Name: בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למדו את פרוטוקול בידוד תאי האנדותל הכלילי בעכבר לחקר לב וכלי דם. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה של תאים טהורים לאימות מולקולרי ודימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות (HL115578 א Makino).

המחקר על העכברים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת אריזונה בוצעה על פי המכון הלאומי לבריאות בארה&quot;ב (NIH) הנחיות. הערה: סעיפים 1, 2 ו -3 צריכות להתבצע היום לפני הניסוי כפי התקנה. 1. פתרונות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ CD31 (50 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ל 1 × חיץ מלוחים פוספט (PBS) כדי שפופרת 50 מ&quot;ל. לשקול 0.05 גרם שור סרום אלבומין (BSA) ו 0.037 גרם חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ולהוסיף הצינור 50 מ&quot;ל ולשים את הצינור כדי לסובב במשך כ 1 ח עד להמסת האבקה. התאם ל- pH 7.4, מסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל, ולאחסן ב 4 C עד השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) עם HEPES (500 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.1915 גרם של HEPES לעשות 10 מ&quot;מ HEPES בתמיסה HBSS ומערבבים היטב. מדוד את pH ולהתאים ל -7.4. סנן ולאחסן ב 4ג. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון של 1x Kreb (1 ליטר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 מ&quot;ל של 10 × פתרון של Kreb [טבלה 1] להכפיל מים מזוקקים בבקבוק 1 ליטר. לשקול 2.1 גרם נתרן ביקרבונט ו -2 גרם D- גלוקוז ומוסיפים את הבקבוק. מערבבים ולהתאים את הנפח הכולל עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון בועה עם 95% O 2/5% CO 2 גז במשך 30 דקות פתרון ולסנן בתוך מכסה המנוע. חנות ב 4 C ולשמור על הקרח במהלך הניסוי. </li></ol></li></ol> 2. הכנת החרוזים המגנטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל חיץ CD31 לתוך כל צינור 1.5 מ&quot;ל (צינור אחד לדגימה). מערבבים את החרוזים IgG אנטי עכברוש כבשים ולהוסיף את הכמות המתאימה מדגם [טבלה 1]. לנער את הצינורות במרץ 30 פעמים ומניחים אותם בצלחת מגנטי דקות 1 של טלטול. פתח את הצינורות בעוד על הצלחת ולזרוק פתרונות לדליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ CD31 1 מ&quot;ל לתוך צינור אחד. מוסיפים 2 עכברוש μl אנטי עכבר אנטי CD31הגוף על צינור אחד ולסובב צינורות O / N ב 4 ºC. </li></ol> 3. מעוקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי כל כלי ניתוח וטיפים פיפטה. חותכים את הקצוות של טיפים פיפטה כך יש עצות עם 4 קטרים ​​שונים, מן הרחב אל הצר. בקטרים ​​משוערים על העצות הם 3 מ&quot;מ, 2.5 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ, ו -1.5 מ&quot;מ בהתאמה. חותך את טיפי חיטוי היום קודם לכן עם 30 דקות של עיקור בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס. הערה: סעיפים 4 - 11 צריך להתבצע ביום של הניסוי. </li></ol> 4. פתרונות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ כביסה המכיל 2% משורינת עגל סרום (IFCS) ב M199. עבור הדמיה, להכין 30 מ&quot;ל / עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אנזים (10 מ&quot;ל / לדוגמה). לשקול 0.6 יחידה / מ&quot;ל ​​של Dispase ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של Collagenase Type II לתוך צינור 50 מ&quot;ל. להוסיף M199 לסובב את הצינור ב 4 ºC במשך 15 דקות. