Name: חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של Discoideum Dictyostelium באמצעות אגרגציה מבחנים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: חקור את תפקידו של Coronin A במענה הרעב המוקדם של Dictyostelium discoideum באמצעות מבחני אגרגציה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולי מעברים וגורמים ביולוגיים המעורבים בהתפתחות ראשונית של האורגניזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למרכז המניות של דיקטיוסטליום על זנים וריאגנטים. מחקר זה מומן על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע של שווייץ וקנטון באזל.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התגובה הרעבה מוקדם של discoideum Dictyostelium ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים DH1.10 או תאים -deficient קורה בתוך הבקבוק Erlenmayer המכיל בינוני HL-5 (1 L: 5 גרם proteose peptone, 5 גרם thiotone E peptone, 10 גלוקוז גרם, תמצית שמרים 5 גרם, 0.35 גרם Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0.35 גרם KH 2 4 PO, 0.05 גרם dihydrostreptomycin-סולפט, pH 6.6) בשעה 22 ° C באינקובטור רועד עם סיבוב של 160 סל&quot;ד. שמור התאים בצפיפות בין 0.01 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ו -2 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צבירת תא, על ידי תאי DH1.10 קצירת יומן פאזיים וגדל 21 או תאי -deficient קורה 10 שנוצרו ברקע DH1.10, גדלים רועדים תרבות עם מדיום HL-5 על 22 מעלות צלזיוס. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ&quot;ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG לשטוף את התאים פעמיים BSS (10 mM NaCl, 10 מ&quot;מ KCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, pH 6.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. כתוצאה מכך, תאי צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 סנטימטר בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס BSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו צבירה ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות כפי שתואר קודם לכן 10, לקחת תמונות כל 135 שניות. באמצעות הדמית תא חי להגדיר מצויד האובייקטיבי 5X ומצלמת מכשיר אלקטרונים-הכפלת תשלום מצמידים אוטומתית את התוכנה המתאימה (ראה לוח חומרים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פועם cAMP של תאים discoideum Dictyostelium במהלך רעב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את השפעת פולסים cAMP לשימוש חיצוני על התפתחות תאים DH1.10 21 או תאים -deficient DH1.10 קורה 10, על ידי איסוף תאים. כדי לעשות זאת, לקחת את הכמות המתאימה של תאים (בדרך כלל בין 10 ל 50 מ&quot;ל), צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף פעמיים BSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> couNT תאים באמצעות hemocytometer ו resuspend התאים בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל ב BSS. לנער את תרבויות (160 סל&quot;ד) בשעה 22 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני יישום קטניות. להוסיף קטניות cAMP באמצעות משאבת peristaltic נשלט טיימר. לתכנת את המשאבה כדי לספק דופק שניות 5 כל 6.5 דקות של 15 μl של 50 ננומטר cAMP (ריכוז סופי) על פני תקופה של 5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. בהמשך לכך, צלחת התאים בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס&quot;מ בצלחת 24 גם. אפשר לדבוק עבור שעה 1 ב BSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין צבירה לאחר 16 שעות ב 22 מעלות צלזיוס על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אינדוקציה של פיתוח discoideum Dictyostelium באמצעות חשיפה בינונית מותנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בינוני מותנה טרי כמתואר 22. איסוף תאי יומן פאזיים DH1.10 21 או תאי -deficient DH1.10 קורית 10, מן רעד כתures עם המדיום HL-5 ב 22 ° C בעזרת פיפטה, צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 400 XG ולשטוף תאים שלוש פעמים PBM (0.02 M פוספט אשלגן, 10 מיקרומטר CaCl 2, ו 1 מ&quot;מ MgCl 2, pH 6.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer, resuspend אלה PBM בצפיפות של 1 x 10 7 תאים / מ&quot;ל ולנער במשך 20 שעות ב 110 סל&quot;ד / 22 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף בינוני מותנה לאחר צנטריפוגה ב g 400 × 3 דקות ולהבהיר ידי צנטריפוגה ב 8000 גרם × במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מותנה מסנן בינוני דרך פילטר 0.45 מיקרומטר (ראה לוח חומרים) לדלל משולש ב PBM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת בצפיפות של (5, 10, 20, או 40) x 10 4 תאים / 2 ס&quot;מ בצלחת 24 גם. לאפשר להם לדבוק עבור שעה 1 ב 22 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant Exchange של תאים עם המדיום המותנה שהוכן קודם לכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו צבירהחרה 16 ​​שעות על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 5X. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
<li>Mann, S. K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+regulation+of+early+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%3A+mediation+via+the+cell+surface+cyclic+AMP+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor.</a> Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).</li>
<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

