Name: הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: למד שיטה ליצירת מוטנטים ללא סימון ב-Synechocystis sp. PCC6803 ומוטנטים מסומנים ב-Synechococcus sp. PCC7002. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית חוזרת ומקלה על הכנסת שינויים גנומיים מרובים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים טראסט לחינוך סביבתי שירותים האגודה, ביולוגיה סינתטית בקרן קיימברידג SynBio ומשרד צדק חברתי והעצמה, ממשלת הודו, עבור תמיכה כספית.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר בדור של מוטציות לא מסומנות הם: 1) עיצוב פלסמיד זהיר כדי להבטיח את אזור המיקוד רק משתנה; 2) להבטיח כי דגימות להישאר axenic, במיוחד כאשר בתרבית על סוכרוז; 3) ציפוי טרנספורמציה תאים עבור דור מוטציה מסומן בתחילה על צלחות אגרו BG11 חסרי אנטיביוטיקה, ואחריו תוספת של אגר בתוספת אנטיביוטיקה 24 שעות מאוחר יותר; 4) culturing מסומן מוטנטים עבור 4 ימים מלאים לפני ציפוי על צלחות אגרו BG11 בתוספת סוכרוז: 5) להבטיח כי מוטציות מסומנות הם מלאי הפרדה ו -6) ביסודיות המאשר את הג...

