Name: מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: חקור מעקב תאים בודדים לאורך זמן בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית time-lapse כדי ללמוד תגובות לטיפולים אנטי-סרטניים בקווי תאים HT1080 ו-HeLa. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של התנהגות תאים ומגוון תגובות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לג'ושוע מרקוס על התמיכה הטכנית ולג'וליאן טיילר, Ph.D., מנהל מתקן הליבה למיקרוסקופיה קלה על שם ריצ'רד ג'יי מקינטוש, על הייעוץ הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מאוניברסיטת קולורדו בולדר ובית הספר לתארים מתקדמים של אוניברסיטת קולורדו בולדר ל-J.D.O. R.T.B. נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה קדם-דוקטורט מה-NIH (T32 GM008759). אנו מודים ל-Karyopharm Therapeutics, Inc. על הסלינקסור ול-Merck Serono על מעכב Kinesin-5. הפלסמידים של FUCCI הם מאטסושי מיאווקי (RIKEN, יפן) דרך MTA. mCherry-BP1-2 היה מ-Addgene. HeLa המבטא H2b-mCherry ו-β-tubulin-EGFP הם מדניאל גרליך (IMBA, האקדמיה האוסטרית למדעים, אוסטריה).

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

יתרונות של זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב לאורך שנים המיקרוסקופ הוא מכשיר אידיאלי עבור מחקרים ארוכי טווח התגובה התרופה כפי שהוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תאים בודדים גורלם וכן את כלל האוכלוסייה. השתנות בתגובת סמים בתוך אוכלוסייה של תאים היא בעיה רצינית עבור עיצוב טיפולי נגד הסרטן. מעקב אורכית תאים בודדים מאפשר לחוקרים להתבונן השונות הזאת ולהתחיל להבין את המנגנונים ואת ההשלכות הבסיסיות כפי שהוא נוגע א...