החלבונים coronin נמצאים מינים רוב clade איקריוטיים. Coronin Dictyostelium discoideum, את homologue של יונקים coronin 1, הוא מעורב בתגובה רעב מוקדם, מאז coronin A-לקוי התאים אינם מסוגלים ליצור מרכזי צבירה במהלך המוקדמות התפתחותי מחזור 10. כדי להיות מסוגל כמותית להעריך נכונת העיכוב בהתפתחות בין הזנים, הדמית תא מיקרוסקופ חי הגדרה עם בקר השלב אוטומטית היא כלי חיוני. ד discoideum מנצל cAMP...

משפחת coronin של חלבונים הוא שמור ביותר ברחבי אאוקריוטים. חלבונים אלה מאופיינים על ידי הנוכחות של אזור אמינו מסוף טריפטופן-aspartate (WD) לחזור המכיל ואחריו אזור ייחודי מחובר לתחום מפותל-סליל carboxy מסוף 13,14 (איור 1). Coronins היו מעורבים במגוון של תפקודים תאיים, כולל רגולציה cytoskeletal האות התמרה 12. ביונקים, עד שש מולקולות coronin קצרות (coronin 1-6) וכן &#39;טנדם&#39; coronin 7, יכולה להיות שותף הביע 12,15. Coronin 1 הוא בן המשפחה למד בצורה המקיפה ביותר, ו הוצג להיות מעורב הרס הפתוגן, הישרדות תא T ואיתות עצבית. איך, בדיוק, coronin 1 מבצע פעילויות אלה עדיין לא ברורים. בעוד coronin 1 הוצג להסדיר Ca 2 + ו cAMP תלוי איתות וכן F- תקטין cytoskeleton אפנון 16-18, שיתוף הפוטנציאל-expression של עד 7 בני משפחה ביונקים עשתה זה מאתגר ללמוד את הפונקציה מולקולרית של coronins במערכות אלה, בשל כפילויות פוטנציאליים. בניגוד אורגניזמים יונקים, discoideum Dictyostelium eukaryote נמוך מבטא רק שני בני משפחה coronin (א coronin, את ortholog של B יונקים coronin 1 ו coronin, את ortholog של יונקים coronin 7) עם כנראה לא יתירים פונקציות 15,19,20. עובדה זו הופכת discoideum Dictyostelium מודל חזק כדי ללמוד את הפונקציה של coronins. כדי ללמוד את התפקיד של coronin ב discoideum Dictyostelium, אנו מושרה מעגל ההתפתחות ברעב צלחות רקמות תרבות המכילות תמיסת מלח מאוזן (BSS) חיץ או באמצעות תאי סוג ברים או תאים חסרי coronin A 10. מצאנו כי התאים חסרי coronin לא הצליחו ליצור אגרגטים רבים-תאי על רעב. לקבלת הערכה כמותית מדויקת של פנוטיפ זההדמית תא חייה אוטומטית המתואר בפרוטוקול זה היא כלי חיוני. הפגם בייזום של התגובה רעב מוקדם בתאים חסר coronin A יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של מפל cAMP. היישום אקסוגני של פולסים cAMP לדמות לתחילת עבודות הפיתוח נוצל על ידי מספר מעבדות ב 8,9 בעבר. עם זאת, הליך זה ידוע גם להיות תלוי מאוד צפיפות תא ועיתוי. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן שואף להפחית variabilities הללו על מנת להבטיח רמה גבוהה של שחזור. יחדיו, טכניקות נוצלו במחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים במהלך השלבים המוקדמים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium ויש להם את הפוטנציאל לזהות החצים למעלה וכן effectors במורד הזרם של coronin פונקציה.