כחוליות מהוות מערכה עתיקה ומגוונת אבולוציונית של חיידקים נמצאים כמעט בכל סביבה טבעית על פני כדור הארץ. בשנת מערכות אקולוגיות ימיות הם במיוחד שופע לשחק תפקיד מפתח במחזורים מזין רבים, והיוו כמחצית קיבוע פחמן 1, רוב קיבוע חנקן 2 ומאות מיליוני טונות של ייצור פחמימנים 3 באוקיינוסים בשנה. כלורופלסטים, אברון האחראי על הפוטוסינתזה אצות איקריוטיים וצמחים, צפויים התפתחו מתוך cyanobacterium כי נבלע על ידי הפונדקאי 4. כחוליות הוכיחו אורגניזמים מודל שימושי לחקר הפוטוסינתזה, אלקטרון התחבורה 5 ו הביוכימיים, שרבים מהם שמורים בצמחים. בשנת כחוליות בנוסף יותר ויותר בשימוש לייצור מזון, דלק ביולוגי 6, חשמל 7 ותעשייתיים תרכובות 8, בשל היי שלהםהמרה יעילה ghly מים ו- CO 2 עד ביומסה באמצעות אנרגיה סולארית 9. מינים רבים יכולים להיות מעובד על קרקע שאינה חקלאית עם חומרים מזינים מינימאליים ומי ים, דבר המצביע על כך כחוליות עלולים להיות מבוגרים בקנה מידה גדולה מבלי להשפיע ייצור חקלאי. מינים מסוימים הם גם מקורות של מוצרים טבעיים, כולל תרכובות נגד פטריות, אנטיבקטריאלי ואנטי סרטן 10,11. היכולת ליצור מוטציות היא מפתח להבנת פוטוסינתזה כחוליות, ביוכימיה ופיזיולוגיה, וחיוני להתפתחות של זנים למטרות תעשייתיות. רוב המחקרים שפורסמו גנרטור מהונדס גנטי זנים ידי החדרת קלטת עמידות לאנטיביוטיקה לתוך האתר של עניין. זה מגביל את מספר מוטציות יכולות להיות מוחדר זן, כמו שרק כמה קלטות עמידות לאנטיביוטיקה זמינות לשימוש כחוליות. זנים המכילים גנים המקנות מחדש אנטיביוטיsistance לא יכול לשמש לייצור תעשייתי בבריכות פתוחות, אשר צפוי להיות אמצעי היחיד החסכוני לייצר דלק ביולוגי ומוצרים בעלי ערך נמוך אחרים 12. הדור של מוטציות לא מסומנות מתגבר על מגבלות אלה. מוטציות לא מסומנות אינם מכילים דנ&quot;א זר, אלא אם כן נכלל בכוונה, וניתן לטפל מספר פעמים. לכן אפשר ליצור שינויים רבים ב זן כפי רצויות. בנוסף, תופעות קוטב על גנים במורד הזרם של אתר שינוי ניתן למזער, המאפשר שינוי מדויק יותר של האורגניזם 13. כדי ליצור זנים מוטנטים, פלסמידים התאבדות המכיל שני קטעי דנ&quot;א זהה אזורים בכרומוזום כחוליות איגוף הגן למחיקה (שמכונה 5 &#39;ו 3&#39; אזורי איגוף) בנויים ראשון. שני גנים ואז מוכנס בין אזורי איגוף אלה. אחד מהם מקודד חלבון עמידות לאנטיביוטיקה; השני מקודד SacB, אשר לדרבןuces levansucrase, תרכובת מקנה רגישה סוכרוז. בשלב הראשון של התהליך, מוטציות מסומנות, זנים כלומר המכילים כמה דנ&quot;א זר, נוצרות. הבונה פלסמיד הוא מעורבב עם התאים כחוליות והדנ&quot;א נלקח באופן טבעי על ידי האורגניזם. Transformants נבחר על ידי צמיחה על צלחות אגרו המכילות את אנטיביוטי המתאים ואת הגנוטיפ המוטציה מאומת על ידי PCR. פלסמידים התאבדות לא יכולים לשכפל בתוך הזן של עניין. לכן כל מושבות עמידות לאנטיביוטיקה תגרומנה מאירוע רקומבינציה לפיה הגן של עניין מוכנס לתוך הכרומוזום. כדי ליצור מוטציות לא מסומנות, המוטציה הניכרת הוא מעורב אז עם פלסמיד התאבדות נוסף שהכיל רק 5 &#39;ו 3&#39; אזורי האיגוף. עם זאת, אם החדרת דנ&quot;א זר נדרשה, פלסמיד המורכב של 5 &#39;ו 3&#39; איגוף אזורים עם קסטה המכילה את הגנים של העניין המוכנס בין קטעי דנ&quot;א אלה, ניתן להשתמש. Sele גודלction היא באמצעות צמיחה על צלחות אגר המכיל סוכרוז. כמו סוכרוז הוא קטלני לתאים כאשר מוצר גן sacB מתבטא, התאים היחידים ששורדים הם אלה שבם אירוע רקומבינציה שני התרחש, לפיה גן רגישות סוכרוז, בנוסף גן העמידות לאנטיביוטיקה, כבר recombined מתוך כרומוזום על פלסמיד. כתוצאה מכך של חילופי recombinational, אזורי האיגוף וכל DNA ביניהם מוכנסים לתוך כרומוזום. השתמשנו בהצלחה בשיטות אלה כדי ליצור מוטציות כרומוזומליות מרובות באותו הזן של Synechocystis sp. PCC6803 (להלן המכונה Synechocystis) 13,14, להציג מוטציות נקודה אחת לתוך גן של עניין 13 ו לביטוי של קלטות גן. בעוד הדור של knockouts המסומנת הודגם לפני עבודתנו Synechocystis 15,16, שיטה מפורטת, שנעזרמצגת ויזואלית של השלבים הקריטיים, הוא לא זמין לציבור. גם יש לנו ליישם אותה השיטה לייצור של knockouts ניכרה cyanobacterium מודל אחר, sp Synechococcus. PCC7002 (להלן המכונה Synechococcus). פרוטוקול זה מספק שיטה ברורה, פשוטה ליצירת מוטציות ובפרוטוקול מהיר על תיקוף ואחסון זנים אלה.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>חומצת לימון</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Ferric ammonium citrate</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</</td><td>sub>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cyanocobalamin</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>פישר</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 90 מ"מ משולש אוורור</td><td>גריינר</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ומיקרו; m פילטרים</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות חרוטיות 100 מ"ל</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 מ"מ x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion פולימראז DNA בנאמנות גבוהה&nbsp;</td>ערכת טיהור DNA <td>של Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>אנדונוקלאזות הגבלה</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 ליגאז</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>מרק Luria Bertani</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני-הכנה פלסמיד GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 מ"ל צינור תחתון עגול</td><td>בז BD 352059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA פולימראז</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 ומיקרו; m זכוכית חרוזים</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>נורות פלורסנט</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitron photobioreactor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדור של מסומנים מוטאנטים markerless במודל כחוליות המינים