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל insidדואר למכסה המנוע ולשמור על 4 C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן HBSS / HEPES עם הפרין. הוסף 10 מ&quot;ל של HBSS עם 10 HEPES מ&quot;מ ב 15 מ&quot;ל צינור. הוספת 100 μl של הפרין אל הצינור ולשמור על 4 C עד השימוש. </li></ol> 5. שטיפת חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הצינורות עם החרוזים מן הכתף ב 4 ºC ומביאים את מכסה המנוע. מניח את הצינורות בצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ הפתרון ולהוסיף חיץ CD31 1 מ&quot;ל לתוך צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצינורות מתוך הצלחת המגנטית לנער במרץ 30 פעמים. שים את הצינורות בחזרה בצלחת המגנטית וחזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. לאחר השלמת, לשים את הצינורות בחזרה 4C ולשמור מסתובבת עד השימוש. </li></ol> 6. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את העכברים intraperitoneally עם 0.1 מ&quot;ל של הפרין כדי למנוע קרישת דם. המתן 10 דקות, ואז להרדים את העכברים באמצעות זריקה intraperitoneal של 0.01 מ&quot;ל של Pentobarbital. בדוק אם העכבר הוא מרגיש<html> כאב על ידי צובט את הרגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את העכבר על לוח קלקר עם ראש כלפי מעלה וחזק זרועות עם סיכות. שימוש במלקחיים ו-לגזור במספריים קשים לחתוך את העור באזור החזה העליון עד הגרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך במרכז כלוב הצלעות רק מעל הסרעפת. חותכים את העצם הצידה ולמעלה לכיוון הגרון כדי להפוך משולש לחשוף את הלב והריאות. חותכים את אבי העורקים בדיוק מעל הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את התימוס עם מלקחיים ללא משייכת ולהשתמש מספריים לחתוך את כל רקמת חיבור בקפידה כדי לסלק ריאות ולב יחד. רקמות מקום בכוס עם 1 × Kreb של, לנער עם מלקחיים ולהעביר עד 6 צלחת ס&quot;מ עם 1 × Kreb של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האונה של הריאות באמצעות מספרי מלקחיים. הכנס קטטר סטרילי 20 G לתוך אבי העורקים. שטוף את הדם במערכת הדם הכליליים עם HBSS / הפרין. ביצוע חתך קטן החדר, לנער את הלב ולהעביר לצינור מדגם של M199. שמור צינורות על הקרח. </li></ol><html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. עיכול רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הלב אל צלחת 6 ס&quot;מ מלא 10 מ&quot;ל של תמיסת אנזים ופשטי- אותו לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. מניחים את הכלים בחממה 37 ºC במשך 15 דקות. להתסיס חומרים מתעכל על ידי pipetting למעלה ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ עם הקצוות כדי לאפשר לרקמות לעבור קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את זה בחזרה בחממת 37 ºC עבור 15 דקות אחרות. חזרו על תסיסה שלוש פעמים, בכל פעם באמצעות טיפים פיפטה מהפתחים גדולים ביותר צרה ביותר ו -15 דגירה דקה בין כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 15 דקות האחרונות, לקחת דגימות החוצה לתוך מכסה המנוע. פתרון עד Pipet ולמטה 30 פעמים באמצעות טיפ pipet עם פתיחת הצרה ביותר ולהעביר דרך מסננת 40 מיקרומטר התא לתוך צינור חדש 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המנה עם כביסה חיץ 10 מ&quot;ל בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ולהעביר על מסננת התא. שים את 50 מ&quot;ל צינורות בצנטריפוגה ספין ב 400 גרם במשך 10 דקות ב RT. </li></ol>itle &quot;&gt; 8. כביסה הצמדתי עם חרוזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מבלי לשבש את הגלולה. שטפו תאים עם חיץ כביסה 5 מ&quot;ל פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל אחד בעבר הכינו צינורות 1.5 מ&quot;ל עם חרוזים ולעבוד על צינור אחד בכל פעם. שים צינור 1.5 מיליליטר אחד בצלחת המגנטית, לנער 3 פעמים ולפתוח אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה