18 ביוני 2016
האמבה החברתית Dictyostelium discoideum עוברת מעבר התפתחותי לאורגניזם רב-תאי כאשר היא מורעבת. החלבון המשומר האבולוציוני קורונין A ממלא תפקיד מכריע בהתחלת ההתפתחות. באמצעות מבחני צבירה כשיטה העיקרית שלנו, אנו שואפים להבהיר את תפקידו של קורונין A בהתפתחות מוקדמת.
המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה, היא לחקור את תגובת הרעב המוקדמת התלויה בקורונין-A של Dictyostelium discoideum. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי מסלולי איתות וגורמים המעורבים בהתפתחות המוקדמת של Dictyostelium discoideum. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שיש לה פוטנציאל לספק כלי לסינון אוטומטי ותפוקה גבוהה של גורמים מעוררי התפתחות וחלבונים המעורבים באיתות התפתחותי מוקדם.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו, יתקשו בגלל משתנים מרובים הטבועים בבדיקה, כגון צפיפות תאים, זמן היצמדות וזמן התפתחות. כדי להתחיל בהליך זה, גדל תאי DH1.10 או תאים חסרי corA בבקבוק ארלנמאייר המכיל מדיום HL-5, בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס, באינקובטור רועד ב-160 סל"ד. שמור על התאים בצפיפות בין 1 כפול 10 לארבעה, ופעמיים 10 לששת התאים למיליליטר.
כדי לבחון צבירת תאים, קצרו 10 עד 50 מיליליטר של תאי DH1.10 הגדלים בשלב לוג או תאים חסרי corA שנוצרו ברקע DH1.10. צנטריפוגה אותם למשך שלוש דקות ב 400 פעמים גרם. ואז התאים היו פעמיים ב-BSS.
לאחר מכן ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, צלחו את התאים בצלחת באר 24. אפשר להם להיצמד למשך שעה אחת ב-22 מעלות צלזיוס ב-BSS.
לאחר מכן, דמיין את צבירת התאים באמצעות מיקרוסקופ דולג זמן, וצלם תמונות כל 135 שניות. כדי לבחון את ההשפעה של פולסי ה-AMP המחזוריים המופעלים חיצונית על התפתחות תאי DH1.10, או תאים חסרי DH1.10 corA, קצרו 10 עד 50 מיליליטר מהתאים וצנטריפוגה אותם למשך שלוש דקות ב-400 פעמים גרם. לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים ב-BSS.
ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים לצפיפות של 1 כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר ב-BSS. לאחר מכן, יש לנער את התרביות ב-22 מעלות צלזיוס למשך שעתיים ב-160 סל"ד לפני הפעלת פולסים.
לאחר מכן, החל פולסים מחזוריים של AMP באמצעות משאבה פריסטלטית הנשלטת על ידי טיימר. תכנת את המשאבה לספק פעימה של חמש שניות של AMP מחזורי כל שש וחצי דקות במשך תקופה של חמש שעות. צעד קריטי הוא להבטיח שקצה הזרקת ה-AMP המחזורית אינו שקוע ברציפות בתמיסה, אלא רק שקוע מעת לעת בגלים שנוצרים על ידי השייקר.
לאחר יישום AMP מחזורי, ספרו שוב את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, צלחו את התאים בצלחת באר 24 והניחו להם להיצמד למשך שעה ב-BSS. לאחר 16 שעות, דמיין את צבירת התאים ב-22 מעלות צלזיוס, עם מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות סובייקטיבי פי חמישה.
בהליך זה, הכינו מדיום מותנה טרי, על ידי איסוף תאי DH1.10 שלב לוג או תאים חסרי DH1.10 corA מתרביות הרעידות עם מדיום HL5, בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של התאים למשך שלוש דקות ב -400 פעמים גרם. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים ב- PBM.
לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, לאחר מכן, השעו אותם מחדש ב-PBM בצפיפות של 1 כפול 10 לשבעת התאים למיליליטר ונערו אותם במשך 20 שעות ב-22 מעלות צלזיוס ב-110 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-400 פעמים גרם למשך שלוש דקות, ולאחר מכן איסוף המדיום המותנה. לאחר מכן, הבהירו את המדיום על ידי צנטריפוגה ב 8, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, סנן את המדיום הממוזג דרך פילטר של 0.45 מיקרומטר ודלל אותו פי שלושה ב- PBM. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, צלחו אותם בצלחת באר 24 והניחו להם להיצמד למשך שעה בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, החלף את הסופרנטנט של התאים במדיום מותנה שהוכן בעבר.
לאחר 16 שעות, דמיין את צבירת התאים עם מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות סובייקטיבי פי חמישה. כאן, התאים החסרים בקורונין-A מראים פגם בהתפתחות המוקדמת, ולא הצליחו ליצור אגרגטים רב-תאיים, שהוא השלב הראשוני במהלך מחזור ההתפתחות של Dictyostelium discoideum. באיור זה, הסוג הצומח Wild, ותאים חסרי corA, נשטפו והורעבו במשך שעתיים לפני שפעממו עם, או בלי, 15 AMP בעלי חיים או מחזוריים, כל שש וחצי דקות למשך חמש שעות בתרחיף.
היישום של פולסים מחזוריים אקסוגניים של AMP, החזיר במלואו את הפנוטיפ מסוג Wild. באיור זה, תאים מסוג Wild וחסרי corA שגדלו באופן אקספוננציאלי, נשטפו ב-PBM, נזרעו לתוך צלחות באר מרובות, והודגרו במדיום מותנה המתקבל מסוג Wild, או תאים רעבים חסרי corA. התמונות צולמו 16 שעות לאחר זריעת התאים.
Dictyostelium discoideum חסר corA, הצליחו לייצר את כל הגורמים הנדרשים לאינדוקציה ההתפתחותית, אך לא היו מסוגלים להגיב אליהם. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 20 שעות, כולל זמן הדגירה, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור, כי עבור זנים שונים תידרש התאמה של מספר משתנים של הבדיקה, כגון צפיפות תאים, זמן היצמדות, זמן התפתחות.
לאחר הליך זה, ניתן לבצע פיצול ביוכימי וניתוח פרוטאומי לאחר מכן, על מנת לזהות גורמים המעורבים בתגובת הרעב המוקדמת של Dictyostelium discoideum. לאחר צפייה בסרטון זה, אדם אמור להבין היטב כיצד לגרום להתפתחות מוקדמת ב-Dictyostelium discoideum בתנאים שקועים, באמצעות מדיה מותנית, כמו גם פולסים מחזוריים של AMP.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
מחקר זה חוקר את תפקידה של coronin A בתגובת הרעב המוקדמת של האמה החברתית Dictyostelium discoideum. המחקר נועד להבהיר את מסלולי האיתות המעורבים במעבר של האורגניזם לצורת רב-תאיות בזמן הרעב.
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.