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

ציאנובקטריה הם אורגניזמים חשובים מבחינה אקולוגית ופלטפורמות פוטנציאליות לייצור דלקים ביולוגיים ומוצרים תעשייתיים שימושיים. מניפולציה גנטית של ציאנובקטריה, במיוחד אורגניזמים מודלים כגון Synechocystis sp. PCC6803 ו-Synechococcus sp. PCC7002, היא כלי מפתח למחקר בסיסי ויישומי כאחד. יצירת מוטציות לא מסומנות, לפיה שינויים כרומוזומליים מוכנסים לזן באמצעות החדרת קלטת עמידות לאנטיביוטיקה (מקטע DNA הניתן למניפולציה המכיל גן אחד או יותר), ולאחר מכן הסרה של קלטת זו באמצעות סמן שלילי הניתן לבחירה, היא טכניקה חזקה במיוחד. מוטציות לא מסומנות ניתנות למניפולציה גנטית שוב ושוב, מה שמאפשר להכניס כמה שינויים לזן כרצונך. בנוסף, היעדר גנים המקודדים חלבונים עמידים לאנטיביוטיקה בזן המוטנטי הוא רצוי, מכיוון שהוא מונע אפשרות של 'בריחה' של אורגניזמים עמידים לאנטיביוטיקה לסביבה. עם זאת, שיטות מפורטות לסבבים חוזרים ונשנים של מניפולציה גנטית של ציאנובקטריה אינן מתוארות היטב בספרות המדעית. כאן אנו מספקים תיאור מקיף של טכניקה זו, בה השתמשנו בהצלחה כדי ליצור מוטציות עם מחיקות מרובות, מוטציות נקודתיות בודדות בתוך גן מעניין והכנסת קלטות גנים חדשות.

עיצוב פלסמיד הוא קריטי עבור דור מוצלח של שני מוטנטים מסומנים ולא מסומנים. איור 1 נותן דוגמא של פלסמיד ו- B השתמשו כדי ליצור מוטציה מחיקה בגני Synechocystis cpcC1 ו cpcC2 13. בכל מקרה 5 &#39;ו 3&#39; אזורי האיגוף כ 900-1,000 נ&quot;ב. אזורי איגוף מופחתים יכולים לשמש אף הקטן ביותר בהצלחה לנו trialed כבר כ -500 נ&quot;ב. פלסמיד B יכול להכיל גם קלטת גן בין 5 &#39;ו 3&#39; ~ 1 אזורי איגוף kb או גרסה...