מיקרוסקופיה Live- תא מעקב אורך של תאים בודדים היא לא טכניקה חדשה. מתוך המיקרוסקופים המוקדמים, חובבי מדענים הבחינו ולומדים תאים בודדים ואורגניזמים, ההתנהגויות שלהם, ופיתוח 1-3. דוגמה מפורסמת מן דיוויד רוג&#39;רס המנוח באוניברסיטת ונדרבילט בשנת 1950 מראה נויטרופילים האדם כתם דם רודפים חיידק סטפילוקוקוס ולבסוף בתהליך של phagocytosis 4. חי בסרט תא זו הוא המחשה מצוינת לאופן שבו מספר רב של תהליכים שניתן לצפות בקורלציה בניסוי יחיד: חישה של שיפוע כימי, מכניקה ומהירות תנועתיות תא, תא מעצבת דינמיקה, הדבקה, ואת phagocytosis של פתוגן. הופעתו של מיקרוסקופים אוטומטיים לחלוטין ומצלמות דיגיטליות רגישות גבוהה הביאה מספר גדל והולך של חוקרים באמצעות מיקרוסקופ לשאול שאלות יסוד f החל הביולוגיה של תאrom כיצד תאים להעביר 5,6 ולחלק 7,8 כדי אברון הדינמיקה וסחר הממברנה 9-11. ללא פלורסנט, מיקרוסקופיה brightfield, כולל שלב בניגוד (PC), אשר זכה בפרס נובל פריץ Zernike בשנת 1953, ואת התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) לאפשר תצפית של תאים גרעינים, אלא גם במבנים המשנה הסלולר כולל חבילות microtubule , כרומוזומים, nucleoli, דינמיקת אברון, וסיבים יקטינו עבים 12. מקודד גנטית חלבוני ניאון לבין התפתחות של צבעי ניאון נגד אברונים השפיעו באופן דרמטי זמן לשגות מיקרוסקופית 13-15. אמנם לא המוקד של מאמר זה, הדמית spheroids תא באתרו (מיקרוסקופיה intravital) באמצעות confocal במיקרוסקופ multiphoton מייצגת הרחבה נוספת של הגישה, ויש מאמרים מצטיינים המשתמשים ולדון הגישות הללו 16-19. התגובות של תאי אל-canc אנטיתרופות אה או מוצרים טבעיים נקבעות על הסולם המולקולרי תאי. לאחר טיפול תגובות גורלות תא הבנה כרוך לעתים קרובות מבחני מיצוע אוכלוסייה (למשל., Immunoblotting, אמצעים היטב שלמים), או בזמן נקודות קבועות עם זיהוי immunofluorescent ו cytometry זרימה, אשר מודדים תאים בודדים. הטרוגניות בתגובות תא בודדות לסמים בקרב אוכלוסייה, בפרט בגידולים, עשויות להסביר חלק ההשתנות בתגובה לראות פני שורות תאים וגידולים כי מטופלים עם התרופה הזהה ב רוויה. לטווח ארוך גישות האורך לעקוב תא בודד נתון או אוכלוסייה של תאים הוא גישה נפוצה פחות, אבל רב עצמה המאפשרת לחקר הישיר של מסלולי תגובה מולקולריים, פנוטיפים שונים (למשל., מוות של תאים או חלוקת תא), תצפית של תא אל תא השתנות בתוך אוכלוסייה, ואיך הגורמים הללו תורמים דינמיקה בתגובת אוכלוסיית 20-22. באופטימיות, יכולתלהתבונן ולכמת התגובות תא בודד יעזור לשפר את הבנתנו כיצד תרופות לעבוד, למה הם לפעמים נכשלים, וכיצד להשתמש בהם בצורה הטובה ביותר. הטכניקה של מיקרוסקופיה לטווח ארוכת זמן לשגות, מעקב אורך, וניתוח תגובות סמים היא העומד לרשות חוקרים רבים והוא יכול להיות פשוט, באמצעות אור המועבר רק להתבונן תגובות פנוטיפ 20,21. הרכיבים העיקריים של הגישה כוללים: ההיערכות מתאימה של התאים בעלי עניין, מיקרוסקופ אוטומטי עם תא סביבתי, מצלמה משולבת עם מחשב לרכוש ולאחסן את התמונות, ותוכנה לעיין לשגות זמן למדוד ולנתח את התאים וכל biosensors ניאון. אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם טיפים רבים לניהול מיקרוסקופיה זמן לשגות של תאים בתרבית למשך עוד כמה ימים באמצעות brightfield ו / או מיקרוסקופיה epifluorescent widefield. פרוטוקול זה יכול לשמש לכל שורת תאים שניתן גדלים בתרביתללמוד התגובות שלהם לטיפולים אנטי-סרטניים. אנו מספקים דוגמאות של נתונים רכשה ונותחו באמצעות חיישנים ביולוגיים פלורסנט גנטית בקידוד שונה מרובים דוגמה מיקרוסקופיה שלב בניגוד, לדון סוגים שונים בקצרה של בדיקות, את היתרונות והחסרונות של זמן לשגות לטווח ארוך ומעקב האורך, מה יכול להיות מלומדת הגישה הזאת כי קשה להבין מן הערוצים הלא ישירים, וכמה וריאציות שאנו מקווים יהיה עניין וערך לחוקרים מנוסים שלא נחשבו בגישה, וכדי חוקרים מנוסים.

<table><tbody><tr><td>טקסול (פקליטקסל)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>תרופה מייצבת מיקרו-צינורית</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>מעכב טופואיזומראז II</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td></td><td>ומעכב XPO1/CRM1, מתנה</td></tr><tr><td>מעכב Kinesin-5</td><td>Merck Serono</td><td></td><td>במתנה, זמין גם מ-American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>מדיום גידול תאים</td><td>HyClone (פישר) או מדיטק</td><td></td><td>חברות רבות זמינות</td></tr><tr><td>5% CO2 / אוויר מאוזן, איירגז מוסמך</td><td></td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת, תחתית זכוכית 20 מ"מ</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>חברות רבות זמינות</td></tr><tr><td>35 מ"מ 4 בארות צלחת, 20 מ"מ תחתית זכוכית</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>חברות רבות זמינות</td></tr><tr><td>צלחת 35 מ"מ, תחתית זכוכית מרושתת</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>חברות רבות זמינות</td></tr><tr><td>רב-בארות, תחתית זכוכית</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>חברות רבות זמינות</td></tr><tr><td>אולימפוס IX81 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך</td><td>בקר אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס IX2-UCB</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>קודם מדעי</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III שלב ממונע</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV תא</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בקר סביבתי</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV. ECU. HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD עם בקר</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>השקת לייזר Nikon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA מנוע אור</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא המועדון של TOKAI HIT</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד therapeutics אנטי-סרטניות

