חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא לחקור את תגובת הרעב המוקדמת של Dictyostelium discoideum התלויה ב-Coronin-A. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי מסלולי אותים וגורמים המעורבים בהתפתחות המוקדמת של Dictyostelium discoideum. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל שלה לספק כלי לסריקה אוטומטית ובספיקות גבוהה (high-throughput) של גורמים מעודדי התפתחות וחלבונים המעורבים באותות התפתחותיים מוקדמים.

באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקלו בקשיים בשל משתנים מרובים הגלומים במדידה, כגון צפיפות תאים, זמן היצמדות וזמן פיתוח. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תאי DH1.10 או תאים חסרי corA בבקבוע ארלנמאייר המכיל מצע HL-5, בטמפרטורה של 22 °C, באינקובטור רוטט במהירות של 160 rpm. שמרו על צפיפות תאים שבין 1×10⁴ ל-2×10⁶ תאים למילליליטר.

כדי לבחון אגרגציה של תאים, קצרו 10 עד 50 milliliters של תאי DH1.10 הגדלים בשלב לוגריתמי (log-phase) או תאים חסרי corA שפותחו על רקע DH1.10. סובבו אותם בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים ב-BSS.

לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, זרעו את התאים בפלטה בעלת 24 בארות. אפשרו להם להיצמד למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 degrees Celsuis ב-BSS.

לאחר מכן, הדמיאו את אגרגציית התאים באמצעות מיקרוסקופיה של צילומי רצף (time-lapse microscopy), וצלמו תמונות בכל 135 seconds. כדי לבחון את השפעת פולסי cyclic AMP המוחלים מבחוץ על התפתחותם של תאי DH1.10, או תאי DH1.10 חסרי corA, קצרו 10 עד 50 milliliters של התאים וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים ב-BSS.

ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים לצפיפות של 1*10⁷ תאים ל-milliliter ב-BSS. לאחר מכן, נערו את התרביות בטמפרטורה של 22 °C למשך שעתיים ב-160 rpm לפני השמנת הפולסים.

בשלב הבא, החילו פולסים של cyclic AMP באמצעות משאבה פריסטלטית המופעלת על ידי טיימר. תכננו את המשאבה כך שתספק פולס של חמש שניות של cyclic AMP בכל שש דקות וחצי, למשך תקופה של חמש שעות. שלב קריטי הוא לוודא שקצה הזרקת ה-cyclic AMP אינו טבול באופן רציף בתמיסה, אלא נטבל רק באופן מחזורי בגלים הנוצרים על ידי השייקר.

לאחר יישום של cyclic AMP, ספרו את התאים שוב באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, זרעו את התאים בפלטה בעלת 24 באריים והמתינו שעה אחת להצמדתם ב-BSS. לאחר 16 שעות, הדמינו את אגרגציית התאים בטמפרטורה של 22 degrees Celsius, באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר עם עדשה של five x.

בנוהל זה, הכין מצע מותנה (conditioned medium) טרי, על ידי איסוף תאי DH1.10 או תאי DH1.10 חסרי corA בשלב הלוגריטמי, מתרביות הננערות במצע HL5, בטמפרטורה של 22 °C. סבב את התאים בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטוף אותם שלוש פעמים ב-PBM.

לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (hemocytometer). לאחר מכן, השביחו אותם שוב ב-PBM בריכוז של 1x10⁷ תאים למל', ונערה אותם במשך 20 שעות בטמפרטורה של 22 °C במהירות של 110 rpm. בשלב הבא, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g למשך שלוש דקות, ולאחר מכן אספו את המצע המותנה (conditioned medium). לאחר מכן, הבהירו את המצע באמצעות צנטריפוגה במהירות של 8,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר מכן, סננו את המצע המותנה דרך מסנן של 0.45 micrometer ומהלו אותו פי שלושה ב-PBM. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, זרעו אותם בפלטה בעלת 24 בארות, והמתינו שעה אחת להיצמדות בטמפרטורה של 22 degrees Celsius. לאחר מכן, החליפו את הנוזל שמעל התאים במצע מותנה שהוכן מראש.

לאחר 16 שעות, הדמיעו את התקבצות התאים באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר תוך שימוש בעדשה עם הגדלה של five x. כאן, תאים החסרים Coronin-A מראים פגם בהתפתחות המוקדמת, ולא היו מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווים את השלב הראשוני במחזור ההתפתחותי של Dictyostelium discoideum. בדמות זו, תאי Wild type וגנטיביים ותאים חסרי corA נשטפו והורעבו למשך שעתיים לפני שקיבלו פולסים של 15 animal or cyclic AMP, עם או בלי, מדי שש וחצי דקות למשך חמש שעות בתליה.

יישום של פולסים חיצוניים של cyclic AMP השחזר באופן מלא את הפנוטיפ של סוג הפרא (Wild type). באיור זה, תאים של סוג הפרא ותאים חסרי corA בצמיחה מעריכית, נשטפו ב-PBM, נזרעו לפלטות רב-בארים, והודגרו במצע מותנה שהתקבל מתאי סוג פרא או מתאי corA-חסרים המצויים ברעב. התמונות צולמו 16 שעות לאחר זריעת התאים.

תאי *Dictyostelium discoideum* חסרי corA היו מסוגלים להפיק את כל הגורמים הדרושים להשראה התפתחותית, אך לא היו מסוגלים להגיב להם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך 20 שעות, כולל זמן הדגירה, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי עבור זנים שונים יידרש התאמה של מספר משתנים בבדיקה, כגון צפיפות תאים, זמן ההיצמדות וזמן ההתפתחות.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע פרקציונציה ביוכימית ואנליזה פרוטאומיקה לאחר מכן, כדי לזהות גורמים המעורבים בתגובת הרעב המוקדמת של Dictyostelium discoideum. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה למצופה הבנה טובה של האופן שבו ניתן להניע התפתחות מוקדמת ב-Dictyostelium discoideum בתנאי טבילה, באמצעות מצע מותנה או פולסים של cyclic AMP.