Name: מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למדו שיטות coculture לחקר אינטראקציות בין תאי גליובלסטומה למקרופאגים ומיקרוגליה. השיטה מאפשרת הערכת השפעת האינטראקציות על פלישת הגידול וזיהוי תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר קונסטנטין דוברניס על אספקת מיקרוגליה של עכברים למחקרים אלה.

1. תיוג פלורסנט של תאים הערה: שורות תאים לייבל גליובלסטומה ו microglia עם צבעי ניאון 9. לחלופין, ליצור שורות תאים constitutively להביע חלבוני ניאון כגון GFP / RFP כמתואר 14. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים על צלחת 6 גם כך הם יהיו 70 - 80% ומחוברים ביום של מכתים. עבור הקו הסלולרי גליובלסטומה murine GL261 ו U87 שורת תאים גליובלסטומה האנושי, צלחת 1 x 10 6 ו -1.5 x 10 6 תאים, בהתאמה על hr 6 ס&quot;מ צלחת 24 לפני מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון לצבוע תאים כתם פלורסנט ב DMSO ולהוסיף 5 מיקרומטר לצבוע למדיה, או בינוני מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) או Macrophage סרום חינם בינוני (MSFM), מערבולת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם צבע במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר מדיה לצבוע המכילה ולהוסיף תקשורת טריה (RPMI או MSFM) אל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עבור 30 דקות. הערה: תאים הם עכשיומוכתמת מוכנה לשמש בניסוי. </li></ol> 2. Assay הפלישה Coculture לשכת מטריקס טרום מצופה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל תאים THP-1 באמצעות אצטט phorbol myristate (PMA) 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 2 - 3 x 10 5 THP-1 תאים ב 1.5 מ&quot;ל של RPMI / 10% FBS בצלחת תרבות 6 היטב. מיד לאחר ציפוי להוסיף PMA 100 ננומטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. הערה: לאחר 48 שעות, THP-1 תאים שעברו בהצלחת בידול יהיו חסיד והתפשטו עד לתחתית באר לקחת על מורפולוגיה עגולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PMA ידי שטיפה פעם עם 1x PBS ולהחליף עם FBS טרי RPMI / 10%. לחכות עוד 48 שעות עד תאים מוכנים להשתמש ב assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן תאי מצופה מראש מטריקס ידי הצבתם בתוך התקשורת 500 μl של המכיל גם לבד (אין סרום) והוספת 500 μl של התקשורת לבד לפסגה. דגירה לתאי עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. <br/&gt; הערה: תאים טרום מצופים נרכשו מהיצרן; ראה טבלה של חומרים / ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק בעדינות תאים (שורות תאי גליובלסטומה שכותרתו fluorescently ואת microglia / מקרופאגים), להסיר תקשורת מתאי ידי שאיפה. שטפו תאים על צלחת עם 2 מ&quot;מ EDTA / PBS. הוסף 500 μl של 2 מ&quot;מ EDTA / PBS ו דגירה במשך 5 - 10 דק &#39;ב תא חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 5 מ&quot;ל של התקשורת המכיל 0.3% שור סרום אלבומין (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 120 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב MSFM / 0.3% התקשורת BSA (עבור תאים GL261 ו microglia) או RPMI / 0.3% BSA (עבור U87 ו THP-1 תאים) כך ריכוז של תאים הוא שווה ל 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל . השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 BSA מדיה / 0.3% μl לכל טוב של 24 הצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה מלשכתו כי כבר equilibrated לפחות שעה 2 (שלב 2.2). מקום chambers היטב המכיל 500 μl מדיה / 0.3% BSA (2.7 שלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מעכבי נמצאים בשימוש ללמוד את השפעתם על מקרופאג / microglia מגורה הפלישה גליומה, להוסיף את הריכוז המתאים לשני לתחתית חלקים החלק העליון של החדר. הערה: ריכוזי CSF-1R מעכב נהג לעכב לחלוטין microglia מגורה גליובלסטומה GL261 הפלישה ניתן למצוא התייחסות 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם שורות תאים המשמשים, להוסיף תאים לתא העליון כמתואר על שני השלבים הבאים: גליובלסטומה העכבר (2.10.1) ו גליובלסטומה האנושי (2.10.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 1.5 x 10 5 GL261 (גליובלסטומה) תאים (150 μl) ו -5 x 10 microglia העכבר 4 (50 μl) (ראה שלב 2.6 לפרטים התקשורת). תביאו נפח 500 μl ידי הוספת 300 μl MSFM / 0.3% BSA. להוסיף תערובת תא לתא העליון לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. הערה: microglia Murine מבודדים מעכברים בילוד כמתואר in 1 6. </li></ol></li></ol> מערבבים 7.5 x 10 4 U87 (גליובלסטומה) תאים (75 μl) ו -2.5 x 10 4 THP1 (מקרופאג) תאים (25 μl). תביאו נפח 500 μl ידי הוספת 400 μl RPMI / 0.3% BSA. מוסיפים את תערובת תא לתא העליון. