Name: מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: חקור מבנה מטריקס לבבי מופרד מתאים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. השיטה מאפשרת תיאור איכותי של ארגון המטריקס החוץ-תאי ומסייעת בחקר מחלות פיברוטיות וקרדיומיופתיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH), מכון הלב, הריאות והדם (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
הדמיה ועיבוד רקמות (לאחר השריה של NaOH) בוצעו באמצעות המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (נתמך על ידי מענקי NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ו-EY08126). אנו אסירי תודה במיוחד למנהלי הליבה של VUMC CISR (ד"ר סם וולס וד"ר ו. גריי (ג'יי) ג'רום) על ייעוץ טכני יקר ערך וגם על מתן מרחב ליבה ומשאבים למטרות צילום הטכניקה המודגשת במאמר זה. 
ברצוננו להביע את הערכתנו העמוקה לד"ר יאן רו סו וגב' קלסי טומאסק במעבדת הליבה הקרדיולוגית למחקר תרגומי וקליני באוניברסיטת ונדרבילט על מתן מומחיות טכנית ועל איסוף דגימות רקמה אנושיות ששימשו במחקר זה.

משפט ואתיקה: הפרוטוקולים עבור טיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת שימוש (IACUC, פרוטוקולי מספר M / 10/117 (חזירים) ו- M / 10/219 (עכברים) ו נערכים על פי תקני AAALAC-בינלאומיים. שימוש של רקמות לב אנושיות פקידה אושר על ידי IRB במרכז הרפואי של האוניברסיטה ונדרבילט (מספר פרוטוקול 100,887). לדוגמא 1. איסוף ואחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך glutaraldehyde 4% טרי ב 0.1 M חיץ פוספט פתרון (PB). זהירות: Glutaraldehyde הוא רעיל, ללבוש כפפות ולעבוד במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 0.2 M המניות של PB, pH 7.4 באמצעות 21.8 גרם Na 2 HPO 4 ו -6.4 גרם לאא 2 4 PO. Quantum satis (QS) 1,000 מ&quot;ל DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μl של glutaraldehyde 50% עד 2.5 מ&quot;ל של פתרון המניות PB ו -2.1 מ&quot;ל DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול נתח (לא גדול מ -2 גמ &#39;2) של רקמה לתוך פתרון glutaraldehyde 4%. הערה: חתיכות קטנות יכולות לשמש גם אבל צריך להיות בגודל מספיק (לא קטן מ -5 מ&quot;מ 2) להיות מדמיינים בקלות על ידי עין על מנת להקל צעדים מאוחר יותר של הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, ולאחר מכן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב 4 ° C.. </li></ol> 2. Decellularization של רקמת לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בתמיסה מימית NaOH 10% טריים באמצעות 10 כדורי גרם NaOH / 100 מ&quot;ל DH 2 O. זהירות: פתרונות NaOH הם מאכלים והוא יכול לגרום אלקלי כוויות, ללבוש כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רקמות ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בתמיסה 10% NaOH בטמפרטורת החדר למשך 6 - 10 ימים (עד שינויים ברקמה מן אדמדם-חום מחוץ לבן או לבן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב DH 2 O עד הרקמה הופכת שקופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול רקמות בחומצה טאני 1% ל -4 שעות בטמפרטורת החדר. השתמש 1 מ&quot;ל 5% מניות פתרון לכל 4 מ&quot;ל DH 2 O. זהירות: חומצה טאניתהוא מגרה חזק, ללבוש כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף ב DH 2 O לילה. </li></ol> 3. Osmication והתייבשות של רקמת לב (ב פומה הוד לבטיחות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון 0.2 M המניות של חיץ נתרן cacodylate באמצעות cacodylate 21.4 גרם נתרן, סידן כלורי 10.0 גרם ו 450 מ&quot;ל DH 2 O. מערבבים, ולאחר מכן להוסיף חומצה הידרוכלורית לפי הצורך כדי להתאים את pH 7.4. Qs 500 מ&quot;ל עם DH 2 O. זהירות: cacodylate נתרן וחומצה הידרוכלורית רעילים, ללבוש כפפות ולעבוד במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון המניות 2% מימית של tetroxide אוסמיום במנדף לבטיחות ידי המסת גביש tetroxide אוסמיום 1 גרם ב 50 מ&quot;ל DH 2 O. זהירות: tetroxide אוסמיום הוא מפגע משאיפת חמור; קיבעון האדים של ממברנות ריר או העיניים אפשרי, ומכאן להתמודד רק במנדף עם כפפות. שומר סנסציה מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רקמות במאגר cacodylate 0.1 M נתרן (לערבב פתרון מניות 1: 1 עם DH <sub&gt; 2 O) במשך 5 דקות על הכתף (או תסיסה עדינה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב הקודם פעמיים, עבור סכום כולל של שלוש שטיפות חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול רקמות tetroxide אוסמיום 1% ב 0.1 M נתרן חיץ cacodylate (לערבב cacodylate נתרן המניות אוסמיום המניות tetroxide 1: 1) על הכתף במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רקמות 0.1 M נתרן cacodylate חיץ 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד על הכתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף רקמות באמצעות ריכוזים גוברים של אתנול (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, ולבסוף 100%) במשך 15 דקות כל אחד על כתף. </li></ol> 4. הכנת פני שטח חתך עבור SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמות באתנול 100% כדי בצלחת פטרי רדודה גם המכילה אתנול 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק שני סכיני גילוח חד מאוד כך ולדירות הצדדים נמצאות בקשר אחד עם השני, וצלב קצות החיתוך ליצירת שני צדדים של משולש שווה צלעות מעל הדגימה. כדי להשיג זאת, להשתמש ביד שמאל למקום להב אחד בצד הימני או השמאלי של המדגםחתך שמאלה. במקביל, השתמש ביד ימין להציב את הלהב השני בשמאל