<table><tbody><tr><td>מדיה HL-5 (עבור 1 ליטר: 5 גרם פפטון פרוטאוז, 5 גרם פפטון תיאוטון E, 10 גרם גלוקוז, 5 גרם תמצית שמרים, 0.35 גרם Na2HPO4*2H2O, 0.35 גרם KH2PO4, 0.05 גרם דיהידרוסטרפטומיצין-סולפט, pH 6.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פרוטאוז פפטון</td><td>BD Bioscience</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>תיוטון E פפטון</td><td>BD Bioscience</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2</td><td>O Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>dihydrostreptomycin-sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0.02 M אשלגן פוספט, 10 &mu; M CaCl<תת>2, ו-l mM MgCl2, pH 6.1)</td><td></td><td></td> BSS <td>מתוצרת עצמית</td></tr><tr><td>(10 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl, 2.5 מ"מ CaCl<תת>2, pH 6.5)</td><td></td><td></td> <td>מתוצרת עצמית</td></tr><tr><td>0.45-&mu; m פילטר Filtropure S</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well צלחת תרבית רקמות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Cellobserver</td><td>Zeiss</td><td></td> תוכנת AxioVision <td>שנבנתה בהתאמה אישית</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC Microprocessor&ndash; משאבת חלוקה מבוקרת</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>שייקר דגירה</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חקירת הפונקציה של coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; discoideum dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

אמבת discoideum Dictyostelium נמצאת באדמה, האכלה על חיידקים. כאשר מקורות המזון הופכים נדירים, הם מפרישים גורמים ליזום תוכנית פיתוח רב-תאיים, במהלכה תאים בודדים chemotax לעבר מרכזי צבירה 1-4. תהליך זה תלוי בשחרור של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) 5. cAMP מופק בגלים דרך הפעולה המתואמת של cyclase adenylate ו phosphodiesterases, ונקשר לקולטנים cAMP G- חלבון בשילוב 6,7. Assay בשימוש נרחב כדי לנתח את המנגנונים מעורבים מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium eukaryote הנמוך מבוסס על התצפית של צבירת תא בתנאים שקועים 8,9. פרוטוקול זה מתאר את הניתוח של התפקיד של coronin במחזור התפתחותי ברעב צלחות רקמות תרבות שקועה תמיסת מלח המאוזן (BSS) 10. Coronin A הוא חבר pr נשמרת נרחבהמשפחה otein של coronins כי היו מעורבים במגוון רחב של פעילויות 11,12. תאים Dictyostelium חסר coronin A הם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, פגם זה יכול להינצל על ידי אספקת פולסים של cAMP, דבר המצביע על כך coronin מתפקדת במעלה הזרם של cAMP מפל 10. הטכניקות המתוארות מחקרים אלה מספקים כלים חזקים לחקור פונקציות של חלבונים בשלבים הראשונים של מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium במעלה הזרם של מפל cAMP. לכן, ניצול assay אגרגציה זה עשוי לאפשר מחקר נוסף של coronin פונקציה ולקדם את הבנתנו ביולוגיה coronin.

תאים חסרים coronin מופע פגם בהתפתחות מוקדמת (איור 2). בהעדר coronin תאים אינם מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווה את הצעד הראשוני במהלך מעגל ההתפתחות של discoideum Dictyostelium. לכן, coronin ינוגן תפקיד במהלך התגובה הרעבה מוקדם ו / או איתות cAMP. אכן, חוסר היווצרות המצרפי רב-תאיים ב בהיעדר coronin מלווה cAMP מופחת איתות 10. עם זאת, היישום של פולסים cAMP אקסוגניים מלא משחזר את פנוטיפ wild-type (איור 3...

האמבה החברתית Dictyostelium discoideum עוברת מעבר התפתחותי לאורגניזם רב-תאי כאשר היא מורעבת. החלבון המשומר האבולוציוני קורונין A ממלא תפקיד מכריע בהתחלת ההתפתחות. באמצעות מבחני צבירה כשיטה העיקרית שלנו, אנו שואפים להבהיר את תפקידו של קורונין A בהתפתחות מוקדמת.

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של<em&gt; Discoideum Dictyostelium</em&gt; באמצעות אגרגציה מבחנים