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להסיר תאים מלמעלה של חדר על ידי שאיפה עדינה ולתקן תאים ידי הצבת בפורמלין 3.7% ב- PBS. אפשר לתאים להישאר מקבע במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (או הלילה ב 4 ° C). הסר מקבע על ידי שאיפה עדינה להחליף עם 500 μl 1x PBS. המשך לסעיף 4 לניתוח תמונה. הערה: הניסוי יכול להיות מושהה ברגע זה והציל בתחום ההדמיה 1x PBS. אותות צבע פלואורסצנטי ניתן לאתר עד 2 שבועות לאחר קיבוע. </li></ol> 3. Assay הפלישה &quot;3D&quot; -embedding Glioma ו המקרופאגים / Microglia במטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">תמהיל מטריקס הפשרה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בצע את כל מניפולציות נוספות באמצעות מטריקס על קרח מכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריכוז של מטריקס בתקשורת (MSFM או RPMI) עם 0.3% BSA על הקרח. הערה: ריכוז המניות של מטריקס הוא בדרך כלל סביב 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תאים (שכותרתו בשלב 1) להשעיה מטריקס, להסיר התקשורת מתאי ידי שאיפה. שטפו תאים על צלחת עם 2 מ&quot;מ EDTA / PBS. הוסף 500 μl של 2 מ&quot;מ EDTA / PBS לתאים דגירה במשך 5 - 10 דק &#39;החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 5 מ&quot;ל של התקשורת המכיל BSA 0.3%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 120 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant לשאוב גלולה. Resuspend גלולה בתקשורת / 0.3% BSA כך ריכוז של תאים הוא שווה ל 1 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 x 10 5 תאים GL261 (150 μl) + 5 x 10 4 תאים microglia (50 μl) לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microfuge.להוסיף 2 x 10 5 תאים GL261 (200 μl) לתוך צינור microfuge 1.5 מ&quot;ל נפרד. הערה: תאי GL261 לבד בלי microglia משמשים כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ספין microfuge במשך 5 דקות ב g 120 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב -200 מטריקס קר μl על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 50 μl (50,000 תאים) על גבי במרכז בתא העליון של כנס קאמרי גודל נקבובי 8 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור פילמור להתרחש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl בינוני סרום ללא לתא העליון 700 בינוני צמיחת תאים μl בסרום המכיל לבאר התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להסיר תאים מלמעלה של חדר על ידי שאיפה עדינה ולתקן תאים ידי הצבת בפורמלין 3.7% ב- PBS. אפשר לתאים להישאר מקבע במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (או הלילה ב 4 ° C). הסר מקבע על ידי שאיפה עדינה להחליף עם 500 μl 1x PBS. המשך לסעיף 4 FOניתוח תמונת r. </li></ol> 4. מבחני הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תאי מ פורמלדהיד 3.7% ולשטוף היטב המכיל μl 500 טרי 1x PBS. הערה: אל תאפשר תאים לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מוליך כותנה שקצו, נקה בעדינויות את התאים הלא-פולשני מן החלק העליון של המסנן (צד פונה אל החלק הפנימי של התא) על ידי גירוד פני השטח המסנן. התחל בעדינות להגביר את הלחץ בהדרגה. האם זה לפחות 3 פעמים לכל תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תאי באחת צלחת זכוכית עם תחתית או להשאיר בצלחת 24 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים דגימה על הבמה של epifluorescent או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לייזר המצוידים בתוכנת המצלמה ללכוד תמונה 9,10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח כמה 10X או 20X תמונות של שדות נציג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון ImageJ, לספור את מספר תאי גליובלסטומה שחצו את המסנן 9,10 התחתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הדמיה &quot;3D. &quot;Assay הפלישה (בסעיף 3), ליצור סדרה מחסנית Z באמצעות לייזר פלורסנט מיקרוסקופ confocal 5-6 כדי לדמות את אוכלוסיית התאים פולשניים על החלק התחתון של המסנן, לעקוב אחר פרוטוקול צעדים 4.2 - 4.6 לעיל. </li></ol>