הקיצוני של ימינה המדגם פרוס. לפיכך, הלהבים יהיו החליקו אחד נגד השני מכיוונים מנוגדים לעשות חתך אחד חלקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק את צדדי להב שטוח אחד נגד השני כדי לעשות חתך מאוד נקי של הדגימה עם עיוות מינימאלית או לקרוע כוח, רצוי לחשוף שטח פנים גדול ככל האפשר מבלי לפגוע הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על פעולה עבור כל דגימה לחשוף משטחי החתך האפשריים הנקיים לבדיקה ב SEM. </li></ol> 5. ייבוש נקודה קריטית (CPD) של רקמת לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מרית או פינצטה להעביר רקמות לבעל המדגם של מייבש הנקודה הקריטי (CPD), להבטיח כי נשארה רקמה באתנול 100% בכל העת. ודא כי בעל שקוע אתנול כי העברת מושגת עם הרקמה החשופה לאוויר לא יותר מכמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Operate CPD לכל לנוהוראות אה להשלים 3 טיהור-ו-למלא מחזורים להחליף אתנול עם פחמן דו חמצני נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Operate CPD לכל ידנית של המשתמש כדי להשיג ייבוש נקודה קריטית של דגימות ולהחזיר אותם בלחץ אטמוספרי עם אוורור מבוקר של CO 2. </li></ol> שמת 6. דוגמאות רקמה לב עבור SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן בדל מדגם SEM עבור כל דגימה, על ידי דבקות כרטיסייה דבקה פחמן אל פני השטח העליון של בדל האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת סטראו, בזהירות לדבוק דגימה ללשונית הדבקה עם משטח החתך של עניין פונה כלפי מעלה (הרחק הכרטיסייה, גלויה), וקרוב ככל האפשר מקבילה עם המטוס של פני שטח בדל מדגם. אין לחקור או לגעת במשטח של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור מקל מוליך עץ כדי להשיג מברשת מחודדת, אידיאלית עבור יישום צבע. החל כסף או צבע פחמן בבסיס והדפנות של הדגימה, כדי לשפר את דבקות הבדל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב קו דק מאוד של כסף או פחמן לצייר עד יתרון של פני השטח של עניין, כדי לספק נתיב תשלום מפני השטח של עניין הקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 2 או 3 מורח קטן של כסף או צבע פחמן מסביב בכרטיסיית פחמן, כדי לספק נתיב מוליך מפני שטח כרטיסיית פחמן אל בדל מתכת ובכך לקרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צבע מוליך להתייבש במשך שתי שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Operate coater גמגום לכל מדריך למשתמש להחיל ציפוי כבד יחסית (טווח היעד של 30 - 40 ננומטר) של סגסוגת זהב-פלדיום או זהב. משאבת תא דגימה כ -0.1 mbar; כוונו את הטיימר ל -40 שניות. שסתום סט פתוח 08:00 המיקום (זרימת גז ארגון מתון). לחצו על התחל כדי ליזום ציפוי גמגום 30 מילי-אמפר. הפרשות זוהרות סגולות צריכות להיות גלויות בתא הדגימה. </li></ol> 7. בדיקת SEM של דגימות רקמת לב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים במתח האצה נמוך יחסית כדי למזער הדמיה problems הקשורים פיזור חסותה המסכן במדגם (טעינה). מצב הדמיה הראשונית מוצעים הם: 5 kV מאיץ מתח, 10 מ&quot;מ ומרחק עבודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סיוע של מפעיל מנוסה, להעסיק גדל עובד מרחק להאריך עומק השדה בתנאי הדמיה הדורשים מוקד הסיבים במטוסים מספר מוקדים, או סיבי הארכה עבור אורך ניכר בממד z. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המיקרוסקופ משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), בתוך גישת הממשק המשתמש על כרטיסיית הניווט ב ימני עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גש לכרטיסיית הקואורדינטות מתפריט השלב. כדי להגדיל מרחק עבודה, זן ערך גדול במילימטרים עבור Z קואורדינטות ואז ללחוץ על עבור לכרטיסייה כדי להזיז את הבמה מדגם למרחק עובד נכנס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם סיוע של מפעיל מנוסה, להעסיק הטית דגימה וסיבוב כדי למקם את השטח של מאונך המעניין את אלומת האלקטרונים. הטיה נוספת של 10 עד 30 degrEES מתוך עמדה זו עשויה לשפר תצפית ותיעוד של המבנה מטריקס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור המיקרוסקופ משמש כאן (ראה טבלה של חומרים), בממשק המשתמש, לחץ לחיצה ממושכת על כפתור העכבר הימני, ולאחר מכן חלק שמאלה או ימינה כדי למקד את הדגימה ליד בפריפריה של מטוס המשטח המוכן של עניין, תוך ציון מרחק העבודה הממוקד . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט עם ג&#39;ויסטיק הממשק הידני על מנת לעבור ליד הקצה היריב של מוקד השטח וחזור. אם עובדי מרחק אינו שווה בערך במיקום הראשון, דגימה להטות להשיג סכם משוער בשני המקומות באמצעות לשונית הקואורדינטות של תפריט השלב (ראה 7.2) והזנת ערך הטיה של T לתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב דגימה תשעים מעלות (להזין ערך לתוך R לתאם שדה) וחזור על התהליך עד שכל העמדות ממוקדות על מרחק העבודה הזהה כ. הערה: SEM לחץ משתנה עשוי להיות מועסק על מנת לשפר את פיזור תשלוםאם זמין. ואקום גבוה הוא מצב הפעלה סטנדרטית עבור במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת שטח חתך היא השלב הקריטי ביותר במהלך הפרוטוקול. כדי לשמר מבנה עדין, דגימות מיובשות חייבות להישאר באתנול 100% בכל העת עד הציגו את תהליך ייבוש נקודה הקריטי. לכן החיתוך של דגימות כדי להשיג משטחים לבדיקה EM חייב להיעשות תוך דגימות קומטי באתנול בצלחת רדודה. זה גם קריטי, כי המשטח החשוף לא נגע או נחקר במהלך טיפול שלאחר מכן. אין שינויים גדולים צפויים עבור יישום של טכניקה זו כדי סוגי רקמות אחרים לתצפיות מטריקס דומות, אם כי חלק SEM של הפרוטוקול עשוי לדרוש פתרון בעיות במיקרוסקופ אלקטרוני...

