באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון אור פיתוח תמונה דג הזברה העין
10 באפריל 2016
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור היא כלי מצוין להדמיית התפתחות עוברית. הוא מאפשר הקלטה של סרטוני זמן-lapse ארוכים של עוברים חיים בתנאים כמעט פיזיולוגיים. אנו מדגימים את היישום שלו להדמיית התפתחות עין דג הזברה על פני קני מידה רחבים מרחביים-זמניים ומציגים צינור לאיחוי ודה-קונבולוציה של מערכי נתונים מרובי תצוגות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ניסיוני זה היא לדמות את התפתחות העין של עובר דג הזברה במיקרוסקופ גיליון האור ולעבד את מערך הנתונים הרב-תצוגה שנרכש בפיגי באמצעות תוסף יישום השחזור הרב-תצוגה. שיטה זו יכולה לעזור לך להבין אירועים מורפוגנטיים בהתפתחות בעלי חיים. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא שניתן לצפות באירועים מורפוגנטיים בעובר המתפתח בטקט עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.
היתרון העיקרי של מיקרוסקופ גיליון אור הוא הפוטוטוקסיות הנמוכה של השיטה, תזמון הרכישה המהיר שבעזרתו ניתן לצלם את הדגימה ושניתן לדמות את הדגימה מזוויות שונות, מה שנקרא תצוגות. לכידת הדגימה מתצוגות שונות מאפשרת לנו להתגבר על השפלה של האות וציר ההגדרה. לאחר מכן ניתן להשתמש בתמונות השונות הללו ולרשום אותן באמצעות מיקרוספירות פלואורסצנטיות סביב הדגימה.
אנו יכולים לשחזר את הנפח התלת מימדי המגיע לרזולוציה האיזוטרופית. למרות שאנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ פלורנסנטי של יריעות אור להתפתחות העיניים של דג הזברה, ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לענות על שאלות שונות בביולוגיה התפתחותית ובמדעי המוח באמצעות אורגניזמים מודלים שונים. כדי להתחיל, הברג את מטרת הזיהוי למיקרוסקופ תוך שמירה על מטרות התאורה מכוסות.
לאחר מכן, שחררו את המטרות והחליקו בזהירות את תא הדגימה לתוך המיקרוסקופ. אבטח את החדר על ידי הידוק הבורג. לאחר מכן, חבר את בדיקת הטמפרטורה ואת בלוק הפלטייר למיקרוסקופ.
שני הצינורות המפיצים את נוזל הקירור עבור בלוק הפלטייר תואמים לשני המחברים ויכולים לעבוד בכל כיוון. לאחר מכן, השתמש במזרק כדי להעמיס את החדר דרך המזרק בתמיסה עד לקצה העליון של חלונות החדר ובדוק אם יש נזילות. כעת, הפעילו את המיקרוסקופ, המחשב והדגירה.
הפעל את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ והגדר את טמפרטורת הדגירה ל-28.5 מעלות צלזיוס. בזמן שהטמפרטורה דורשת שעה, הכינו את הדגימה. התחל בהכנת האגרוז.
ממיסים מוכן של מיליליטר אחד של נקודת התכה נמוכה של 1% ב-E שלוש בינוניות ב-70 מעלות צלזיוס. לאחר כ-15 דקות, העבירו 600 מיקרוליטר של אגרוז מותך לתוך צינור טרי של 1.5 מיליליטר והוסיפו 250 מיקרוליטר של E שלושה בינוניים, 50 מיקרוליטר של 0.4%MS 222 ו-25 מיקרוליטר של תמיסת מלאי חרוזים פלואורסצנטיים מערבולת. הנח את הצינור בגוש חימום בטמפרטורה של כ-39 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאגרוז להתקרב לנקודת הג'ל שלו.
לאחר מכן, דחוף את הבוכנות עם הטפלון כלפי מטה לתחתית נימי זכוכית בקוטר פנימי של מילימטר אחד. הכן חמישה כאלה. כעת, מערבל לזמן קצר את תערובת האגרוז ולאחר מכן העביר לתוכה חמישה עוברים עם כמות מינימלית של נוזלים.