<ol><li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clin+Proc%22%5BJournal%5D)">Central nervous system tumors.</a> Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).</li>
<li>Furnari, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+astrocytic+glioma%3A+genetics%2C+biology%2C+and+paths+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes.+Dev%22%5BJournal%5D)">Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment.</a> Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).</li>
<li>Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The brain tumor microenvironment.</a> Glia. 60 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Li, W., Graeber, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+profile+of+microglia+under+the+influence+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The molecular profile of microglia under the influence of glioma.</a> Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).</li>
<li>Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+function+in+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia function in brain tumors.</a> J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).</li>
<li>Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2Fmacrophages+promote+glioma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia/macrophages promote glioma progression.</a> Glia. 59 (3), 472-485 (2011).</li>
<li>Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+promote+glioma+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Microglia promote glioma migration.</a> Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).</li>
<li>Wesolowska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-derived+TGF-beta+as+an+important+regulator+of+glioblastoma+invasion%3A+an+inhibition+of+TGF-beta-dependent+effects+by+shRNA+against+human+TGF-beta+type+II+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor.</a> Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).</li>
<li>Coniglio, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+stimulation+of+glioblastoma+invasion+involves+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+and+colony+stimulating+factor+1+receptor+%28CSF-1R%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling.</a> Mol Med. 18, 519-527 (2012).</li>
<li>Miller, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semapimod+sensitizes+glioblastoma+tumors+to+ionizing+radiation+by+targeting+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia.</a> PLoS One. 9 (5), (2014).</li>
<li>Goswami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+promote+the+invasion+of+breast+carcinoma+cells+via+a+colony-stimulating+factor-1%2Fepidermal+growth+factor+paracrine+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop.</a> Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).</li>
<li>House, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+functional+S100A4+monomers+are+necessary+for+regulating+nonmuscle+myosin-IIA+and+HCT116+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion.</a> Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+status+of+cofilin+is+directly+related+to+invasion%2C+intravasation%2C+and+metastasis+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors.</a> J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).</li>
<li>Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+immunohistochemistry+as+a+novel+experimental+tool+for+the+detection+of+glioma+cell+invasion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo.</a> Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Dobrenis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+cell+culture+and+in+transplantation+therapy+for+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease.</a> Methods. 16 (3), 320-344 (1998).</li>
<li>Coniglio, S. J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+microglia+stimulated+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion.</a> Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).</li>
<li>See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulatory+T+cells+and+microglia+in+glioblastoma-associated+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression.</a> J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האופי פולשני מאוד של astrocytomas הגבוהה כיתה ו גליובלסטומה לעשות סרטן המוח אלה קטלניים מאוד. לכן יש חשיבות עליונה להבין את המנגנונים המולקולריים ו הסלולר של פלישת גליובלסטומה. רבות כבר למדו על תהליך הפלישה גליובלסטומה כבר 17. באמצעות פורמטי assay המפורטים במאמר זה, המעבדה שלנו הראתה בשני עכבר המודלים אנושיים כי מקרופאגים גידולים הקשורים יכולים לעורר פלישת תא גליומה ידי 5 - פי 10. מודל coculture זה בנאמנות משכפל את היכולת של תאי גליובלסטומה לקיים אינטראקציה עם מקרופאגים...