פיברוזיס משבש את רשת הקולגן התקינה של שריר הלב, שהיא קריטית לתפקודים מכניסטיים תקינים של קרדיומיוציטים 1,2 כמו גם לתקשורת בין-תאית, איתות תוך-תאי והישרדות תאים 3. התפתחות פיברוזיס היא גורם מכריע בתפקוד הלב, ושיפוץ פיברוטי של אינטרסטיציום הלב הנובע ממגוון אטיולוגיות מוביל לנוקשות מוגברת של החדר השמאלי ולתפקוד דיאסטולי 4. פיברוזיס שריר הלב עלול גם להוביל להפרעות קצב, ובין אם התקדמות השיפוץ הפיברוטי היא תופעה כללית או מקומית, היא קשורה מאוד לפרוגנוזה גרועה בחולים עם קרדיומיופתיה איסכמית ולא איסכמית 5. כמו כן, היעדר פיברוזיס בשריר הלב הוא מנבא חזק להתאוששות תפקודית חדרית והישרדות לטווח ארוך 6. 
סימן ההיכר של פיברוזיס הוא שקיעה של עודף קולגן, בעל חוזק מתיחה של פלדה 7 ויכול להשפיע לרעה על תפקוד הקרדיומיוציטים במספר רמות. כוחות מכניים הנובעים ממטריצה קולגנית יתר על המידה יכולים להוביל לניוון קרדיומיוציטים 8,9, נוקשות רקמה פסיבית 10, נוקשות שריר הלב הנגרמת על ידי התכווצות טוניק 11-13, ואספקת חמצן מופחתת לאוכלוסיית הקרדיומיוציטים הנותרת. צימוד צומת פער של קרדיומיוציטים ו-myoFbs יכול גם לפגוע במאפיינים החשמליים של הלב, וליצור סיכון גדול יותר להתפתחות הפרעות קצב 14-16. פיברוזיס פריבסקולרי משנה את התגובתיות כלי הדם של העורקים הכליליים והעורקים התוך-מורליים 17 ותורמת להיצרות לומינלית המפחיתה את אספקת החמצן ובכך את הישרדותם של קרדיומיוציטים 17-22. שיפוץ פיברוטי וחשמלי פתוגני, הנובע מאתר ראשוני של פגיעה איסכמית או חוסר איזון אנרגטי, מתקדם בהכרח לאי ספיקת לב. 
נמק קרדיומיוציטים יוזם את התגובה הפיברוטית, ושיפוץ פיברוטי שלילי לאחר מכן יכול להתרחש ללא קשר לאטיולוגיה. מציאת דרך לשלוט בפיברוזיס הלבבי תועיל מבחינה קלינית לטיפול בקרדיומיופתיה איסכמית ואידיופטית, מחלות לב יתר לחץ דם, קרדיומיופתיה היפרטרופית, מחלות לב מסתמים ודיסטרופינופתיות 23-42. ללא קשר לאופן שבו מתחיל תהליך המחלה הפיברוטית, גורמים מסיסים ופרו-פיברוטיים יכולים לחצות את החלל הבין-רקמתי ולעורר הפעלה של פיברובלסטים אינטרסטיציאליים ואדוונטיציאליים באתרים מרוחקים לצלקת הפיברוטית הראשונית, וליצור אפקט מפל שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת לב. התרחיש האופטימלי יהיה לנצל את התהליך הפיברילוגני באמצעות טיפול ממוקד שניתן ליישם במהלך השלב ההיפרטרופי המפצה של קרדיומיופתיה לפני שהוא מתקדם לכשל במשאבה הסיסטולית או אי ספיקת לב דיאסטולית או תוצאות אחרות בשלב הסופי. המטרה הסופית תהיה להפוך את הפיברוזיס כך שניתן יהיה להחליף קרדיומיוציטים מתים ולשקם את תפקוד הלב לחלוטין. 
חשיבותה של המטריצה מובנת באופן נרחב, אך שיטות לחקר המטריצה מוגבלות בעיקר למדידות כמותיות של רכיבים מבניים עיקריים, במיוחד קולגן, ורמות יחסיות של מטריצה וחלבונים מטריאליים שונים. פרוטוקול זה מדגיש טכניקה נדירה בשימוש שימושי להערכת הבדלים איכותיים במטריצת הלב. טכניקה זו שימשה לאחרונה כדי להשוות ולהנגיד הבדלים מהותיים במטריצות לב מאטיולוגיות שונות של מחלות לב (בצמחים אנושיים), לבחון לבבות מחזירים לאחר אוטם שטופלו באיזופורם גורם גדילת גליה (GGF) של נוירגולין-1β, בהשוואה לבעלי חיים שלא טופלו 43, ולחקור הבדלים במטריצות של רקמות לב מ-MDX עכברים (מודל חי נפוץ של ניוון שרירים דושן) בגילאים שונים ובהשוואה לקבוצת ביקורת מסוג בר. טכניקה זו הוצגה לראשונה על ידי ד"ר קולפילד ובורג ב-1979 44, אך מחקרים מעטים השתמשו מאז בטכניקה רבת עוצמה זו 45-47, שהוצגה כאן מחדש עם שינויים קלים בלבד. מתודולוגיה זו היא כלי מחקר רב ערך, מכיוון שהיא מספקת מידע איכותי על מבנה מטריצה חוץ-תאית, שאחרת ניתן להתעלם ממנו בעת מדידת תכולת רכיבי המטריצה ו/או רמת הפיברוזיס.