לאחר מכן, הכנס נימי ושאף תחילה ראש עובר אחד. הראש חייב להיכנס לפני הזנב ולא יכולות להיות בועות אוויר. צייר מספיק תמיסה כך שיהיה כשני סנטימטרים של אגרוז מעל העובר וסנטימטר אחד של אגרוז מתחתיו.
צייר עובר אחד לכל נימים לפני שתמשיך. שלב זה דורש קצת תרגול כדי לשלוט בו. התכוננו לכך באמצעות עוברים חסרי ערך.
כאשר האגרוז מתמצק לחלוטין, אחסן את הדגימות במדיום E שלוש על ידי החדרת הנימים לדופן עם פלסטלינה עם הפתח התחתון בתמיסה. כעת הרכיבו את מחזיק המדגם. ראשית, הכנס שני שרוולי פלסטיק בגודל הנכון זה מול זה לגבעול.
החריצים בשרוולים חייבים לפנות כלפי חוץ. לאחר מכן, חבר מהדק בורג. והכנס את הנימים דרך המחזיק עד שרצועת הצבע השחורה נראית בצד השני.
הימנע מלגעת בבוכנה. ואז הדק את בורג המהדק. לאחר מכן, דחף סנטימטר של אגרוז החוצה מהנימים וחתוך אותו.
לאחר מכן הכנס את הגבעול לדיסק מחזיק הדגימה. לפני טעינת הדיסק לדוגמה, בדוק שהשלב נמצא במיקום העליון ביותר בתוכנת הבקרה. לאחר מכן, השתמש במסילות מנחות כדי להחליק את המחזיק ולדגום מטה לתוך המיקרוסקופ.
כעת, דמיין את הדגימה שנבחרה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עיבוד הנתונים נעשה בפיג'י. זוהי הפצה של ImageJ.
לפני שמתחילים, יש לעדכן את Figi. שמור את ערכת נתוני התמונה שנרכשה בתיקיה אחת. קבצי הביניים של עיבוד התמונה יישמרו באותה תיקיה.
כעת, התחל את יישום השחזור של תצוגות מרובות. לאחר מכן, הגדר סל נתונים חדש. בחר באפשרות Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats וצור שם לקובץ נתוני הפלט.
לאחר מכן בחר את קובץ ה-CZI הראשון של ערכת הנתונים. המטא נתונים ייטענו אוטומטית. במטא נתונים של התמונה, בדוק שוב שמספר הזוויות, הערוצים, התאורות וגודל הווקסל מוגדרים כולם כהלכה.
בלחיצה על אישור, נפתח חלון יומן, חלון סייר הגדרת התצוגה וחלון קונסולה. סייר הגדרת התצוגה מספק ממשק ידידותי למשתמש. בחר את הקבצים שצריך לעבד ולחץ על לחצן העכבר הימני.
ייפתח חלון חדש המציג את שלבי העיבוד השונים בעת ביצועם. בפינה השמאלית העליונה נמצאים כפתורי המידע והשמירה. Info מציג סיכום של תוכן קובץ הנתונים שנשמר ולחיצה על שמירה תשמור את תוצאות העיבוד.
אחרת, התוכנית אינה שומרת את תוצאות שלבי העיבוד. כדי לשמור מחדש את ערכת הנתונים כולה, ראשית, בחר את כל הקבצים על-ידי הקשה על Ctrl+A ושימוש בלחיצה ימנית. לאחר מכן בחר Resave Dataset ו- As HDF5.
לאחר מכן יש לסמן אישור של פעולת השמירה מחדש. לאחר מספר דקות, עבור כל נקודת זמן, התוכנית תציין מתי השמירה מחדש הושלמה. לאחר מכן, המשך בזיהוי נקודות עניין בנתונים.
בחר את כל נקודות הזמן על-ידי הקשה על Ctrl+A ולחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני. כדי לבחור, זהה נקודות עניין. מבין האפשרויות, בחר הפרש של גאוס.
ובחר, למטה תמונות לדוגמה לפני הפילוח. בחלון הבא, בחר את הגדרות הזיהוי. מבין אפשרויות הלוקליזציה של תת-פיקסלים, בחר התאמה ריבועית תלת-ממדית.