Multiforme Glioblastoma הוא סרטן המוח אנושי אגרסיווי עם הישרדות ממוצעת של כ 12 חודשים מרגע האבחון 1,2. גליובלסטומה הוא אחד מסוגי הסרטן הקטלני ביותר קליני מאתגר כפי שהוא עקשן כדי טיפול כימותרפי סטנדרטי, כריתה כירורגית. האופי המפוזר של גליובלסטומה מאפשר לתאי גידול להתפשט בכל רחבי המוח הנורמלי מה שהופך את הגידול המתקדם כמעט בלתי אפשרי בניתוח לכרות לחלוטין. היבט פולשני מאוד זוהי תכונת סימן היכר של גליובלסטומה ו astrocytomas המתקדמת אחרת. לכן, ההתמקדות של מחקר רב כבר על המנגנון המולקולרי של פלישת תא גליובלסטומה. במיקרו-סביבה של הגידול גליובלסטומה משחק תפקידים חיוניים בהקמת ממאירות 3-6. גידול הקשורים מקרופאגים / microglia הוצגו להיות אחראים לקידום הפלישה גליובלסטומה 7,8. רוב המחקרים האלה ככל שיהיו השפעת מקרופאגים / microglia באמצעותמבחנים שמפרידים אותם פיזית מתאי גליובלסטומה. המעבדה שלנו יצאה ליצור מבחני משופרת אשר מאפשרים לנו ללמוד כיצד פלישת גליובלסטומה תלויה מקרופאגים / microglia ב cocultures ומאפשרים לנו תמונת האינטראקציה הפיסית ביניהם במהלך פלישה. מבחנים קלסיים למדוד פלישת תא כוללת את פורמטים &quot;הסטנדרטית&quot; chemotaxis הקאמרית בוידן ו chemoinvasion. הנה התאים להיחקר הם מצופים בתא פלסטיק המכיל מסנן פוליקרבונט על הקרקעית כי יש נקבוביות של גודל שצוין (בדרך כלל בין 0.4 ו -8 מיקרומטר קוטר). תהליך פלישת תא כרוך מכשול פיזי, בדרך כלל מורכב חלבון תאי מטריקס. ב assay chemoinvasion, המטריצה ​​העדיפו להשתמש הוא Matrigel (להלן המכונה &quot;מטריקס&quot;), תערובת חלבון תאי מטריקס מופרש על ידי Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) תאי סרקומה העכבר מורכב בעיקרו של colIV ו laminin סוג Lagen. התאים ממוקמים אז באר בתרבית רקמה המכיל תקשורת תרבית תאים עם או בלי גורמי גדילה נחשדים לעורר פלישה. תאים אשר בעל קיבולת פולשנית גבוהה תפלוש דרך המסנן צופה מטריקס בתדר גבוה לדבוק התחתון של המסנן. יש לנו שונה assay זה כדי להעריך את התפקיד של המיקרוגליה מקרופאגים גידולים הקשורים על פלישת תא גליובלסטומה. הצלחנו לקבוע באמצעות מבחני coculture תארו בתוך נייר זה כי microglia יכול לעורר את הפלישה של שורות תאי שתי גליובלסטומה ידי 5 - 10 לקפל 9,10. זה משקף את מה שנצפה בבעלי חיים של גליובלסטומה. יתר על כן, פתחנו assay פלישה תלת ממדים שבו האינטראקציות בין תאי גליובלסטומה מקרופאגים / microglia ניתן לבדוק באופן ישיר יותר. היקף הפלישה תא גליובלסטומה מגורה על ידי macrophaGES / microglia ב assay 3D ניתן להשוות מה נתפס בגישה הקאמרית מצופה מטריקס. מבחנים דומים פותחו בעבר כדי לחקור אינטראקציות סרטן השד עם מקרופאגים במהלך הפלישה 11-13. שתי השיטות שתוארו במאמר זה אמור לסייע ביכולת לנתח את המנגנון המולקולרי (ים) של הפלישה מקרופאג / מגורה microglia של תאי גליובלסטומה.