<table><tbody><tr><td>סידן כלוריד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>12340</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>דבק פחמן</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>12664</td><td>30 גרם</td></tr><tr><td>דבק פחמן לשוניות</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונים מדעי</td><td>77825</td><td>סדר להתאים לבדלים</td></tr><tr><td>סכיני גילוח קצה כפול נירוסטה</td><td>טד פלה, בע"</td>מ <td>121-6</td><td>250/חבילה</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>אלקטרון מדעי המיקרוסקופיה</td><td>15055</td><td>450 מ"ל</td></tr><tr><td>גלוטרלדהיד, 50% תמיסה</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית</td><td>16310</td><td>דרגת EM, זיקוק מטוהר</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>16760 או 16770</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>מונוסודיום פוספט NaH<תת>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 גרם</td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה</td><td>מדעית 19100</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>כסף דבק מוליך</td><td>אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי</td><td>12686-15</td><td>15 גרם</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>S8045-1KG</td><td>1 ק"ג</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>חומצה טאנית, 5% מימי&nbsp;</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>21702-5</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>טריהידרט נתרן קקודילאט</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>12300</td><td>100 גרם</td></tr><tr><td>סגסוגת זהב-פלדיום או</td><td>מערכות זיקוק זהב, בע"מ&nbsp;</td><td>משתנה</td><td>ספציפי ליצרן ודגם ציפוי המקרטע</td></tr><tr><td>מייבש נקודה קריטית</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים מעץ רגיל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>קוונטה 250 SEM סביבתי FEI</td><td></td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Sputter Coater</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>דגם 108</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום SEM דגימה דפי</td><td>מיקרוסקופ אלקטרונים מדעי</td><td>75220-12</td><td>ספציפי למיסקרוסקופ</td></tr></tbody></table>