האחרון, להסיר supernatant ככל האפשר מבלי לשבש את הגלולה. לנתק את גושי תאים על ידי מצליף במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ כביסה 1 מ&quot;ל צינור 50 מ&quot;ל ו לערבב את התאים עם טפטפת 1 מ&quot;ל. דאמפ הפתרון מהצינור 1.5 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של תרחיף תאים מהצינור 50 מ&quot;ל של חרוזים. פליק הצינורות 30 פעמים ואז לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li></ol> 9. הכנות לקראת תרבית תאים / דימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאי עבור תאי ציפוי. הוסף פתרון ג&#39;לטין (5% w / v, 300 μl) לתא היטב כדי לצפות את משטח דגירה במשך 30 דקות ב 37 ºC. לאחר דגירה, remג&#39;לטין אובה ויבש לפני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוציא את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 30 דקות של סיבוב ולשים בצלחת המגנטית בתוך מכסה המנוע. Shake למשך 2 דקות, מזבלה ולהוסיף חיץ כביסה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו צינורות מתוך הצלחת, לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים אותם בחזרה צלחת מגנטית ולנער דקות 1. חזור 4 פעמים עבור סכום כולל של 5 שטיפות, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, להוציא צינור אחד ולעבוד על כל אחד צינור בכל פעם. Shake 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. שים את זה על הצלחת המגנטית ולנער דקות 1. דאמפ ולהוסיף 1 מ&quot;ל 20% התקשורת IFCS EC (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. התאם pipet 500 μl ו pipet למעלה ולמטה 10 פעמים. העבר 500 μl לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים בבית חממה 37 ºC ולהשאיר O / N. למחרת, לשטוף תאים עם 10% תקשורת FBS EC. </li></ol> 10. הכנות לקראת דוגמאות כתם המערבי (WB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טאקדואר את הצינורות עם חרוזים / תאים לאחר 1 hr סיבוב. שים אותם בצלחת המגנטית ולנער למשך 2 דקות. דאמפ supernatant ולהוסיף 1 מ&quot;ל HBSS קר. לנער במרץ 30 פעמים ואז קפיצי 30 פעמים. חזור פעמים עבור 3 שוטף, אבל עם 1 דקות רועדות על הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף האחרון, לשים צינורות בצלחת מגנטית ולנער דקות 1. הסר חוצץ באמצעות פיפטה lyse התאים עבור WB באמצעות שיטה שתוארה לעיל 11,12. lysate המצטבר בדרך כלל מכיל כ -30 מיקרוגרם של חלבון. </li></ol> הדמיה 11. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים 3 פעמים עם התקשורת, עם נפח סופי של 250 μl עבור תא. הוסף 1.5 μl של דיל-acLDL אל התאים. מנקודה זו, לשמור על התאים בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3.5 שעות ב 37 ג. הוסף 1.5 μl של Hoechst, מערבבים היטב דגירה במשך 30 דקות ב 37 תאים ˚C.Wash עם PBS ולתקן עם paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBS ולחסום עם 5% BSA-PBS עבור 30 מילn ב RT. שטפו פעמיים עם 1% BSA-PBS. לדלל BS-לקטינים-FITC באמצעות 1% BSA-PBS לריכוז של 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ולהוסיף 300 μl לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התא על שייקר מסלולית ב RT במשך 30 דקות. לשטוף עם 3 פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם זמן חשיפה של 200 מילי-שניות עבור FITC (מכתים לקטינים, סמן EC, עירור / פליטה 488 ננומטר / 519 ננומטר), 30 msec עבור DAPI (Hoechst, עירור, מכתים גרעיני / פליטה ב 358 ננומטר / 461 ננומטר), ו -300 msec עבור TRITC (מכתים acLDL, סמן EC, עירור / פליטה ב 557 ננומטר / 576 ננומטר). לרכוש תמונות באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. </li></ol>

