מבעד למראה: זמן לשגות מיקרוסקופית ו מעקב אורך של תאים בודדים כדי ללמוד Therapeutics אנטי-סרטניות
14 במאי 2016
כאן, אנו מתארים שיטה של מיקרוסקופיה ארוכת טווח כדי לעקוב לאורך תאים בודדים בתגובה לטיפולים אנטי-סרטניים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבחון תגובה לטיפול אנטי-סרטני בתאי בודדים בתרבית. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום מחקר הסרטן, כולל תגובה טיפולית הטרוגנית וגורל התא. כדי להתחיל, תחת מ流动 laminar flow hood סטרילי ומאושר, הכין תאי HT1080 בצלחות מאושרות לתרבית בהתאם לפרוטוקול הכתוב והדגר את התאים באינקובטור לתרביות תאים מלחח.
יומיים לפני הדימוי, זרע 50,000 תאי HT1080 FuGENE לכל באר במספר הבאערים הרצוי בצלחת עם תחתית זכוכית בעלת 12 באערים, מס' 1.5. התאם את מספר התאים שנזרעו בהתאם לקצב גדילתם ולצלחת שנעשה בה שימוש, כדי להגיע לכ-60% confluence בתחילת הניסוי.
הגדירו את תא הסביבה ללחות של כ-80%, כאשר הטמפרטורה במיקום הדגימה מוגדרת ל-37 degrees Celsius. ודאו שמאגר המים מלא במים מזוקקים סטריליים בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הפעילו את תא הסביבה להגדרת הטמפרטורה הרצויה, הניחו אותו על במה המיקרוסקופ וייצבו אותו.
אם קיים מרווח בין תא החלק העליון של הבמה לבין התוסף של הבמה, הנח חתיכות של סרט פראפין על קצוות פתח התוסף של הבמה, לפני הכנסת התא לתוכו, כדי לחבר את התא לבמה. ודא ששום חיבור אינו מושך את התא, שכן שני המצבים עלולים להוביל לארטיפקטים של תנועה. הכנס את התא המדומה עם מים לתוך התא, ואפשר לתא להגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C ולאחר מכן שמור על טמפרטורה יציבה.
כדי להכין את המערכת לדימוי, הפעילו את המיקרוסקופ, את המחשב ואת כל הציוד ההיקפי הנדרש. בהתאם למקור האור, המתינו עם הפעלתו עד שיהיה בו צורך. כאשר תוף העדשות נמצא במצב נמוך, בחרו בעדשה עם הגדלה של 20x וממספר צמצם (numerical aperture) של 0.7.
כעת מקמו את הדגימה מעל לעדשה, דבר שיקל על איתור התאים כאשר הדגימה תהיה בתוך התא. לאחר העברת התאים המיועדים לדימוי לתא הסביבתי, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, אטמו את התא כדי לשמור על סביבה יציבה והפעילו את הגז האטמוספרי. לאחר מכן, בחרו תנאי דימוי שימנעו רעילות פוטו-כימית על ידי הגבלה של זמני החשיפה ושימוש באור בעוצמה נמוכה יותר.
כדי למצוא את מישורי X, Y ו-Z ואת אורכי הגל הרצויים עבור כל מיקום המיועד לדימוי. לצילום time lapse ארוך טווח של מרבית התהליכים התאיים, רכשו תמונה אחת מדי עשר עד עשרים דקות. רזולוציית זמן גבוהה יותר מספקת יותר נקודות נתונים ומעקב תאים איתן יותר, אך גורמת לחשיפה מצטברת גבוהה יותר לאור ולמערכי נתונים גדולים יותר.
כיוון שתאי HT1080 FuGENE מכילים חלבוני פלואורסצנציה ירוקים ואדומים דינמיים, השתמשו בזמני החשיפה הבאים ובפיקסלבינינג (binning) של שתיים על שתיים. תחת הגדרות מתקדמות, הפעילו מיקוד אוטומטי בשליטת התוכנה באמצעות הגדרות ברירת המחדל. הגדירו טווח מיקוד אוטומטי של 10 micrometers עם גודל הצעד המומלץ.