לאחר מכן, במפרט נקודת העניין, בחר אינטראקטיבי. לאפשרות XY לדוגמה למטה, בחר התאם רזולוציית Z. ועבור דגימה למטה Z, בחר 1x.
לאחר מכן, בצע את הפעולה על ידי בחירת אפשרות המחשוב ב-CPU Java. מהחלון המוקפץ, בחר תצוגה אחת לבדיקת הפרמטרים. לאחר טעינת התצוגה, התאם את הבהירות והניגודיות על ידי לחיצה על Ctrl+Shift+C במקלדת.
כמו כן, לזיהוי חרוזים, החלף את האפשרות חפש ירוק מקסימה. כעת התבונן בסגמנטציה כטבעות ירוקות סביב הזיהוי. התאם את ערכי הפרש הגאוס עבור פרמטרי סיגמא אחד וסף כדי לפלח בצורה אופטימלית את החרוזים עם המספר המינימלי של תוצאות חיוביות כוזבות.
יש לזהות כל חרוז פעם אחת בלבד. לאחר קביעת הפרמטרים האופטימליים, לחץ על סיום. לאחר שהמחשב נטען, כל תצוגה בודדת של נקודת הזמן ומפלחת את החרוזים, התוכנה מוציאה קובץ יומן עם מספר החרוזים שהיא זיהתה בכל צפייה.
צריכים להיות בין 600 לכמה אלפי חרוזים לכל צפייה. אחרת, יש לשנות את פרמטרי הזיהוי. זהו תהליך מסובך.
פירמידת הזיהוי לעיתים רחוקות מדויקת בניסיון הראשון והאיפוסים יכולים להשתנות בין נקודות הזמן של סרט אחד. הרפיית הטרי תזהה את כל החרוזים האמיתיים ותאפשר יותר תוצאות חיוביות כוזבות יכולה לעזור. אם שום שילוב של הפירמידה לא עובד, אז יש לרכוש מערך נתונים חדש באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים שונים.
כעת המשך ברישום הזיהויים וביצוע דה-קונבולוציה מרובת תצוגות מהמחסנית. LSFM היא שיטה אידיאלית להדמיית תהליכי התפתחות בקנה מידה מרובה ממבנים בין-תאיים לתאים ורקמות שלמות לפרקי זמן ארוכים. ניתן ללכוד אירועים בין-תאיים מהירים מאוד ברזולוציה גבוהה, כגון צמיחה של מיקרו-צינורות בתאי אב עצביים.
מסרט צפייה יחיד, כימות צמיחת המיקרו-צינוריות אפשרי. ניתן לעקוב אחר מבנים תוך-תאיים במשך שעות רבות כגון הצנטרוזום בתוך תאי גנגליון הרשתית. ניתן לחלץ התנהגות של תא בודד מתמונות רקמה שלמות כגון מיקום הטרנס של תא גנגליון על פני הרשתית.
דה-קונבולוציה מרובת תצוגות יוצרת מחסנית Z איזוטרופית אחת על ידי שילוב של מספר תצוגות שונות באמצעות פונקציית התפשטות הנקודה. זה מספק תמונות משופרות בהרבה בהשוואה לתצוגות בודדות או מיזוגים ממוצעים משוקללים. לדוגמה, ניתן ללמוד את הפיכת השלפוחית האופטית לכוס אופטית מפרוסות אופטיות בכיוונים שונים באמצעות מערך הנתונים המוצג.
בנוסף, ניכרת איכות התמונה הטובה הכוללת, אפילו עמוק בתוך העובר. כגון בעת צפייה במורפוגנזה של אופטית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב תמונה עוברי דג זברה במיקרוסקופ גיליון אור.
וכיצד לעבד מערכי נתונים מרובי תצוגות בפיג'י. לאחר השליטה, ייקח כשעתיים להתחיל ניסוי זמן-lapse במיקרוסקופ גיליון אור. ניתוח הנתונים הבא ייקח הרבה יותר זמן.