<ol><li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li>
<li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+in+focus%3A+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li>
<li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li>
<li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+function+and+dysfunction%3A+testing+and+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li>
<li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li>
<li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li>
<li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li>
<li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li>
<li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC%3A+old+protein+with+new+roles+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

לתאי אנדותל ביותר בשימוש נרחב במחקר הם לתאי אנדותל אנושיים הטבור וריד (HUVECs) בגלל הנוחות וקלות culturing שלהם. עם זאת, הרבה מחקר דורש הזמינות של מודל פיסיולוגי שהשיג הבידוד של בתאי האנדותל מאיברים ספציפיים אחרים 10. תאי האנדותל לפצות אוכלוסיית קטין מאוד של תאים ברקמת הלב; בידוד culturing שלהם יכולים להוכיח להיות מאוד קשה. ישנם שלושה שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול זה. הראשונה היא כדי לשטוף היטב דם. זה הכ...

מודלי עכבר של מחלות לב וכלי דם שונות והפרעות מטבוליות לשאת שינויים פיסיולוגיים ומולקולריים דומים לאלה שנמצאו בחולים. יתר על כן, שינוי גנטי של עכברים הוא כלי רב עוצמה המאפשר לנו לחקור את תפקיד פתוגניים של גנים ספציפיים בהתפתחות והתקדמות של מחלות. כיום, תאים מסוג הגן ספציפי-עקום או עכברים אאוט נוצרים בקלות במעבדות רבות ומדידת mRNA ורמות חלבון סוגי תאים מסוימים הוא הצעד הראשון בקביעה אם העכברים היו באמת מהונדסים גנטיים. האנדותל היא שכבה דקה אחת של תאי האנדותל (EC) המרפד את קיר כלי הדם הפנימי. תאי האנדותל ממלאים תפקיד קריטי בויסות מתח כלי דם, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה 1,2. תפקוד לקוי של האנדותל היא סימן ההיכר של מצבים פתולוגיים רבים ושינויים בתפקוד האנדותל יכול להוביל רכב שונים3,4 מחלות diovascular. זהו אפוא משמעותיים ללמוד את הפונקציה של תאי אנדותל בתנאים פיסיולוגיים pathophysiological. ישנן מספר דרכים כדי לבודד ECS 5-8 ואת שיטת הבידוד צריכה להיות מותאמת תלוי באיזה רקמות ומינים ישמשו. הסיבה לכך היא כי ECS מרקמות שונות להציג רמה גבוהה של ההטרוגניות ביחס סמני המשטח וביטוי חלבון שלהם 9. בידוד מוצלח של תאי אנדותל לעתים קרובות יכול להיות מאתגר ומחייבת מידה מסוימת של אימון ותרגול. לאחר שהושגה, שיטת הבידוד הציע בפרוטוקול זה מוכיח להיות יציב ויעיל. המטרה הכללית של שיטה זו היא להשיג עכבר הכליליים ECS (MCECs) באיכות גבוהה ובכמות. למרות כמות התאים שנאספה לב היא פחות תאים שנאספו מרקמות אחרות תוך שימוש בטכניקות אחרות, שיטה זו עדיין מספקת הימוראיכות ter. טוהר תאי אנדותל באוכלוסייה שתתקבל יהיה גדול מ -90%. לפיכך, טכניקה זו תהיה אידיאלית עבור יישומים המסתמכים על תאי האנדותל מבודדים גרידא כגון הדמית תא.

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>SH3026801</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads עכבר מחבת חרוזי IgG&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>חולדה נגד עכבר CD31 נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>IFCS&nbsp;</td><td>פישר</td><td>SH30072.04</td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>פישר</td><td>MT10060-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (פרוטאז ניטרלי)</td><td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td><td>LS02109</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II&nbsp;</td><td>וורת'ינגטון ביוכימיקל קורפ/פישר</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>פישר</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021-50 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספטאז</td><td>סיגמא</td><td>P0044-1 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>סיגמא</td><td>P8340-1 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>הפרין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>פישר / מדיטק</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>D-ולין</td><td>סיגמא</td><td>V1255-5G</td><td></td></tr><tr><td>EGS</td><td>קורנינג</td><td>356006</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>פישר / מדיטק</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

תאי האנדותל המרפדים את הדופן הפנימי של כלי דם יש תפקיד חשוב בוויסות של טון וסקולרית, חדירות כלי דם, היווצרות כלי דם חדשה. תפקוד לקוי של תא האנדותל הוא מעורב בהתפתחות והתקדמות של מחלות לב וכלי דם רבים, כולל מחלת לב איסכמית. כדי לבחון את הפונקציה ואפיון של תאי אנדותל כליליים, בידוד תא הוא הצעד הראשון וזה דורש טוהר וכמות גבוהים לערוך ניסויים הבאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לבודד תאי אנדותל כלילית עכבר בוגר. לב העכבר הוא גזור טחון לחתיכות קטנות. לאחר העיכול של הלב באמצעות dispase ו collagenase השנייה, התאים נשטפים וטופחו עם חרוזים מגנטיים אשר מצומדות עם נוגדנים נגד CD31. החרוזים עם תאי אנדותל נשטפים מספר פעמים והם מוכנים להשתמש ביישומים שונים, כולל הדמיה experime ביולוגית מולקולריתnts. בידוד יעיל בתשואה של כ 10 4 תאים לכל לב אחד עם מעל 90 טוהר%.

הבידוד המוצלח של תאי אנדותל כליליים מלב עכבר בדרך כלל מניב כ -10 4 תאים עם מעל 90 טוהר% עם צורה מרוצפת. עבור אוכלוסייה טהורה של תאי אנדותל, יש לנקוט זהירות בכל הפרוטוקול כדי להבטיח סביבת סטרילית חופשית מכל זיהום. הופעת תאים מוארכים או תאים מוגדלים בתוך האוכלוסייה מציינת זיהום עם סוגי תאים אחרים, תאי שריר חלק פיברובלסטים. מבחן טוהר תא האנדותל מבוצע על ידי צביעת תאים עם סמן פני תא אנדותל, BS-לקטינים ו acLDL (איור 1). אחוז ...