הכנסת שינויים גנומיים מרובים לציאנובקטריה היא כלי חיוני בפיתוח זנים למטרות מחקר תעשייתי ובסיסי. אנו מתארים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני המודל הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC6803 ומוטציות מסומנות ב-Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני Synechocystis ציאנובקטריאליים PCC6803 ומוטציות מסומנות במיני Synechococcus PCC7002. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגנטיקה הציאנובקטריאלית. כגון כיצד להכניס שינויים כרומוזומליים לזן.על ידי החדרת גן עמידות לאנטיביוטיקה, ואחריו הסרה לאחר מכן של קלטת זו, באמצעות סמן שלילי הניתן לבחירה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע מניפולציות גנטיות שוב ושוב. מאפשר להכניס כמה שיותר חלופות לזן כרצונך.לאחר הכנת מדיה, זנים ציאנובקטריאליים ופלסמידים, על פי פרוטוקול הטקסט. הקימו תרבית טרייה על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים ציאנובקטריאליים, לתוך 30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות באור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה, ל-OD7500, השווה ל-0.2 עד 0.6.לאחר הדגירה, צנטריפוגה 1 עד 2 מיליליטר של התרבית ב-2, 300 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש במדיום BG11 כדי לשטוף את הכדורים פעם אחת, ופיפטינג בעדינות כדי להשעות מחדש את התאים. מכיוון שמערבולת עלולה לגרום לאובדן פילי, החיוני לספיגת ה-DNA.לאחר הגלולה שוב של התאים, והסרת הסופרנטנט, הוסיפו מדיום BG11 לנפח סופי של 100 מיקרוליטר, והעבירו את התאים לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוגרם של פלסמיד A שהוכן בעבר לתאים. והקש בעדינות כדי לערבב.לאחר מכן הניחו את הצינורות אופקית בחממה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, ודגרו במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, יש לפזר כמויות של תערובת ה-DNA של פלסמיד תרבית התאים על צלחות אגר BG11 ללא אנטיביוטיקה. ולדגור ב-30 מעלות צלזיוס.כ-24 שעות לאחר מכן, הכינו תמיסת אגר 0.6%, במים המכילים קנמיצין. והניחו לו להתקרר ל -42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסיפו 2.5 עד שלושה מיליליטר לשולי לוחות התרבות והטו את הצלחת, כך שהתמיסה יוצרת שכבת אגר עליונה אחידה על פני השטח.דגרו על הצלחות כשבעה ימים כדי שהמושבות יהיו גלויות. לאחר מכן מחלקים אגר BG11 טרי בתוספת צלחת קנמיצין לשישה מגזרים. והשתמש בקיסם קצה קהה כדי לפספס מושבות בודדות.כדי לבצע PCR, כדי לאשר נוקאאוט מסומן, העבירו כמות קטנה של תאים לצינור המכיל 50 מיקרוליטר מים, וכ-20 חרוזי זכוכית של 425 עד 600 מיקרומטר. לנער את התאים והחרוזים במהירות של כ-2,000 סל"ד למשך חמש דקות, לפני שמסתובבים ב-15,700 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן השתמש בחמישה מיקרוליטר של הסופרנטנט כדי להכין 50 תגובות PCR של מיקרוליטר עם הדבקה של DNA מקדים.כדי לאמת את המוטאנטים, לאחר תכנון פריימרים על פי פרוטוקול הטקסט, הגבר את המוצר באמצעות התוכנית הבאה, וכלל בקרה מסוג פראי. באמצעות gelelektroforeses, אמת את הגנוטיפ של טרנספורמציות נוק-אאוט. מציג רצועה של כארבעה זוגות קילו-בסיס וחסר את הרצועה מסוג הבר.עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. אם עדיין קיימת רצועה מסוג בר, פס מחדש את המתח על הצלחת הטרייה וחזור על ה-PCR. חזור על תהליך האימות עד שהמוטציה מופרדת, ולא נצפתה פס מסוג פרא בתגובת ה-PCR.עבור זן המציג פרופיל מוטנטי מסומן, פס מחדש על צלחת טרייה לשימוש ביצירת נוקאאוט לא מסומן. כדי ליצור מוטציות לא מסומנות של Synechocystis, הקימו תרבית חדשה של הנוקאאוט המסומן על ידי חיסון הלולאה המלאה בתאים ל-30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות במשך יומיים-שלושה ל- OD750, שווה ל 0.2 עד 0.6.