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

פיברוזיס הוא מרכיב בכל צורות מחלות הלב ללא קשר לאטיולוגיה, ולמרות שנעשתה התקדמות רבה בתחום הביולוגיה של מטריצת הלב, עדיין ישנם פערים גדולים הקשורים לאופן שבו נוצרת המטריצה, כיצד שיפוץ פיזיולוגי ופתולוגי נבדל, והכי חשוב כיצד ניתן לתמרן את הדינמיקה של מטריצות כדי לקדם ריפוי ולעכב פיברוזיס. כיום אין אפשרות טיפול לשליטה, מניעה או היפוך של פיברוזיס לבבי. חלק מהסיבה היא ככל הנראה המורכבות העצומה של היווצרות צלקת לבבית, כמו זו המתרחשת לאחר אוטם שריר הלב כדי להחליף מיד קרדיומיוציטים מתים או גוססים. המטריצה החוץ-תאית עצמה משתתפת בעיצוב מחדש על ידי הפעלת תאים תושבים וגם על ידי סיוע בהנחיית תאים חודרים לנגע שנכחד. המטריצה היא גם מעין ארונית אחסון לחלבונים מטריאליים החיוניים לתחלופה תקינה של מטריצות, כמו גם לאיתות פיברוטי. בנוסף הוכח כי המטריצה ממלאת תפקיד אלקטרומכני ברקמת הלב. רוב הטכניקות להערכת פיברוזיס אינן איכותיות באופיין, אלא מספקות תוצאות כמותיות שימושיות להשוואה בין שתי קבוצות אך אינן מספקות מידע הקשור למבנה המטריצה הבסיסי. מודגשת כאן טכניקה להמחשת אולטרה-מבנה של מטריצת הלב. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של רקמת לב נטולת תאים חושף הבדלים בולטים במבנה שאחרת עלולים להחמיץ בשיטות מחקר כמותיות מסורתיות.

הטכניקה המודגשת יושמה לרקמות לב מתורם השתלת לב אנושית בשימוש (איור 1), רקמות explanted מן המושתלים, לבבות מ wild-type ועכברים דיסטרופי (איור 3), ו בדגימות לב אוטם שלאחר שריר לב מתוך חזירים מודל של פגיעה לבבית (איור 2). כפי שניתן לראות בתרשים 1, מטריצת לב האדם הוא מארג מורכב של חלבונים צולבים המציגים דפוס חלת דבש דמוי כאשר צפו ב חתך. &quot;חלת דבש&quot; כל מבנה הוא כ 40 מיקרומטר רחב...

מוצגת כאן שיטה להמחשת מבנה אולטרה-מבנה של מטריצה חוץ-תאית ברקמות לב נטולות תאים.