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

התגובה של תאים בודדים לתרופות אנטי-סרטניות תורמת באופן משמעותי בקביעת תגובת האוכלוסייה, ולכן הוא גורם מרכזי תורם בתוצאה הכללית. Immunoblotting, cytometry זרימה וניסויי תא קבוע משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד כיצד תאים מגיבים לתרופות אנטי-סרטניות. שיטות אלה חשובות, אבל יש להם חסרונות רבים. משתנה הם תגובות סמים בין סרטן תאים נורמלים, ובין תאים ממוצא הסרטן שונה, וחולף ותגובות נדירות שקשה להבין באמצעות מבחני מיצוע אוכלוסייה וללא יכולת לעקוב ישירות ולנתח אותם אורכים. המיקרוסקופ הוא גם מתאים במיוחד לתאים חיים תמונה. התקדמות הטכנולוגיה מאפשרת לנו תאי תמונה שגרתי ברזולוציה המאפשרת לא מעקב תא בלבד, אלא גם את התצפית של מגוון תגובות הסלולר. אנו מתארים גישה בפירוט המאפשר הדמיה זמן לשגות רציפה שלתאים במהלך תגובת התרופה בעצם כל עוד רצוי, בדרך כלל עד 96 שעות. באמצעות וריאציות של הגישה, ניתן לנטר תאים במשך שבועות. עם העסקה של תהליכים רבים biosensors פלורסנט מקודד גנטי, שבילים ותגובות יכולה להיות אחריו. אנו מציגים דוגמאות הכוללות מעקב וכימות של גדילת התא התקדמות מחזור התא, דינמיקה כרומוזום, נזק לדנ&quot;א, מוות של תאים. כמו כן נדונו וריאציות של הטכניקה והגמישות שלה, ולהאיר כמה מלכודות נפוצות.

הזמן לשגות לטווח ארוך מיקרוסקופיה מעקב אורך ישיר מאפשר לחקר השפעות רבות נגד הסרטן במהלך תגובת תרופה. בעקבות בקווים הכלליים באיור 1, מספר דוגמאות של תאים מוצגות להביע כתבי ניאון תוקפים כי שטופלו בתרופות אנטי-סרטניות, במעקב, ונותחו באמצעות גישות שונות. מיקרוסקופ לעומת שלב לבד הוא מאוד אינפורמטיבי מדווח וחסון על שלבי ביניים לעומת מיטו...

כאן, אנו מתארים שיטה של מיקרוסקופיה ארוכת טווח כדי לעקוב לאורך תאים בודדים בתגובה לטיפולים אנטי-סרטניים.

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון תגובה לטיפול אנטי-סרטני בתאי בודדים בתרבית. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן, כולל תגובה טיפולית הטרוגנית וגורל התא. כדי להתחיל, תחת מ流动 laminar flow hood סטרילי ומאושר, הכין תאי HT1080 בצלחות מאושרות לתרבית בהתאם לפרוטוקול הכתוב והדגר את התאים באינקובטור לתרביות תאים מלחח.יומיים לפני הדימוי, זרע 50,000 תאי HT1080 FuGENE לכל באר במספר הבאערים הרצוי בצלחת עם תחתית זכוכית בעלת 12 באערים, מס' 1.5. התאם את מספר התאים שנזרעו בהתאם לקצב גדילתם ולצלחת שנעשה בה שימוש, כדי להגיע לכ-60% confluence בתחילת הניסוי.הגדירו את תא הסביבה ללחות של כ-80%, כאשר הטמפרטורה במיקום הדגימה מוגדרת ל-37 degrees Celsius. ודאו שמאגר המים מלא במים מזוקקים סטריליים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הפעילו את תא הסביבה להגדרת הטמפרטורה הרצויה, הניחו אותו על במה המיקרוסקופ וייצבו אותו.אם קיים מרווח בין תא החלק העליון של הבמה לבין התוסף של הבמה, הנח חתיכות של סרט פראפין על קצוות פתח התוסף של הבמה, לפני הכנסת התא לתוכו, כדי לחבר את התא לבמה. ודא ששום חיבור אינו מושך את התא, שכן שני המצבים עלולים להוביל לארטיפקטים של תנועה. הכנס את התא המדומה עם מים לתוך התא, ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C ולאחר מכן שמור על טמפרטורה יציבה.כדי להכין את המערכת לדימוי, הפע