<table><tbody><tr><td>תא פלישת מטריג'ל Corning BioCoat: עם מטריצת מטריג'ל BD</td><td>קורנינג/פישר חתול מדעי</td>: <td>354481</td><td></td></tr> מדיה <tr><td>ללא סרום מקרופאגים (MSFM) (500 מ"ל)</td> <td>Life Technologies</td><td>12065-074</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker אדום CMTPX Dye</td><td>Life Technologies/בדיקות מולקולריות</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker ירוק CMFDA Dye</td><td>Life Technologies/בדיקות מולקולריות</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>קו תאים GL261</td><td>המכון הלאומי לסרטן (NCI)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>U87 קו תאים</td><td>אוסף תרביות מסוג רקמות אמריקאי</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>אוסף תרביות מסוג רקמה אמריקאי</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני (500 מ"ל)</td> <td>Life Technologies/Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>סיגמא Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell מוסיף תרבית תאי ממברנה פוליקרבונט (8 ומיקרו; נקבוביות M) 48 לחבילה.</td><td>Corning</td><td>CLS3422</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear</td><td>Trevigen</td><td>3445-005-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FBS)</td> <td>Life Technologies</td><td>Cat: 10500064</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, Fraction V, מטופל בהלם חום</td><td>Fisherscientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט (PMA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני coculture ללמוד מקרופאג microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

multiforme Glioblastoma (גליומה IV כיתה) הוא סרטן אדם אגרסיווי מאוד עם חציון הישרדות של אבחנת פוסט 1 שנים. למרות ההבנה המוגברת של אירועים המולקולריים להצמיח גליובלסטומה, סרטן זה עדיין נשאר מאוד עקשן לטיפול קונבנציונלי. כריתה כירורגית של גידולים במוח בדרגה גבוהה היא כמעט ולא להשלים בשל אופי infiltrative ביותר של תאי גליובלסטומה. גישות טיפוליות אשר להחליש פלישת תא גליובלסטומה ולכן היא אופציה אטרקטיבית. המעבדה שלנו ואחרים הראו גידול כי מקרופאגים הקשורים ו microglia (מקרופאגים מוח תושב) לעורר פלישה גליובלסטומה בחום. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש מודל גליובלסטומה-מקרופאג / microglia אינטראקציה באמצעות מבחני תרבות חוץ גופית. גישה זו יכולה להקל על הפיתוח מאוד ו / או גילוי של תרופות לשבש את התקשורת עם מקרופאגים המאפשר behav הממארת זוIOR. הקמנו שני מבחני פלישת coculture חזקים שבו microglia / מקרופאגים לעורר פלישת תא גליומה ידי 5 - פי 10. תאי גליובלסטומה שסומנו בסמן פלורסנט או constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי הם מצופים בלי ועם מקרופאגים / microglia על מוסיף קאמרי פוליקרבונט מצופית מטריצה ​​או מוטבע במטריצה ​​תלת ממדים. פלישת תא נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתדמית ולספור רק תאים פולשני על החלק התחתון של המסנן. באמצעות מבחנים אלה, כמה מעכבים תרופתיים (JNJ-28,312,141, PLX3397, gefitinib, ו Semapimod), זוהה חוסמות מקרופאג / microglia מגורה פלישת גליובלסטומה.

השימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי המיקרוגליה מקרופאגים יכולים באופן משמעותי לעורר פלישת תא גליובלסטומה. שני מבחני פלישה שונים שעובדים מתוארים באיור 1. באיור 2, תאי GL261 כי constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry היו מצופים על תאים מראש מצופה עם ובלי microglia במשך 48 שעות. תאי GL261 היו פולשנית בכוחות עצמם עם זאת כאשר בתרבית עם microglia יכולת פולשני גדלה בכ -10 לקפל. <p class="jove_content" fo:keep-...