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להדמיות של מבנה המטריקס של הלב בהיעדר תאים או חומרים אחרים שאינם מטריקס. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הפיברוזיס, ובמיוחד כיצד הבדלים בתוכן המטריקס יכולים להשפיע על ארגון המטריקס, וכיצד שינויים אלו עשויים להשפיע על קרדיומיופתיות שונות או מחלות פיברוטיות אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מבט איכותני של המטריקס שניתן להשתמש בו כדי להשלים מדידות כמותיות.ד"ר Galindo וד"ר Sawyer הגו אחריแรก ברעיון להשתמש בטכניקה זו לאחר שגילו כי טיפול רגיל בחזירי פוסט-אינפארקט הוביל לשינויים בביטוי הגנים שהיו דומים לשינויים בתוכן המטריקס לאחר הטיפול. אנשים שאינם מכירים את השיטה עלולים להתקשות אם אין להם ניסיון קודם בהכנת דגימות ל-SEM, וזאת בשל המיומנויות המוטוריות העדינות הנדרשות. דגימת הרקמה צריכה להיות גדולה מספיק כדי שניתן יהיה לראותה בקלות, ויש לאחסנה בתמיסת glutaraldehyde בריכוז 4% בטמפרטורה של 4°C.הוצא את הרקמה מהאחסון הקר ושטוף אותה במים מזוקקים. לאחר מכן, טבול את הרקמה בתמיסה של 10% sodium hydroxide, שהוכנה באופן מיידי מגבשושים במים. הקפד לנקוט באמצעי זהירות מתאימים.השאירו את הרקמה בתמיסת נתרן הידרוקסיד למשך שישה עד 10 ימים בטמפרטורת החדר. המשיכו בשלבים הבאים כאשר צבע הרקמה הופך ללבן או לבן-שמנת. לאחר מכן, שטפו את הרקמה במים מזוקקים עד שהיא הופכת לשקופה.בשלב הבא, רכבו כפפות והטבילו את הרקמה בחומצה טאנית בריכוז 1% למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר הטבילה בחומצה הטאנית, שטפו את הרקמה במים מזוקקים למשך לילה. כהכנה, תחת מנדף ובתוך כפפות, הכינו תמיסת מלאי 0.2 M של בופר sodium cacodylate ותמיסת מלאי מימית של osmium tetroxide בריכוז 2%.השתמשו במגן נתזים, כיוון ש-osmium tetroxide מהווה סכנת שאיפה חמורה. כעת, הכינו מהילול של 0.1 molar של באפר sodium cacodylate, והדגירו את הרקמה בתוכו למשך חמש דקות תוך כדי ערבוב עדין. החליפו את הבאפר פעמיים כדי לשטוף את הרקמה סך הכל שלוש פעמים עם sodium cacodylate.בשלב הבא, הכינו תערובת ביחס של אחד ለአחד של תמיסת המקור של sodium cacodylate ותמיסת המקור של osmium tetroxide. דגרו את הרקמה בתערובת החדשה על גבי רוטטור למשך שעה. לאחר מכן, החזירו את הרקמה ל-0.1 molar sodium cacodylate ודגרו אותה תחת ערבוב עדין למשך חמש דקות.החליפו את תמיסת האמבט הזו פעמיים במהלך 15 דקות. לאחר מכן,בצעו דהידרטציה לרקמה באמצעות סדרה של אמבטי אתנול בריכוזים עולים. השאירו את הרקמה להשריה למשך 15 דקות בכל אמבט תוך כדי ערבוב עדין.בשלב הבא, העבירו את הרקמה והתמיסה לצלוחית פטרי רדודה מלאה ב-100 percent אתנול. לאחר מכן, בזהירות, החזיקו שני להבי תספורת חדים מאוד כך שהצדדים השטוחים שלהם נוגעים זה בזה, וקצוות החיתוך מצטלבים ליצירת שני צלעות של משולש שווה צלעות מעל הדגימה. כעת, השתמשו ביד הדומיננטית כדי להניח את הלהב השני בצד שמאל הרחוק של הדגימה, ובצעו חיתוך לכיוון ימין.לפיכך, החליקו את הלהבים זה כנגד זה מכיוונים מנוגדים כדי לבצע חיתוך חלק אחד עם מינימום עיוות או כוח קריעה. המטרה היא לחשוף שטח פנים גדול ככל האפשר מבלי לפגוע בדגימה. חזרו על התהליך עד להכנת מספיק חתכים רוחביים משביעי רצון לבדיקה באמצעות SEM.העבירו את הרקמה למחזיק הדגימות של ה-CPD באמצעות שפכטל או פינצטה, תוך שמירה על הרקמה טבולה ב-100% ethanol. אין לחשוף את הרקמה לאוויר למשך יותר מכמה שניות. השתמשו ב-CPD כדי להחליף את ה-ethanol ב-carbon dioxide נוזלי, ובצעו את מחזור הייבוש כפי שמומלץ על ידי היצרן.לאחר מכן, הכינו תושבת לדגימה עבור כל דגימה ל-SEM. הדביקו לשונית דבק פחמן למשטח העליון של תושבת האלומיניום. תחת סטריאוסקופ, הדביקו בזהירות את הדגימה ללשונית הדבק, כאשר משטח החתך הרלוונטי פונה כלפי מעלה, הרחק מהלשונית, ובצורה מישורית ככל האפשר ביחס למשטח התושבת.