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא לחקור את תגובת הרעב המוקדמת של Dictyostelium discoideum התלויה ב-Coronin-A. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון זיהוי מסלולי אותים וגורמים המעורבים בהתפתחות המוקדמת של Dictyostelium discoideum. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא הפוטנציאל שלה לספק כלי לסריקה אוטומטית ובספיקות גבוהה (high-throughput) של גורמים מעודדי התפתחות וחלבונים המעורבים באותות התפתחותיים מוקדמים.באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה הזו יתקלו בקשיים בשל משתנים מרובים הגלומים במדידה, כגון צפיפות תאים, זמן היצמדות וזמן פיתוח. כדי להתחיל בהליך זה, גדלו תאי DH1.10 או תאים חסרי corA בבקבוע ארלנמאייר המכיל מצע HL-5, בטמפרטורה של 22 °C, באינקובטור רוטט במהירות של 160 rpm. שמרו על צפיפות תאים שבין 1×10⁴ ל-2×10⁶ תאים למילליליטר.כדי לבחון אגרגציה של תאים, קצרו 10 עד 50 milliliters של תאי DH1.10 הגדלים בשלב לוגריתמי (log-phase) או תאים חסרי corA שפותחו על רקע DH1.10. סובבו אותם בצנטריפוגה במשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים ב-BSS.לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, זרעו את התאים בפלטה בעלת 24 בארות. אפשרו להם להיצמד למשך שעה אחת בטמפרטורה של 22 degrees Celsuis ב-BSS.לאחר מכן, הדמיאו את אגרגציית התאים באמצעות מיקרוסקופיה של צילומי רצף (time-lapse microscopy), וצלמו תמונות בכל 135 seconds. כדי לבחון את השפעת פולסי cyclic AMP המוחלים מבחוץ על התפתחותם של תאי DH1.10, או תאי DH1.10 חסרי corA, קצרו 10 עד 50 milliliters של התאים וסובבו אותם בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטפו אותם פעמיים ב-BSS.ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים לצפיפות של 1*10⁷ תאים ל-milliliter ב-BSS. לאחר מכן, נערו את התרביות בטמפרטורה של 22 °C למשך שעתיים ב-160 rpm לפני השמנת הפולסים.בשלב הבא, החילו פולסים של cyclic AMP באמצעות משאבה פריסטלטית המופעלת על ידי טיימר. תכננו את המשאבה כך שתספק פולס של חמש שניות של cyclic AMP בכל שש דקות וחצי, למשך תקופה של חמש שעות. שלב קריטי הוא לוודא שקצה הזרקת ה-cyclic AMP אינו טבול באופן רציף בתמיסה, אלא נטבל רק באופן מחזורי בגלים הנוצרים על ידי השייקר.לאחר יישום של cyclic AMP, ספרו את התאים שוב באמצעות המוציטומטר. לאחר מכן, זרעו את התאים בפלטה בעלת 24 באריים והמתינו שעה אחת להצמדתם ב-BSS. לאחר 16 שעות, הדמינו את אגרגציית התאים בטמפרטורה של 22 degrees Celsius, באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר עם עדשה של five x.בנוהל זה, הכין מצע מותנה (conditioned medium) טרי, על ידי איסוף תאי DH1.10 או תאי DH1.10 חסרי corA בשלב הלוגריטמי, מתרביות הננערות במצע HL5, בטמפרטורה של 22 °C. סבב את התאים בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-400 ×g. לאחר מכן, שטוף אותם שלוש פעמים ב-PBM.לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוסימטר (hemocytometer). לאחר מכן, השביחו אותם שוב ב-PBM בריכוז של 1x10⁷ תאים למל', ונערה אותם במשך 20 שעות בטמפרטורה של 22 °C במהירות של 110 rpm. בשלב הבא, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 400 ×g למשך שלוש דקות, ולאחר מכן אספו את המצע המותנה (conditioned medium). לאחר מכן, הבהירו את המצע באמצעות צנטריפוגה במהירות של 8,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר מכן, סננו את המצע המותנה דרך מסנן של 0.45 micrometer ומהלו אותו פי שלושה ב-PBM. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר, זרעו אותם בפלטה בעלת 24 בארות, והמתינו שעה אחת להיצמדות בטמפרטורה של 22 degrees Celsius. לאחר מכן, החליפו את הנוזל שמעל התאים במצע מותנה שהוכן מראש.לאחר 16 שעות, הדמיעו את התקבצות התאים באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר תוך שימוש בעדשה עם הגדלה של five x. כאן, תאים החסרים Coronin-A מראים פגם בהתפתחות המוקדמת, ולא היו מסוגלים ליצור אגרגטים רב-תאיים, המהווים את השלב הראשוני במחזור ההתפתחותי של Dictyostelium discoideum. בדמות זו, תאי Wild type וגנטיביים ותאים חסרי corA נשטפו והורעבו למשך שעתיים לפני שקיבלו פולסים של 15 animal or cyclic AMP, עם או בלי, מדי שש וחצי דקות למשך חמש שעות בתליה.יישום של פולסים חיצוניים של cyclic AMP השחזר באופן מלא את הפנוטיפ של סוג הפרא (Wild type). באיור זה, תאים של סוג הפרא ותאים חסרי corA בצמיחה מעריכית, נשטפו ב-PBM, נזרעו לפלטות רב-בארים, והודגרו במצע מותנה שהתקבל מתאי סוג פרא או מתאי corA-חסרים המצויים ברעב. התמונות צולמו 16 שעות לאחר זריעת התאים.תאי *Dictyostelium discoideum* חסרי corA היו מסוגלים להפיק את כל הגורמים הדרושים להשראה התפתחותית, אך לא היו מסוגלים להגיב להם. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך 20 שעות, כולל זמן הדגירה, אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי עבור זנים שונים יידרש התאמה של מספר משתנים בבדיקה, כגון צפיפות תאים, זמן ההיצמדות וזמן ההתפתחות.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע פרקציונציה ביוכימית ואנליזה פרוטאומיקה לאחר מכן, כדי לזהות גורמים המעורבים בתגובת הרעב המוקדמת של Dictyostelium discoideum. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה למצופה הבנה טובה של האופן שבו ניתן להניע התפתחות מוקדמת ב-Dictyostelium discoideum בתנאי טבילה, באמצעות מצע מותנה או פולסים של cyclic AMP.

