הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני Synechocystis ציאנובקטריאליים PCC6803 ומוטציות מסומנות במיני Synechococcus PCC7002. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטיקה הציאנובקטריאלית. כגון כיצד להכניס שינויים כרומוזומליים לזן.

על ידי החדרת גן עמידות לאנטיביוטיקה, ואחריו הסרה לאחר מכן של קלטת זו, באמצעות סמן שלילי הניתן לבחירה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע מניפולציות גנטיות שוב ושוב. מאפשר להכניס כמה שיותר חלופות לזן כרצונך.

לאחר הכנת מדיה, זנים ציאנובקטריאליים ופלסמידים, על פי פרוטוקול הטקסט. הקימו תרבית טרייה על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים ציאנובקטריאליים, לתוך 30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות באור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה, ל-OD7500, השווה ל-0.2 עד 0.6.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה 1 עד 2 מיליליטר של התרבית ב-2, 300 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש במדיום BG11 כדי לשטוף את הכדורים פעם אחת, ופיפטינג בעדינות כדי להשעות מחדש את התאים. מכיוון שמערבולת עלולה לגרום לאובדן פילי, החיוני לספיגת ה-DNA.

לאחר הגלולה שוב של התאים, והסרת הסופרנטנט, הוסיפו מדיום BG11 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר, והעבירו את התאים לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוגרם של פלסמיד A שהוכן בעבר לתאים. והקש בעדינות כדי לערבב.

לאחר מכן הניחו את הצינורות אופקית בחממה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ודגרו במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, יש לפזר כמויות של תערובת ה-DNA של פלסמיד תרבית התאים על צלחות אגר BG11 ללא אנטיביוטיקה. ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס.

כ-24 שעות לאחר מכן, הכינו תמיסת אגר 0.6%, במים המכילים קנמיצין. והניחו לו להתקרר ל -42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 2.5 עד שלושה מיליליטר לשולי לוחות התרבות והטו את הצלחת, כך שהתמיסה יוצרת שכבת אגר עליונה אחידה על פני השטח.

דגרו על הצלחות כשבעה ימים כדי שהמושבות יהיו גלויות. לאחר מכן מחלקים אגר BG11 טרי בתוספת צלחת קנמיצין לשישה מגזרים. והשתמש בקיסם קצה קהה כדי לפספס מושבות בודדות.

כדי לבצע PCR, כדי לאשר נוקאאוט מסומן, העבירו כמות קטנה של תאים לצינור המכיל 50 מיקרוליטר מים, וכ-20 חרוזי זכוכית של 425 עד 600 מיקרומטר. לנער את התאים והחרוזים במהירות של כ-2,000 סל"ד למשך חמש דקות, לפני שמסתובבים ב-15,700 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש בחמישה מיקרוליטר של הסופרנטנט כדי להכין 50 תגובות PCR של מיקרוליטר עם הדבקה של DNA מקדים.

כדי לאמת את המוטאנטים, לאחר תכנון פריימרים על פי פרוטוקול הטקסט, הגבר את המוצר באמצעות התוכנית הבאה, וכלל בקרה מסוג פראי. באמצעות gelelektroforeses, אמת את הגנוטיפ של טרנספורמציות נוק-אאוט. מציג רצועה של כארבעה זוגות קילו-בסיס וחסר את הרצועה מסוג הבר.

עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. אם עדיין קיימת רצועה מסוג בר, פס מחדש את המתח על הצלחת הטרייה וחזור על ה-PCR. חזור על תהליך האימות עד שהמוטציה מופרדת, ולא נצפתה פס מסוג פרא בתגובת ה-PCR.

עבור זן המציג פרופיל מוטנטי מסומן, פס מחדש על צלחת טרייה לשימוש ביצירת נוקאאוט לא מסומן. כדי ליצור מוטציות לא מסומנות של Synechocystis, הקימו תרבית חדשה של הנוקאאוט המסומן על ידי חיסון הלולאה המלאה בתאים ל-30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות במשך יומיים-שלושה ל- OD750, שווה ל 0.2 עד 0.6.

צנטריפוגה 10 מיליליטר של התרבית ב -2, 300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. ואז אנחנו BG11 בינוני כדי לשטוף בעדינות את התאים. לאחר הוספת BG11 לנפח סופי של 200 מיקרוליטר, והעברת התאים לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, הוסף 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד B לתאים, והקש בעדינות כדי לערבב.