אין לגעת במשטח הנחקר או לבחון אותו באמצעות מ probes. עבור הדגימות הקטנות והמסובכות ביותר, יש לשבור את מקל האפליקטור מעץ ולהשתמש בו כשפכטל. כמו כן, יש לעבוד מעל פיסת נייר סינון גדולה כדי למנוע אובדן של דגימה שנפלה.לשיפור ההיצמדות, השתמש במקל יישום שבור כדי ליצור מברשת מחודדת, ומרח צבע כסף או פחמן על הבסיס ודפנות הדגימה. משוך קו דק מאוד של צבע עד לקצה של פני השטח הרלוונטיים. פעולה זו תיצור נתיב פריקה של מטען מפני השטח הרלוונטיים אל הקרקע.לאחר מכן, מרחו שתי או שלוש נקודות קטנות של צבע מסביב להיקף של טביית הפחמן (carbon tab) כדי לספק נתיב מוליך מפני השטח של הטבייה לבסיס המתכת (metal stub). פעולה זו משמשת כהארקה. הניחו את הדגימה בצד והמתינו שעתיים לייבוש הצבע המוליך.לאחר הייבוש, הפעילו מכשיר לציפוי בגיבוב (sputter coater) כדי להחיל שכבה עבה יחסית של סגסוגת זהב-פלדיום או זהב על הדגימה. השכבה הרצויה היא בעובי של 30 עד 40 nanometer. בצעו את המיקרוסקופיה האלקטרונית הסורקת במתח מאיץ נמוך יחסית כדי למזער בעיות הקשורות לפיזור מטען לקוי בדגימה.השתמשו במצב לחץ משתנה אם הוא זמין. ראשית, שפרו את מרחק העבודה כדי לספק עומק שדה מספיק להתביית על הסיבים במימד Z. לשם כך, פתחו את לשונית הניווט (Navigation) בפינה הימנית העליונה.לאחר מכן, היכנסו ללשונית Coordinates (קואורדינטות) מתפריט הבמה. שם, הזינו ערך גבוה יותר עבור קואורדינטת Z, למשל 20 millimeters. לבסוף, לחצו על לשונית Go To כדי לבצע את השינוי.בשלב הבא, מקמו את פני השטח הרלוונטיים באופן ניצב לקרן האלקטרונים. לחצו והחזיקו את המקש הימני של העכבר, ולאחר מכן החליקו אותו שמאלה או ימינה כדי למקד את הדגימה בקרבת ההיקף של מישור פני השטח שהוכן. רשמו את מרחק העבודה של המיקוד.לאחר מכן, באמצעות ג'ויסטיק של ממשק המשתמש הידני, העבירו את התצוגה לקצה הנגדי וחזרו על שיטת המיקוד. אם מרחק העבודה השתנה, הטו את הדגימה כדי להשיג התאמה מקורבת בשני המיקומים. השתמשו בלשונית Coordinates של תפריט ה-Stage והזינו ערך הטיה בקואורדינטה T.כעת, סובבו את הדגימה ב-90 מעלות על ידי הזנת ערך זה לשדה קואורדינטת R. לאחר מכן, חזרו על תהליך ההטיה עד שכל המיקומים יהיו ממוקדים במרחק עבודה דומה בקירוב. הטכניקה המתוארת יושמה על רקמות לב ממסייע לתרומת לב אנושי שלא נעשה בו שימוש.המטריצה של הלב האנושי היא מארג מורכב של חלבונים מקושרים בעל תבנית דמוית חלת דבש בחתך רוחב. כל מבנה של חלת דבש הוא ברוחב של כ-40 מיקרון, ובדרך כלל מקיף מיוציט בודד. כאשר הם מחוברים באמצעות דיסקים בינ-תאיים (intercalated discs), ניתן לדמות מספר מיוציטים של הלב כמו מוט הנמתח לאורכו בתוך צורה דמוית מנהרה.בנוסף לאספקת מידע מבני, SEM של רקמות שעברו דה-צלולריזציה יכול לאפשר הערכה איכותנית משמעותית בתגובה לפגיעה או לצורות של קרדיומיופתיה שאינן גורמות לפגיעה, כגון רקמות לב שעברו אוטם בחזיר. במחקר נפרד, הוכח כי האיזופורמה GGF2 של NRG-1 beta מהווה טיפול תרפויטי פוטנציאלי לאי-ספיקת לב. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן עיבוד הרקמה, רקמת לב, עבור מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, כולל הטכניקה לחשיפת המשטח הרלוונטי ולקיבוע הדגימה.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות כגון mass spec, ריצוף RNA ובדיקות שונות אחרות על מנת למדוד חלבוני מטריקס חוץ-תאי ומרכיבים אחרים האחראים על איתות ותופעות תצפית ארגוניות אחרות. כמו כן, זכרו כי אוסמיום טטראוקסיד הוא כימיקל מסוכן, בשל הפוטנציאל לקיבוע של ריריות באמצעות אדיו. זכרו תמיד לעבוד במabilis (מנדף) עם כפפות ניטריל, תוך שימוש במגן נתזים או בסגירה של דלת המנדף.