investigating-function-coronin-early-starvation-response

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

מאמר זה מתאר בדיקה מבוססת גידול שמרים לקביעת הדרישות הגנטיות לפירוק חלבונים. הוא גם מדגים שיטה למיצוי מהיר של חלבוני שמרים, המתאימה לכתמים מערביים כדי לאשר ביוכימית את דרישות הפירוק. ניתן להתאים טכניקות אלה לניטור פירוק של מגוון חלבונים.

קביעה מבוססת צמיחה ואישור ביוכימית של דרישות גנטיות לפירוק חלבונים ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

מחקר זה מתאר טכניקות biophysical, ביוכימיים ומולקולריים לאפיין את הפעילות המלווה של Escherichia coli HdeB בתנאי pH חומצי. שיטות אלו יושמו בהצלחה עבור מלוות חומצה-מגן אחרות כגון HdeA והוא יכול להיות שונה כדי לעבוד עבור מלווים אחרים בתנאי עקה.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

כאן נתאר שיטות להערכת הסלולר בתגובה חריפה גירוי מכני. ב וזמינותו מבוסס מיקרוסקופיה, אנו בוחנים לוקליזציה של ביולוגיים שכותרתו fluorescently בעקבות גירוי קצרה עם הטיה זרימה. אנחנו גם בדיקת ההפעלה של חלבונים שונים עניין בתגובה חריפה גירוי מכני מבחינה ביוכימית.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

מטרת השיטה המובאת כאן היא לבחון חלבון צבירת במהלך הזדקנות נורמלית בתוך האורגניזם דגם C. elegans. הפרוטוקול מייצג כלי רב עוצמה כדי ללמוד מצרפי גדול מאוד מסיסים היוצרים עם הגיל וכדי לקבוע כיצד משפיעים השינויים פרוטוסטאזיס חלבון צבירת.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

Macropinocytosis, בקנה מידה גדול ספיגת הנוזלים של שאינם ספציפיים, חשוב בתחומים רבים של ביולוגיה קליני כולל אימונולוגיה, זיהום, סרטן ומחלות ניווניות. . הנה, קיימות טכניקות הותאמו כדי לאפשר רזולוציה תפוקה גבוהה, תא בודד מדידה של macropinocytosis macropinocytosis דגם האורגניזם Dictyostelium discoideum באמצעות flow cytometry.

מדידת תפוקה גבוהה Dictyostelium discoideum Macropinocytosis על ידי Cytometry זרימה

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

הפרוטוקול הבא מתאר את הפיתוח והאופטימיזציה של זרימת עבודה בתפוקה גבוהה עבור גידול תולעים, הדמיה פלואורסצנטית ועיבוד תמונה אוטומטי כדי לכמת אגרגטים של פוליגלוטמין כהערכה של שינויים בפרוטאוסטזיס.

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

כאן, שיטה מוצגת לניתוח של קינטיקה הצטברות חלבון נמטודה Caenorhabditis elegans. בעלי חיים מאוכלוסייה מסונכרנת גיל הם בתמונה בנקודות זמן שונות, ואחריו ספירת הכללה חצי אוטומטית CellProfiler והתאמה למודל מתמטי באמילופיט.

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

חקור את תפקידו של Coronin A במענה הרעב המוקדם של Dictyostelium discoideum באמצעות מבחני אגרגציה. שיטה זו מאפשרת זיהוי מסלולי מעברים וגורמים ביולוגיים המעורבים בהתפתחות ראשונית של האורגניזם.

חקירת הפונקציה של Coronin במענה הרעב מוקדם של

גלה סרטונים נוספים