צנטריפוגה 10 מיליליטר של התרבית ב -2, 300 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופרנטנט. ואז אנחנו BG11 בינוני כדי לשטוף בעדינות את התאים. לאחר הוספת BG11 לנפח סופי של 200 מיקרוליטר, והעברת התאים לצינור תחתון עגול של 14 מיליליטר, הוסף 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד B לתאים, והקש בעדינות כדי לערבב.לאחר מכן הניחו את הצינורות אופקית בחממה, ודגרו במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה יש להוסיף 1.8 מיליליטר של מדיום BG11 ולדגור את הדגימות למשך ארבעה ימים בסך הכל עם ניעור. זהו זמן מספיק כדי לאפשר רקומבינציה להתרחש בעותקים הכרומוזומליים המרובים.צלחת 50, 10 ו-1 מיקרוליטר של התרבות שעברה טרנספורמציה על BG11 בתוספת 5% צלחות אגר סוכרוז ודגירה במשך כשבעה ימים ליצירת מושבות בודדות. לאחר מכן, בעזרת קיסם קצה קהה, בקעו 30 עד 50 מושבות בודדות על צלחות BG11 בתוספת קנמיצין. לאחר מכן יש למרוח על BG11 בתוספת 5% סוכרוז.מושבות הגדלות על BG11 בתוספת סוכרוז, אך לא על צלחות עם קנמיצין הן נוקאאוט פוטנציאלי לא מסומן. מושבות הגדלות על שתי הצלחות עשויות להיות עמידות לסוכרוז עקב מוטציה בגן sacB. בעקבות שיטת ה-PCR, שהודגמה מוקדם יותר בסרטון זה, אמת נוקאאוטים לא מסומנים, אשר ייצרו רצועת ג'ל המתאימה לגודל הסוג הפראי פחות האזור שנמחק.אם הזן מראה פרופיל מוטנטי לא מסומן, יש לפספס אותו מחדש על אגר BG11 טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי לאחסן את הזנים לטווח ארוך, הקימו תרבית חדשה של הזן על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים לתוך 30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11. גדל את התרבות במשך שלושה עד ארבעה ימים עד ו- OD750 שווה ל 0.4 עד 0.7.לאחר השימוש ב-BG11 לשטיפת התאים פעם אחת, השעו מחדש את הגלולה בכשני מיליליטר של BG11. הוסף 0.8 מיליליטר מהתאים המרוכזים לצינור אחד. לאחר מכן הוסף 0.2 מיליליטר של 80% גליצרול מעוקר מסנן.לצינור אחר, הוסף 0.93 מיליליטר תאים מרוכזים ו-0.07 מיליליטר DMSO. אחסן את שני הצינורות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להחיות את הזנים, הסר את הצינור והשתמש בקיסם קצה קהה כדי לגרד כמה תאים על צלחת אגר ללא אנטיביוטיקה.לאחר מכן השתמש בלולאה סטרילית כדי לצאת כרגיל. איור זה מציג דוגמאות לפלסמידים A ו-B המשמשים ליצירת מוטציות מחיקה. בכל מקרה, חמשת אזורי הקרשים הראשוניים ושלושת אזורי הקרשים הראשוניים הם כ-900 עד 1,000 זוגות בסיסים.פלסמיד B, יכול להכיל גם קלטת גנים בין חמשת הראשוניים לשלושת הראשוניים כ-1 קילו-בסיס. או גרסה שונה של רצף הגנים הטבעיים. עם טרנספורמציה עם פלסמיד A, כמה מאות מושבות יופיעו על צלחת לאחר שבעה עד 10 ימים.אם הגנים אינם חיוניים והמוטנטים מדגימים גדילה, בדומה לזן מסוג הבר, אז כל הכרומוזומים צריכים להכיל רצף מוכנס npt1/sacB, כפי שנקבע באמצעות PCR. אם הגנים אינם חיוניים, והמוטנטים גדלים לאט, אז יש צורך במספר סבבים של פסים מחדש עם ריכוזים הולכים וגדלים של קנמיצין, כדי להשיג מוטנט מסומן מופרד. אם לאחר הפסים מחדש, לא מתקבלת מוטציה מסומנת, סביר להניח שהגן חיוני להישרדות.רוב המושבות הבודדות, המתקבלות משינוי עם פלסמיד B, יהיו רגישות לקנמיצין ועמידות לסוכרוז. כפי שמודגם כאן, הגברת PCR של אזור היעד במושבות אלה, מראה שכמעט 100% מפרופיל המוטאנטים הלא מסומן. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שעות במשך תקופה של שישה שבועות אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להשתמש בטכניקה סטרילית. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידת ייצור חמצן, או ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה של גז, על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו מדידת קצב פוטוסינתזה או ייצור מטבוליט. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הגנטיקה הציאנובקטריאלית.לחקור תהליכים ביוכימיים ופיזיולוגיים מרכזיים בפילום זה, וזנים התפתחותיים למטרות תעשייתיות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור נוקאאוט לא מסומן במיני Synechococcus PCC6803.