scanning-electron-microscopy-macerated-tissue-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את שיטת האבטיפוס לייצור coverslips מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצופה ג'לטין להמחשת הפחתת מטריצת invadopodia בתיווך. טכניקות חישוב באמצעות תוכנה זמינה מוצגות לכימות הרמות כתוצאה של proteolysis מטריצה ​​של תאים בודדים בתוך אוכלוסייה מעורבת וקבוצות תאיות המקיפות את השדות מיקרוסקופים שלמים.

מדידת כמותית של Proteolysis מטריקס invadopodia בתיווך בקשרים יחידים ורבים תאיים

המטריצה ​​תאית עוברת שיפוץ משמעותי בריפוי פצעים, דלקות והיווצרות גידול. אנו מציגים גישה מיקרוסקופית immunofluorescence intravital רומן כדי להמחיש את הדינמיקה של סיבי, כמו גם רכיבי מטריצת רשת כמו עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות epifluorescence או שני פוטונים במיקרוסקופ.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

פרוטוקול זה מתאר הליך להעשרת חלבוני ECM מרקמות או גידולים ודה-גליקוזילציה ועיכול התכשירים המועשרים ב-ECM לפפטידים כדי לנתח את הרכב החלבון שלהם על ידי ספקטרומטריית מסה.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

אנו מציגים פרוטוקול להשיג מטריצות תאים שמקורם עשירות בחלבונים תאים מטריקס, באמצעות crowders macromolecular (MMC). בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול אשר משלב MMC בדור העור 3D organotypic שיתוף התרבות, אשר מקטין את זמן תרבות תוך שמירה לפדיון של מבנה.

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

המטריצה החוץ-תאית ממלאת תפקיד מרכזי בהגדרת המיקרו-סביבה של התאים ובוויסות התנהגות התא והפנוטיפ. אנו מתארים שיטה מהירה לבידוד מטריצה חוץ-תאית שמקורה בתאים, שניתן להתאים לקני מידה שונים למחקרים מיקרוסקופיים, ביוכימיים, פרוטאומיים או פונקציונליים.

מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

מלכודות חוץ-תאי מקרופאג הם ישות שתואר לאחרונה. מאמר זה יתמקד מיקרוסקופיה קונפוקלית שיטות, איך הם דמיינו במבחנה , ויוו מדגימות ריאות.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

פרוטוקול זה מציג שיטה לdecellularization והיווצרות הידרוג'ל עוקבות אחר הקרנה של שומן החלב של מורלין לאחר ההקרנה vivo ex.

לימוד השפעות קרינת העור נורמלי באמצעות מטריקס הידרותאי הידרו

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

הפרוטוקול הנוכחי מייעל את שיטות זילוח / דה-צלולריזציה באתרו של הכבד ושיטות מיקרוסקופיה של שני פוטונים כדי ליצור פלטפורמה אמינה להמחשת הדינמיקה של עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית (ECM) במהלך סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH).

הדמיה תלת מימדית של המטריצה החוץ תאית של הכבד במודל עכבר של דלקת כבד לא אלכוהולית

אנו מציעים פרוטוקול להערכת התחדשות עצם ברמות היררכיות שונות. גישה רב-מודלית זו מאפשרת ניתוח מבני בקני מידה שונים לאורך זמן, תוך התמודדות יעילה עם אתגרים בהכנת הדגימה. הוא גם מספק תהליך עבודה אמין להערכת יעילות הביוחומרים בקידום התחדשות העצם.

גישה רב-מודלית להערכת התחדשות עצם וביצועי פיגומים

חקור מבנה מטריקס לבבי מופרד מתאים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק. השיטה מאפשרת תיאור איכותי של ארגון המטריקס החוץ-תאי ומסייעת בחקר מחלות פיברוטיות וקרדיומיופתיות שונות.

מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

גלה סרטונים נוספים