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג מספרים גדולים של תאי אנדותל קורונריים של עכבר, בדרגת טהרה גבוהה ובאיכות גבוהה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המחקר הקרדיו-וסקולרי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת השגה של תנובה גבוהה של תאי אנדותל באיכות טובה.את הפרוצדורה זו תדגים שיז'ן לו (Shizhen Luo), מומחית מחקר, וד"ר איאקו מקינו (Dr.Ayako Makino), החוקרת הראשית שלנו. עד שבוע לפני הפרוצדורה, הוסיפו 1 mL של בופר CD31 לשפופרת מיקרוצנטריפוגה אחת בנפח 1.5 mL עבור כל דגימה. לאחר מכן, ערבבו חרוזי sheep antirad IGG באמצעות פיפוט עדין, והוסיפו את הנפח המתאים של החרוזים לכל שפופרת.לאחר הוספת כל החרו지를, נערו את המבחנות בעוצמה 30 פעמים והניחו אותן על פלטה מגנטית לדקה אחת של ניעור. לאחר מכן, בעוד המבחנות עדיין מחוברות לפלטה, השליכו את הבופר והוסיפו מילליטר אחד של בופר CD31 טרי לכל מבחנה. הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדן rad anti-mouse CD31 והניחו את המבחנות על רוטטור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה.למחרת, העבירו את המבחנות למכסה זרימה למינרית והניחו אותן בחזרה על הפלטה המגנטית עם ניעור למשך דקה אחת. לאחר מכן, החליפו את הנוזל העליון ב-1 mL של בופר CD31 טרי ונערו את המבחנות בעוצמה ביד 30 פעמים. לאחר השטיפה השלישית, החזירו את המבחנות לרוטטור בטמפרטורה של 4 °C.ביום הפרוצדורה, התחילו בהזרקה תוך-פריטונית של 0.1 milliliters של heparin לבעל החיים הניסויי כדי למנוע קרישה של הדם. לאחר עשר דקות, הרדימו את העכבר באמצעות הזרקה של 0.01 milliliters של pentobarbital. לאחר מכן, ודאו שאין תגובה ללחיצה על בהונות הרגליים.לאחר הסרה משותפת של רקמת הלב והריאות, הנח אותם לתוך כלי כימי (beaker) עם תמיסת Krebs ושטוף את הרקמות תוך써 ניעור עדין. לאחר מכן, העבר את הרקמות לצלחת העגולה בקוטר שישה סנטימטרים המכילה תמיסת Krebs טרייה, והשתמש במספריים ובפינצטה להסרת האונות של הריאות. כעת, הכנס קטטר במידה 20 gauge אל תוך האורטה ושטוף את מערכת מחזור הדם הכלילית באמצעות HBSS מועשר בהפרין.לאחר שכל הדם הוסר, בצעו חתך קטן בחדר, שטפו את הלב תוך כדי ניעור עדין, והעבירו את רקמת הלב למבחנה על קרח. לאחר עיכול הרקמה לשחרור תאי האנדותל העורקיים, השקיטו ושטפו את התאים פעמיים עם 5 mL של תמיסת שטיפה. לאחר מכן, הניחו מבחנה עם חרוזיים שהוכנו מראש על הפלטה המגנטית ונערו את המבחנה שלוש פעמים כדי לפזר את החרוזיים באופן אחיד.לאחר השטיפה השנייה, הסירו כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע, והפרידו את התאים באמצעות נקישה חזקה. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים ב-1 ml של תמיסת שטיפה תוך ערבוב עדין, והשליכו את תמיסת ה-CD31 מהחרוזיים. ערבבו את התאים עם החרוזיים ונקישו את המבחנה 30 פעמים.לאחר מכן, הניחו את תמיסת התאים והחרוגים על הרוטטור בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. בזמן דגירת התאים, צפו את פני השטח של באר אחת בכל תא זריעה לדגימה בתמיסות ג'לטין, והניחו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר שהג'לטין התמצמץ, הסירו כל עודף של תמיסת הג'ל וייבשו את פני השטח של באר התא.לאחר מכן, העבירו את התאים המשוריים לחרוזים לפלטה המגנטית תחת מסיכה למשך שתי דקות של ניעור, והשליכו את תמיסת השטיפה. הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת שטיפה טריה לתאים והוציאו את המבחנה מהפלטה ל-30 ניעורים חזקים, ולאחריהם 30 נקישות. החזירו את המבחנה לפלטה לדקה נוספת של ניעור.לאחר הערבול האחרון, החזירו את המבחנה לפלטה המגנטית לדקת ניעור סופית, והחליפו את בופר השטיפה במיליליטר אחד של מדיום לתאי אנדותל בטמפרטורה של 37 °C, מועשר ב-20% סרום עגלים מועשר בברזל. נערו ונקישו את המבחנות 30 פעמים אחרונות. לאחר מכן, השתמשו בפיפט של מיליליטר אחד המכוון ל-500 µL כדי לערבל את התאים המסומנים עשרה פעמים, והעבירו מנות של 500 µL של תאי אנדותל עורקיים לכל באר בתא ההשכבה לדגירה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.ביום למחרת, שטפו את התאים במצע גידול לתאי אנדותל, בתוספת 10% FBS. ניתן לאשש את טהרת תאי האנדותל העליליים שבודדו בשיטה זו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית נגד סמני שטח של תאי אנדותל, BS lectin ו-AC LDL, כאשר מעל 90% מהתאים מפגינים ביטוי כפול חיובי של שני הסמנים בתרבית טיפוסית של תאי אנדותל עליליים של עכבר. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן להשתמש בשיטה לביצוע בדיקות דם שונות, אימונו-רספטורים והדמיה פלואורסצנטית כדי לענות על שאלות נוספות, כגון איזה חלבון עשוי להשתנות במצבי מחלה שונים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו מספקת לחוקרים את הכלים הדרושים להרחבת מחקרם בתחום של תאי אנדותל מסביב לעורקים כליליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן בידולם של תאי אנדותל כליליים של עכבר בכמות ובאיכות גבוהה. ישנן מספר נקודות מפתח במהלך הליך זה.הדבר החשוב ביותר הוא לשמור על סביבה סטרילית לאורך כל תהליך הבידוד. שנית, יש לשטוף את הדם לחלוטין ובמהירות האפשרית כדי למנוע קרישה של הדם ברשת הנימים. שלישית, יש למדוד את ה-pH של כל התמיסות, ובמיוחד של תמיסות ה-CD31.