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: וובר, נ ' ואח', טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור בהקפאה של הלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מתאר הליך לביצוע טרנספורמציה טבעית בציאנובקטריה חוטית באמצעות DNA פלסמיד להשגת ביטוי GFP יציב ועמידות לאנטיביוטיקה באמצעות רקומבינציה הומולוגית.

טרנספורמציה טבעית וביטוי GFP בלקונה החוטית Cyanobacterium Phormidium

מקור: Lea-Smith, D. J., et al. יצירת מוטציות מסומנות וחסרות סמן במינים ציאנובקטריאליים מודלים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה ליצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה. הפרוטוקול מתחיל בתרבית ציאנובקטריה, ואחריו צנטריפוגה ושלבי שטיפה המשמרים את פני השטח. לאחר מכן מוצג פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה המוקף ברצפים הומולוגיים. במהלך הדגירה, הפלסמיד מופנם באמצעות פילי ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. בחירת אנטיביוטיקה וריסוק משמשים לבידוד וטיהור הזן המוטנטי.

יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה (ts) הן כלים רבי ערך לזיהוי וניתוח פונקציות חיוניות. כאן אנו מתארים שיטות ליצירה וסיווג של מוטציות קטלניות בתפוקה גבוהה.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.

השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט

פרוטוקול זה משתמש יזם פלורסנט-כתבים, מיקרוסקופית תא חי, וחילוץ הכללה בודדים בגישה גנטית קדימה מכוונת לזהות ולבודד מוטציות התפתחותיות של כלמידיה trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

פורמידיום לקונה (שם מדעי: Phormidium lacuna ) הוא ציאנובקטריום נימה שבודד מסלעים ימיים. מאמר זה מתאר את הבידוד של חוטים ממקורות טבעיים, מיצוי DNA, ריצוף גנום, טרנספורמציה טבעית, ביטוי של sfGFP, קריוקונסרבציה ושיטות תנועתיות.

טרנספורמציה טבעית, ביטוי חלבונים ושימור קריו-קונסרבציה של הציאנובקטריום הנימה פורמידיום לקונה

פרוטוקול זה מספק הנחיה מקיפה להגדרה ולניטור כמותי של תרביות משותפות, כולל ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטו-אוטוטרופיים ושמרים הטרוטרופיים.

הרכבה וכימות של תרביות משותפות המשלבות שמרים הטרוטרופיים עם ציאנובקטריה מפרישת סוכר פוטוטרופית

באמצעות גירוי חשמלי בתדר גבוה, תפיסת כמו פעילות יכול להיגרם...

Neurocircuit מבחני עבור התקפים של אפילפסיה של מוטאנטים תסיסנית</em

למד שיטה ליצירת מוטנטים ללא סימון ב-Synechocystis sp. PCC6803 ומוטנטים מסומנים ב-Synechococcus sp. PCC7002. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית חוזרת ומקלה על הכנסת שינויים גנומיים מרובים.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

גלה סרטונים נוספים