הבנת ההתנהגות הממאירה של סרטן דורשת יצירת מודלים מדויקים של האופן שבו תאי הגידול מתקשרים עם מרכיבים של מיקרו-סביבת הגידול, כגון מקרופאגים. כאן אנו מתארים שתי שיטות לחקר אינטראקציה של תאי גליובלסטומה עם מקרופאגים ומיקרוגליה הקשורים לגידול שבהם מוערכת ההשפעה על פלישת גליובלסטומה.

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא למדל את האינטראקציה של תאי גליובלסטומה עם מיקרוגליה ומקרופאגים במהלך פלישה במערך in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסביבה המיקרוסביבתית של הגידול, כגון אילו תרכובות או טיפולים יכולים להפריע לאינטראקציה של הסרטן עם מקרופאגים, סוג של תאי מיקרוסביבה במהלך ההתקדמות לממאירות. אחד היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הוא שהיא קלה יחסית לביצוע, ניתן להשלימה בזמן סביר, ונראה שהיא ממדלת באופן מדויק פלישת גליובלסטומה in vivo.התחל בהגביית קו התאים הרלוונטי באמצעות phorbol myristate acetate, באופן הבא. ראשית, זרע 2-3$\times$10⁵ תאי THP-1 ב-1.5 milliliters של מצע בצלחת תרבית בעלת שישה בארות. מיד לאחר הזריעה, הוסף 100 nanomolar של PMA והדגר בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך 48 שעות.לאחר 48 שעות, הסיר את ה-PMA באמצעות שאיבת המצע, שטוף פעם אחת עם PBS בריכוז one-X והוסף מצע טרי. דגרי עבור 48 שעות נוספות עד שהתאים יהיו מוכנים לשימוש במערך הבדיקה. לאחר מכן, בצע שיווי משקל לתאים המצופים מראש במטריקס על ידי הנחתם בבאר המכילה 500 microliters של מצע ללא סרום, ולאחר מכן הוסף 500 microliters של מצע ללא סרום לחלק העליון.דגרו את התאים בתאים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%CO2. לאחר מכן, שאבו בעדינות את המצע מכלי התרבית המכילים את שורות תאי הגליובלסטומה המסומנות פלואורסצנטית ואת המיקרוגליה והמקרופגים. לאחר מכן, הוסיפו 500 microliters של EDTA בריכוז שני millimolar ו-PBS ודגרו למשך 5 עד 10 דקות באינקובטור לתרביות רקמה.אספו את התאים בחמישה מיליליטר של מדיה המכילה 0.3% bovine serum albumin וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-120 ×g. לאחר הסבב בצנטריפוגה, שאבו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים במדיה מתאימה עד לריכוז של 1 × 10⁶ תאים למילילטר. השתמשו בהמוציטומטר לספירת התאים. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של המדיה המתאימה המכילה 0.3% BSA לבארי של פלטת 24 בארי.לאחר מכן, הסירו את המצע מהתאים שעברו שיווי משקל והניחו את התאים בבארות של פלטת 24 בארות. במידה ונעשה שימוש במעכבים כדי לבחון את השפעתם על פלישת גליאומה שעברה גרייה על ידי מקרופגים או מיקרוגליה, הוסיפו את הריכוז המתאים הן לחלק התחתון והן לחלק העליון של התא. בהתאם לסוג תאי השורש שנעשה בהם שימוש, ערבבו תאי גליובלסטומה עם מיקרוגליה של עכבר או תאי גליאומה עם תאי מקרופגים, בהתאם לפרטים המופיעים בחלק הכתוב של הפרוטוקול.הוסיפו את תערובת התאים לתא העליון והדגירו למשך 24 עד 48 שעות, בהתאם לסוג התא. לאחר ההדגרה, הסירו את התאים מחלקו העליון של התא באמצעות שאיבה עדינה. לאחר מכן, הניחו את התאים ב-3.7% formaldehyde ב-PBS לצורך קיבוע.השאירו את התאים בתמיסת הקיבוע למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, הסירו את תמיסת הקיבוע על ידי שאיבה עדינה והחליפו אותה ב-500 microliters של PBS בריכוז one-X. ראשית, הפשיקו את תערובת המטריקס בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך לילה.