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים שיטה למעקב אחר סחר תאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במודל עכבר. תאי T משפיעים של לוציפראז מוזרקים לעכבר עם קסנוגרפט של תא גידול תת עורי. לאחר מכן מוחדרים נוגדנים דו-ספציפיים, הנקשרים לתאי T ולתאי הגידול. מעקב אחר לוקליזציה של תאי T מתבצע באמצעות הדמיה ביולומינסנטית, כאשר עוצמת האות מציינת את מידת החדירה של תאי T לתוך הגידול.

טכניקת In Vivo למעקב אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים

אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ multiphoton לבצע הדמית הזמן לשגות מורחבת של אינטראקציות רבות-תאי בזמן אמת, in vivo ברזולוצית תא בודד.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר שיטה התמונה תושב גידולים הסתננות CD8 בתאי T עם נוגדנים fluorescently בשילוב בתוך אמבריולוגיה הגידול פרוסות תוויות. טכניקה זו מאפשרת ניתוחים בזמן אמת של נדידת תאים CD8 T באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

שיטת לוקליזציה vivo immunofluorescence ניתן להשתמש כדי לבחון ב vivo biodistribution של נוגדנים ושערי מעלה נוגדן למטרות אונולוגיות באורגניזמים חיים באמצעות שילוב של vivo הגידול מיקוד ולשעבר vivo חיסוני שיטות.

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.

הדמיה הזמן 2D דימות של פעילות Phagocytic ב-M1 מקרופאג-4T1 עכבר קרצינומה של החלב תאים במשותף תרבויות

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים המיושמים על קו תאי גליומה מפוזר בקו האמצע בילדים, שימושי כדי לחקור בזמן אמת את ביטוי החלבונים על קרום הפלזמה במהלך תהליכים דינמיים כמו פלישה ונדידה של תאים תלת-ממדיים.

בדיקות אימונוציטוכימיה של תאים תלת-ממדיים חיים של גליומה מפושטת בקו האמצע בילדים

כאן, אנו מתארים שיטה להמרת תאי T אנושיים עם לוציפראז כדי להקל על מעקב in vivo אחר סחר בתאי T המושרה על ידי נוגדנים דו-ספציפיים לגידולים במחקרים כדי להעריך את היעילות והמנגנון נגד גידולים של נוגדנים דו-ספציפיים העוסקים בתאי T.

מעקב אחר סחר בתאי T הנגרמים על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז

פרוטוקול זה מתאר סימון נוגדן יחיד (SAL) לפתרון הארגון המרחבי בקנה מידה ננומטרי של חלבוני ממברנת הפלזמה. על ידי ניצול אינטראקציות מצטברות בין נוגדנים לאפיטופים ברמת המולקולה היחידה, SAL ממברנה (mSAL) ממפה התפלגות אפיטופים מקומיות תוך כדי לכידת התנהגות קשירת נוגדנים בסביבה התאית הטבעית.

מיקרוסקופיית מיקום מולקולה אחת של חלבוני ממברנה באמצעות תיוג נוגדן יחיד

פרוטוקול זה מתאר שיטת דימות תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי מקרופגים תלויי-נוגדנים, תוך שימוש במקרופגים המופקים מתאי דם פריפריים חד-גרעיים (PBMC) ובמיקרוסקופ אוטומטי.

דימוי בשקיעת זמן (Time-Lapse Imaging) של פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנציה ירוק על ידי מקרופאגים בהנחיית נוגדנים

חקור מעקב תאים בודדים לאורך זמן בתרבית באמצעות מיקרוסקופיית time-lapse כדי ללמוד תגובות לטיפולים אנטי-סרטניים בקווי תאים HT1080 ו-HeLa. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של התנהגות תאים ומגוון תגובות טיפוליות.

מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות

גלה סרטונים נוספים