
Conclusions
7:10
Improve the Model and Verify the Predictive Power
0:00
Title