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד והתרבות של Murine לתאי אנדותל ריאתי. שיטה זו כוללת מכונאי דיסוציאציה האנזימטית רקמת הריאות, כמו גם תהליך צעד 2-טיהור באמצעות אנטי PECAM-1 ואנטי ICAM-2 נוגדנים מצומדות כדי חרוזים מגנטיים, אשר מייצר אוכלוסיה טהור תא האנדותל של כלי הדם בעיקר מקור.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

היכולת לבודד תאי אנדותל של מסתמי הלב (VECs) היא קריטית להבנת מנגנוני התפתחות, תחזוקה ומחלות של מסתמים.  כאן אנו מתארים את הבידוד של VECs מעכברי Tie2-GFP עובריים ובוגרים באמצעות FACS שיאפשר מחקרים הקובעים את תרומתם של VECs בתהליכי התפתחות ומחלות.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

תאי האנדותל של כלי הדם ממלאים תפקיד משמעותי בהפרעות לב וכלי דם חשובות רבות. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לבידוד והרחבה של תאי אנדותל מאבי העורקים של העכבר ללא שימוש בציוד מיוחד. הפרוטוקול שלנו מספק אמצעי יעיל לזיהוי מנגנונים בפיזיופתולוגיה של תאי אנדותל.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

אנו מציגים פרוטוקול עבור בידוד של אנדוקקרודיאל ותאי הכליליים כלילית מלבבות חולדה באמצעות עיכול הרקמה הסדרתית במאגר העיכול, איסוף תא מחזורי צנטריפוגה חוזרים, וטיהור תאים באמצעות anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

כאן אנו מתארים ומדגימים פרוטוקול לבידוד תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד עכבר (LSEC). הפרוטוקול מבוסס על זלוף קולגן בכבד, טיהור תאים לא-פרנצ'ימליים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה ובחירת חרוזים מגנטיים CD146. אנו גם מנצלים את הפנוטיפ ומאפיינים את ה-LSECs המבודדים הללו באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

במאמר זה, תאי אנדותל ריאתיים ראשוניים בודדו וגודלו בתרבית מעכברים ילודים.

בידוד תאי אנדותל ריאה ראשוניים של עכבר

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

למדו את פרוטוקול בידוד תאי האנדותל הכלילי בעכבר לחקר לב וכלי דם. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה של תאים טהורים לאימות מולקולרי ודימות.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

גלה סרטונים נוספים