בשלב הבא, הכין על קרח תמיסת מטריקס בריכוז של 10 milligrams per milliliter במצע המתאים. לאחר מכן, קצור את התאים המסומנים לצורך תליה במטריקס כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, העבר בעזרת פיפטה 1.5 times 10 to the fifth תאי GL261 בנפח של 150 microliter, בתוספת five times 10 to the fourth תאי microglia ב-50 microliters, אל תוך מבחנת מיקרופוג של 1.5 milliliter.הוסיפו 2×10⁵ תאי GL261 בנפח של 200 µL לתוך מבחנה נפרדת של 1.5 mL למיקרוצנטריפוגה. סובבו את התאים במיקרוצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-120 ×g. לאחר מכן, השעיקו מחדש את התאים ב-200 µL של מטריקס קר על קרח. בשלב זה קריטי שיהיה מגש קרח מוכן במC-hood, שהמבחנות יישמרו על קרח, שהטיפים יהיו במקרר, ולוודא שהכל מקורר כדי למנוע פולימריזציה מוקדמת של הג'ל הבשל.לאחר התלייה מחדש, זרקו 50,000 תאים בנפח של 50 µL למרכז התא העליון של תבת עם נקבים בגודל 8 µm. לאחר מכן, דגרו את התבת בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לאפשר את התהליך של הפולימריזציה. לאחר 30 דקות, הוסיפו 200 µL של מצע ללא סרום לתא העליון ו-700 µL של מצע לצמיחת תאים המכיל סרום לבאר התחתונה.לאחר דגירה למשך 48 שעות, הסירו את התאים מהחלק העליון של התא באמצעות שאיבה עדינה. קבעו את התאים כפי שנעשה קודם לכן והחליפו את חומר הקיבוע ב-500 microliters של PBS בריכוז one-X לפני דימות התאים. תמונה מייצגת זו מראה תאי GL261 המבטאים mCherry הפולשים בהיעדרו של מיקרוגליה.התאים נזרעו בתאי דגימה מצופים במטריקס ודגרו במשך 48 שעות. התמונות צולמו באמצעות עדשה פי 10 (10X) וסרגל הקנה מייצג 400 מיקרון. כאן שולבו תאי GL261 עם מיקרוגליה.מספר התאים הפולשניים מסוג GL261 שחצו את המסנן נמדד כמותית. כפי שנראה כאן, תרבית משותפת של שורת תאי הגליובלסטומה של עכבר GL261 עם מיקרוגליה מגבירה את הפלישה שלה עד פי 10 במבחן הדו-ממדי. תמונה זו מראה את ההשפעה של מעכבים פרמקולוגיים על פלישת תאי GL261 שעוררה על ידי מיקרוגליה בהשוואה לבקרת DMSO.הנתונים המוצגים הם משישה ניסויים בלתי תלויים. בדיקה זו יושמה בהצלחה גם באמצעות שורות תאים אנושיות. תאי U87 שנזרעו בתאי דגימה מצופים במטריקס ונצבעו ב-CMFDA green מוצגים לאחר אינקובציה של 24 שעות.כאן נזרעו תאי U87 יחד עם מקרופאגים מובחנים מסוג THP1. תמונה זו מציגה את הכימות של הבדיקה, כאשר נספרו רק תאי U87 פולשים. שורת התאים של מקרופאגים אנושיים מסוג THP1 עוררה את פלישת תאי גליובלסטומה U87.הנתונים המוצגים הם ערכי ממוצע מ-10 ניסויים בלתי תלויים. תמונה זו, מניסוי פלישה בתלת-ממד של תרבית משותפת של GL261 ומיקרוגליה, היא תמונה מורכבת מסדרת תמונות Z ומציגה תאי GL261 שצבעו ב-CMFDA ירוק המוטמעים במטריקס בלבד. כאן, תאי GL261 גודלו בתרבית משותפת עם מיקרוגליה עכברית המסומנת ב-CMPTX אדום.כאן מוצגים תאי GL261 בצד התחתון של המסנן, אשר נקבע כי הם פולשים. המספר הכולל של תאי GL261 הפולשים נקבע ונורמל למספר תאי GL261 בתרבית יחידה (monoculture). הנתונים המוצגים מייצגים את הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים שבוצעו בכפילות.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה מההתחלה ועד הסוף תוך כשעתיים. את התוצאות הסופיות של הניסוי ניתן לקבל לאחר 48 שעות. לכן, בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב מאוד שכל הכלים יהיו מקוררים ובטמפרטורה של 4°C, כולל המבחנות והפיפטים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להקים מערכי בדיקה לפלישה של גליובלסטומה בתרבית משותפת (coculture) של מקרופאגים ומיקרוגליה.