בצלחת הניסוי, כדי להפחית סחף תרמי, החליפו מחצית מהמדיום במדיום המכיל את התרופה הרצויה אשר חוממה ל-37 °C. לבסוף, התחילו את צילומי ה-time lapse ורכשו תמונות בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סרטונים אלה מציגים דוגמאות לזוג תאי MCF7 תואמים המופקים מסרטן השדיים, הנבדלים רק במצב ה-p53 שלהם, אשר טופלו בתרופה אנטי-סרטנית המעכבת את kinesin-5 ובכך גורמת לעצירה מיטוטית.
כפי שניתן לראות באיור זה, כאשר p53 מוסר באמצעות knockdown יציב של p53, במקום להיעצר לאחר עזיבת המיטוזה, התאים עוברים מחזורים חוזרים שבהם הם נכנסים לסבב שני של מיטוזה במקום להיעצר, ועוזבים את המיטוזה ללא חלוקה. מוצגים כאן תאי Hela המופקים מקרצינומה של צוואר הרחם המבטאים באופן יציב את סמן הכרומטין Histone 2b המאוחה ל-mCherry ואת beta tubulin המאוחה ל-EGFP. כאשר מטפלים בתרופה המייצבת מיקרוטובוליים, paclitaxol, הסידור וההפרדה של הכרומוזומים משתבשים במהלך המיטוזה, מה שמוביל להיווצרות בליטות גרעיניות ומיקרו-גרעינים הרגישים לנזקי DNA.
קו תאים זה מבטא באופן יציב שני סממנים פלואורסצנטיים של יוביקוויטין למחזור התא עבור CDT1, בכתום, וגמינין (geminin) בירוק, ומתקדם במחזור התא באופן תקין. כאשר תאים אלו מטופלים במעכב CDK46, התאים מתקדמים דרך שלב G2 ומתחלקים כרגיל, ולאחר מכן עוצרים באופן חזק בשלב G1, מה שמעיד על פוטנציאל להשפעות ציטוסטטיות יעילות בגידולים גדלים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב ישירות, בזמן אמת, אחר תגובתו של תא בודד לאורך מספר ימים, במקום להסיק תגובות אלו באופן עקיף.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה למיקרוסקופיה בשיטת time-lapse לטווח ארוך, למעקב אחר תגובות של תאים בודדים לטיפולים אנטי-סרטניים. הטכניקה מאפשרת לחוקרים לצפות בתגובות טיפוליות הטרוגניות ובגורל התא בזמן אמת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- חקר הסרטן
רקע
- הבנת תגובות התאים לתרופות נוגדות סרטן היא קריטית לטיפול בסרטן.
- ניתוח ברמת התא הבודד מספק תובנות לגבי ההטרוגניות התאית.
- מיקרוסקופיה של צילומי רצף (Time-lapse) מאפשרת תצפית על תהליכים תאיים דינמיים.
- קווי התאים HT1080 ו-HeLa נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי סרטן.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעותיהם של טיפולים אנטי-סרטניים על תאים בודדים.
- לחקור את המנגנונים העומדים מאחורי תגובות טיפוליות מגוונות.
- לספק שיטה לדימות ארוך טווח של התנהגות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תאי HT1080 בצלחות תרבית.
- הקמת תא סביבתי לתנאי דימות יציבים.
- שימוש במיקרוסקופיית time-lapse ללכידת תגובות תאיות לאורך זמן.
- שימוש במסמנים פלואורסצנטיים להדמיה של תהליכים תאיים.
תוצאות עיקריות
- תאים עם knockdown של p53 הראו התנהגות מיטוטית חריגה.
- טיפול ב-Paclitaxel שיבש את סידור הכרומוזומים בתאי HeLa.
- טיפול במעכב CDK46 הראה השפעות ציטסטטיות פוטנציאליות.
- מעקב בזמן אמת סיפק תובנות לגבי תגובות של תא בודד.
מסקנות
- השיטה מאפשרת תצפית מפורטת על תגובות של תאים בודדים לתרופות.
- דימות בזמן אמת יכול לחשוף תובנות קריטיות לגבי התנהגות תאי סרטן.