זה עשוי להיות מועיל להשתמש באשכול מחשבים למשימה זו. טיפים מעשיים יותר, עצות לפתרון בעיות וקישורים למשאבים אחרים ניתן למצוא בפרוטוקול הטקסט. חייבת להיות מספיק קיבולת אחסון ותוכנית צינור ברור לעיבוד נתונים זמינה לפני הניסוי.
אם יש לך בעיות, שאלות או בקשות עתידיות, עיין באתר התכונות המתאים או בבעיות הקבצים במאגרי github המתאימים.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקול להדמיית התפתחות עיניים של דגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של עוברים חיים, ומאפשרת לחוקרים לצפות באירועים מורפוגנטיים בזמן אמת.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור מספקת רעילות צילום נמוכה זמני רכישה מהירים.
- שיטה זו מאפשרת הדמיה מזוויות מרובות כדי לשפר את איכות הנתונים.
- היא חלה על אורגניזמים מודליים שונים מעבר לדגי זברה.
מטרת המחקר
- להדגים ולנתח את התפתחות העיניים של עוברי דגי זברה.
- להדגים צינור לעיבוד ערכות נתונים מרובות-מבטים.
- להקל על ההבנה של תהליכים התפתחותיים בעוברים.
שיטות ששימשו
- הכנת עוברי דגי זברה באגרוז לצורך הדמיה.
- שימוש במיקרוסקופ גיליון אור לצילום תמונות.
- עיבוד נתונים באמצעות Figi ויישום השחזור מרובה-מבטים.
- רישום תמונות באמצעות ספירות פלואורסצנטיות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של התפתחות עיניים של דגי זברה ברזולוציה מרחבית זמנית גבוהה.
- שחזור של נפחים תלת-ממדיים מערכות נתונים מרובות-מבטים.
- הדגמה של רבגוניות השיטה עבור שאלות ביולוגיה התפתחותית שונות.
מסקנות
- מיקרוסקופיה של גיליון אור היא כלי רב עוצמה לחקר התפתחות עוברים.
- הפרוטוקול יכול להיות מותאם לאורגניזמים מודליים שונים ושאלות מחקר.
- שיטה זו משפרת את ההבנה שלנו של אירועים מורפוגנטיים בעוברים חיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Light sheet fluorescence microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of live zebrafish embryos, supporting real-time observation of morphogenetic events in developmental biology. This capability enhances target validation by providing quantitative, multi-scale phenotypic data from intact organisms, reducing reliance on endpoint assays. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by allowing longitudinal tracking of cellular behaviors and tissue dynamics relevant to disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of morphogenetic processes in developing tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to phenotypic outcomes in vivo.
- Predictive Value: Improves confidence in target relevance by capturing dynamic, spatially resolved biological responses over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multi-view datasets suitable for high-content analysis of developmental phenotypes.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible imaging workflows using commercial light sheet microscopes and open-source processing pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system insights by imaging conserved developmental pathways across model organisms.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of intracellular structures and cell behaviors over extended periods, supporting preclinical validation of target modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by enabling longitudinal assessment of therapeutic effects on tissue morphogenesis and cellular dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening in vertebrate models, with outputs feeding into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through high-resolution, time-lapse imaging of developing tissues.
- Screening: Enables assay readiness via standardized embryo mounting, multi-view acquisition, and reproducible data processing using Fiji-based plugins.
- Analytics: Generates quantitative 3D reconstructions and isotropic voxel data that facilitate comparison of structural and dynamic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by imaging conserved processes such as optic cup formation and retinal ganglion cell migration relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging platform adaptable to diverse developmental biology and neuroscience questions beyond zebrafish eye development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in developmental phenotypes through direct visualization.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined mounting, imaging, and multiview registration protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic liabilities, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing longitudinal, quantitative readouts on target modulation in intact developing systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, agarose embedding, and fluorescent sample preparation.
- Dependent on access to commercial light sheet microscopes and computational resources for terabyte-scale multiview data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, file naming, and metadata handling for reproducible multi-view reconstruction.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to other model organisms or tissue types due to variations in size, opacity, and developmental timing.
- Limited by storage and processing demands; requires advance planning for data management and pipeline scalability.