לאחר מכן הניחו את הצינורות אופקית בחממה, ודגרו במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה יש להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום BG11 ולדגור את הדגימות למשך ארבעה ימים בסך הכל עם ניעור. זהו זמן מספיק כדי לאפשר רקומבינציה להתרחש בעותקים הכרומוזומליים המרובים.

צלחת 50, 10 ו-1 מיקרוליטר של התרבות שעברה טרנספורמציה על BG11 בתוספת 5% צלחות אגר סוכרוז ודגירה במשך כשבעה ימים ליצירת מושבות בודדות. לאחר מכן, בעזרת קיסם קצה קהה, בקעו 30 עד 50 מושבות בודדות על צלחות BG11 בתוספת קנמיצין. לאחר מכן יש למרוח על BG11 בתוספת 5% סוכרוז.

מושבות הגדלות על BG11 בתוספת סוכרוז, אך לא על צלחות עם קנמיצין הן נוקאאוט פוטנציאלי לא מסומן. מושבות הגדלות על שתי הצלחות עשויות להיות עמידות לסוכרוז עקב מוטציה בגן sacB. בעקבות שיטת ה-PCR, שהודגמה מוקדם יותר בסרטון זה, אמת נוקאאוטים לא מסומנים, אשר ייצרו רצועת ג'ל המתאימה לגודל הסוג הפראי פחות האזור שנמחק.

אם הזן מראה פרופיל מוטנטי לא מסומן, יש לפספס אותו מחדש על אגר BG11 טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי לאחסן את הזנים לטווח ארוך, הקימו תרבית חדשה של הזן על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים לתוך 30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות במשך שלושה עד ארבעה ימים עד ו- OD750 שווה ל 0.4 עד 0.7.

לאחר השימוש ב-BG11 לשטיפת התאים פעם אחת, השעו מחדש את הגלולה בכשני מיליליטר של BG11. הוסף 0.8 מיליליטר מהתאים המרוכזים לצינור אחד. לאחר מכן הוסף 0.2 מיליליטר של 80% גליצרול מעוקר מסנן.

לצינור אחר, הוסף 0.93 מיליליטר תאים מרוכזים ו-0.07 מיליליטר DMSO. אחסן את שני הצינורות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להחיות את הזנים, הסר את הצינור והשתמש בקיסם קצה קהה כדי לגרד כמה תאים על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה.

לאחר מכן השתמש בלולאה סטרילית כדי לצאת כרגיל. איור זה מציג דוגמאות לפלסמידים A ו-B המשמשים ליצירת מוטציות מחיקה. בכל מקרה, חמשת אזורי הקרשים הראשוניים ושלושת אזורי הקרשים הראשוניים הם כ-900 עד 1,000 זוגות בסיסים.

פלסמיד B, יכול להכיל גם קלטת גנים בין חמשת הראשוניים לשלושת הראשוניים כ-1 קילו-בסיס. או גרסה שונה של רצף הגנים הטבעיים. עם טרנספורמציה עם פלסמיד A, כמה מאות מושבות יופיעו על צלחת לאחר שבעה עד 10 ימים.

אם הגנים אינם חיוניים והמוטנטים מדגימים גדילה, בדומה לזן מסוג הבר, אז כל הכרומוזומים צריכים להכיל רצף מוכנס npt1/sacB, כפי שנקבע באמצעות PCR. אם הגנים אינם חיוניים, והמוטנטים גדלים לאט, אז יש צורך במספר סבבים של פסים מחדש עם ריכוזים הולכים וגדלים של קנמיצין, כדי להשיג מוטנט מסומן מופרד. אם לאחר הפסים מחדש, לא מתקבלת מוטציה מסומנת, סביר להניח שהגן חיוני להישרדות.

רוב המושבות הבודדות, המתקבלות משינוי עם פלסמיד B, יהיו רגישות לקנמיצין ועמידות לסוכרוז. כפי שמודגם כאן, הגברת PCR של אזור היעד במושבות אלה, מראה שכמעט 100% מפרופיל המוטאנטים הלא מסומן. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעות במשך תקופה של שישה שבועות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להשתמש בטכניקה סטרילית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידת ייצור חמצן, או ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מדידת קצב פוטוסינתזה או ייצור מטבוליט. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה הציאנובקטריאלית.

לחקור תהליכים ביוכימיים ופיזיולוגיים מרכזיים בפילום זה, וזנים התפתחותיים למטרות תעשייתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור נוקאאוט לא מסומן במיני Synechococcus PCC6803.