- גישה זו משפרת את ההבנה של יעילות טיפולית ועמידות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מעקב ארוכי טווח של תאים בודדים נותן מענה לפער קריטי בפיתוח תרופות אונקולוגיות על ידי חשיפת תגובות טיפוליות הטרוגניות המוסוות בבדיקות המבוססות על אוכלוסיות תאים. יכולת זו מחזקת את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (leads), על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על החלטות לגבי גורל התא, דינמיקה של מסלולים ומנגנוני עמידות לאורך תקופות ממושכות. השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכנית וברציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים, ובכך היא מספקת מידע לצורך מיון תיק מוצרים וקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על תגובות הטרוגניות לתרכובות אנטי-סרטניות במודלים של תאים איזוגניים.
- ערך תפעולי: מבהיר השפעות ספציפיות למסלולים, כגון מעצר מיטוטי, מעצר G1 או השראת נזק ל-DNA, באמצעות קריאות של ביו-סנסורים בזמן אמת.
- ערך תרגומי: תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים על ידי קישור דינמיקה של רפורטרים פלואורסצנטיים (למשל, מחזור תאים, אפופטוזיס) לתוצאות תפקודיות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתונים כמותיים סטנדרטיים של סדרות זמן על פרוליפרציה, התקדמות מחזור התא ולוקליזציה סוב-צלולרית לצורך סריקת תרכובות.
- שחזוריות: ייצוב תא הסביבה ממזער סריקות שגויות (artifacts) וסטיות (drift), מה שמאפשר מדידות אורכיות עקביות בין חזרות.
- מדרגיות: תואם לפורמטים של מספר בארות ולבקרת מיקוד אוטומטית, התומכת בקמפיינים של סריקה פנוטיפית בתושב (throughput) בינוני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדגים הקשרי סרטן אנושיים באמצעות קווי תאים HT1080 (פיברוסרקוממה) ו-HeLa (קרצינומה של צוואר הרחם) עם שיבושים גנטיים מוגדרים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבחין בין השפעות ציטוסטטיות להשפעות ציטוטוקסיות ומזהה כניסה חוזרת חריגה למחזור התא כמנגנון עמידות.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק גשר מפנוטיפים של מעורבות המטרה לתוצאות תפקודיות של גורל התא בלוח זמנים רלוונטי פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), כאשר מדדים פנוטיפיים דינמיים מספקים מידע על קשרי מבנה-פעילות ועל פרופילי סלקטיביות.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת היפותזות של מטרות על ידי קישור חשיפה לתרופות לשינויים בזמן אמת בשגשוג, בדינמיקה של כרומוזומים ובסיגנל אפופטוטי.
- סריקה: מספקת פלטים בעלי תוכן גבוה ורזולוציית זמן המתאימים להערכת השפעות של תרכובות על אוכלוסיות תאים הטרוגניות.
- אנליטיקה: מאפשרת חילוץ של פרמטרים קינטיים (למשל, משך העיכוב, תדירות כניסה מחדש) התומכים בדירוג השוואתי של תרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים in vitro לסממנים ביולוגיים קליניים של תגובה ועמידות באמצעות רפורטרים ספציפיים למסלולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימיון הניתנת לשימוש חוזר וניתנת ליישום על פני אינדיקציות אונקולוגיות ומחלקות מטרות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי זיהוי תגובות חולפות, נדירות או מושהות שאינן גלויות בבדיקות נקודת-סוף (endpoint assays).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דימוג תאים חיים לטווח ארוך תחת תנאים מבוקרים, ובכך משפר את עקביות הנתונים בין צוותים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי חשיפה מוקדמת של מנגנוני פגיעה, כגון החלקה מיטוטית (mitotic slippage) או עמידות אדפטיבית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד ותיעדוף של תרכובות המבוסס על ניהול סיכונים, בהתבסס על פרופילי תגובה של תאים בודדים ועמידות האפקט.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימות תאים חיים, בקרת סביבה ותיקוף של ביו-סנסורים פלואורסצנטיים.
- תלוי במערכות אינקובציה על גבי הבמה, בחומרה לתיקון סחיפה ובמצלמות בעלות רגישות גבוהה.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים להשגת שיווי משקל בתא, החלפת מצע ושמירה על מיקוד.
- שיקולי התאמה כוללים ניהול פוטוטוקסיות, חפיפה ספקטרלית של ביו-סנסורים וצפיפויות זריעה ספציפיות לקו תאים.
- מגבלות מעשיות כוללות דרישות אחסון נתונים ומורכבות ניתוח עבור מעקב רב-פרמטרי ארוך טווח.