coculture-assays-to-study-macrophage-microglia-stimulation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מבצעים את בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור נוירובלסטומה באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. הבדיקה מסייעת להעריך את הפגיעה בתפקוד המיקרוגליאה במחלות נוירודגנרטיביות.

בדיקת פגוציטוזה מיקרוגליאלית: בדיקת מבחנה לביסוס מודל פגוציטוזה מיקרוגליאלית עבור תאי נוירובלסטומה באמצעות מקרופאגים iPSC

סרטון זה מתאר ניסוי תרבית משותפת של תאי גליובלסטומה על נוירונים מיקרו-דפוסיים, המחקים את פלישת תאי הגזע דמויי הגליובלסטומה לדרכי העצב המיאלינטיות כשהם נודדים על תאי עצב בחללים הפריטומורליים. בדיקה זו יכולה לסייע בניתוח ההשפעות של תרופות פרמקולוגיות המעכבות נדידת תאי גליובלסטומה על נוירונים בגליומה.

תרבית משותפת של תאי גליובלסטומה על תאי עצב בעלי תבנית: טכניקה לניטור נדידת תאי גליובלסטומה על תאי עצב בהיפוקמפוס חולדה במבחנה

סרטון זה מדגים בדיקה במבחנה המשתמשת ב-β-גלוקנים כדי להפעיל תאי מיקרוגליה לייצור רדיקלים סופראוקסידים, מין חמצן תגובתי. בתאי סרטן המוח, המחמצנים הריאקטיביים הנוצרים מדכאים באופן פעיל את התפשטות תאי הגידול וגורמים למוות תאי.

בדיקה לניתוח בדיקת β-גלוקן כאסטרטגיה אימונותרפית נגד תאי סרטן המוח

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

בסרטון זה, תאי גליובלסטומה ומיקרוגליה מעורבבים עם תמיסת מטריצת פולימר ומועברים להכנסת תא נקבובית שבה נוצר ג'ל, ומטמיעים את התאים. מיקרוגליה מעוררת את נדידת תאי הגליובלסטומה דרך התוספת הנקבובית, מחקה פלישת תאי גידול לרקמה שמסביב, לאחר מכן התאים מקובעים ומוכנים לניתוח נוסף.

מודל פלישת גידול מבוסס מטריקס באמצעות תרבית משותפת של מיקרוגליה גליובלסטומה

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

מאמר זה מייצג שימושי בתוך מבחנה כדי להעריך את היכולת של המדיום הממוזג מתאי הגידול כדי למשוך מקרופאגים.

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

למדו שיטות coculture לחקר אינטראקציות בין תאי גליובלסטומה למקרופאגים ומיקרוגליה. השיטה מאפשרת הערכת השפעת האינטראקציות על פלישת הגידול וזיהוי תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

גלה סרטונים נוספים