מיקרוסקופ אלקטרוני סורק של רקמות macerated לדמיין את תאי מטריקס

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לדמיין את מבנה מטריצת הלב בהיעדר תאים או חומרים אחרים שאינם מטריצה. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הפיברוזיס, במיוחד כיצד הבדלים בתוכן המטריצה יכולים להשפיע על ארגון המטריצה, וכיצד שינויים אלה עשויים להשפיע על קרדיומיופתיות שונות או מחלות פיברוטיות אחרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מספקת תצוגה איכותית של המטריצה שניתן להשתמש בה כדי להגדיל מדדים כמותיים.

ד"ר גלינדו וד"ר סוייר העלו לראשונה את הרעיון להשתמש בטכניקה זו לאחר שגילו כי בטיפול קבוע בחזירים לאחר אוטם יש שינויים בביטוי הגנים הדומים לשינויים בתכולת המטריצה לאחר הטיפול. אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק אם אין להם ניסיון קודם בהכנת דגימת SEM, בשל המוטוריקה העדינה הנדרשת. דגימת הרקמה צריכה להיות גדולה מספיק כדי שניתן יהיה לראות אותה בקלות, ולאחסן אותה בתמיסת גלוטרלדהיד של ארבעה אחוזים בארבע מעלות צלזיוס.

הסר את הטישו מאחסון קר ושטוף אותו במים מזוקקים. לאחר מכן, טבלו את הרקמה בתמיסה של 10 אחוז נתרן הידרוקסיד, העשויה מכדורים טריים במים. הקפד לנקוט באמצעי זהירות נאותים.

שמור את הרקמה בתמיסת הנתרן הידרוקסיד למשך שישה עד 10 ימים בטמפרטורת החדר. המשך כאשר צבע הרקמה הופך לבן או לבן. לאחר מכן, שטפו את הטישו במים מזוקקים עד שהוא הופך לשקוף.

לאחר מכן, לבשו כפפות וטבלו את הרקמה באחוז אחד של חומצה טאנית למשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר. לאחר אמבט החומצה הטנית, שטפו את הטישו במים מזוקקים למשך הלילה. בהכנה, במכסה אדים לובש כפפות, הכינו תמיסת מלאי מולרית של 0.2 מאגר נתרן קקודילאט ותמיסת מלאי מימית של שני אחוזים של טטרוקסיד אוסמיום.

השתמש במגן התזה, מכיוון שאוסמיום טטרוקסיד מהווה סכנת שאיפה חמורה. כעת, בצע דילול של 0.1 מולארי של מאגר הנתרן קקודילאט, ודגר את הרקמה בו למשך חמש דקות בתסיסה עדינה. החלף את המאגר פעמיים כדי לשטוף את הרקמה בסך הכל שלוש פעמים עם נתרן קקודילאט.

לאחר מכן, הכינו תערובת אחד לאחד של הנתרן קקודילאט המלאי ומלאי אוסמיום טטרוקסיד. דגרו את הרקמה בתערובת החדשה על מסובב למשך שעה. מאוחר יותר, החזירו את הרקמה לקקודילאט נתרן מולארי 0.1 ודגרו אותה בתסיסה עדינה למשך חמש דקות.

יש להחליף את תמיסת האמבטיה פעמיים במשך 15 דקות. לאחר מכן, יבשו את הרקמה באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול בריכוזים הולכים וגדלים. הניחו לממחטת הנייר להשרות במשך 15 דקות בכל אמבטיה בערבול עדין.

לאחר מכן, העבירו רקמה ותמיסה לצלחת פטרי רדודה מלאה ב-100 אחוז אתנול. לאחר מכן, בזהירות, החזיקו שני סכיני גילוח חדים מאוד כך שדירות הצדדים יהיו במגע זה עם זה, וקצוות החיתוך מצטלבים ליצירת שתי צלעות של משולש שווה צלעות מעל הדגימה. כעת, השתמש ביד הדומיננטית שלך כדי למקם את הלהב השני בקצה השמאלי של הדגימה, וחתוך ימינה.

לפיכך, החלק את הלהבים זה בזה מכיוונים מנוגדים כדי לבצע חתך חלק יחיד עם עיוות מינימלי או כוח קריעה. המטרה היא לחשוף שטח פנים גדול ככל האפשר מבלי לפגוע בדגימה. חזור על התהליך עד שיוכנו מספיק חתכים משביעי רצון לבדיקה על ידי SEM.

בעזרת מרית או פינצטה, העבירו את הרקמה למחזיק הדגימה של ה-CPD, תוך שמירה על הרקמה שקועה ב-100 אחוז אתנול. לא ניתן לחשוף את הרקמה לאוויר יותר מכמה שניות. השתמש ב-CPD כדי להחליף את האתנול בפחמן דו חמצני נוזלי, ובצע את מחזור הייבוש כפי שצוין על ידי היצרן.

לאחר מכן, הכן בדל דגימת SEM עבור כל דגימה. הדביקו לשונית דבק פחמן למשטח העליון של בדל האלומיניום. תחת סטריאוסקופ, הדביקו בזהירות את הדגימה ללשונית הדביקה כשמשטח החתך המעניין פונה כלפי מעלה, הרחק מהלשונית, ומישורי מקסימלי עם משטח הגבעול.

אין לחקור או לגעת במשטח העניין. עבור הדגימות הקטנות והקשות ביותר, שברו את מקל המוליך מעץ לשימוש כמרית. כמו כן, עבדו על פיסת נייר סינון גדולה כדי למנוע אובדן דגימה שנפלה.

לשיפור ההדבקה, השתמש במקל אפליקטור שבור כדי ליצור מברשת מחודדת, ומרח צבע כסף או פחמן על הבסיס והדפנות של הדגימה. האריכו קו צבע דק מאוד עד לקצה פני השטח המעניינים. זה יהפוך נתיב טעינה מפני השטח המעניין לקרקע.

לאחר מכן, מרחו שניים או שלושה טפיחות צבע קטנות סביב היקף לשונית הפחמן כדי לספק נתיב מוליך משטח הלשונית אל בדל המתכת. זה מתפקד כקרקע. הניחו את הדגימה בצד והניחו לצבע המוליך להתייבש במשך שעתיים.

לאחר הייבוש, הפעל ציפוי מקרטע כדי למרוח שכבה כבדה יחסית של סגסוגת פלדיום זהב או זהב על הדגימה. רצוי ציפוי בעובי של 30 עד 40 ננומטר. בצע את מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק במתח מאיץ נמוך יחסית כדי למזער בעיות הקשורות לפיזור מטען לקוי בדגימה.

השתמש במצב לחץ משתנה אם הוא זמין. ראשית, שפר את מרחק העבודה כדי לספק מספיק עומק שדה כדי להתמקד בסיבים בממד Z. לשם כך, פתח את הכרטיסיה ניווט בפינה השמאלית העליונה.

לאחר מכן, גש ללשונית קואורדינטות מתפריט הבמה. שם, הזן ערך גדול יותר עבור קואורדינטת Z, כגון 20 מילימטרים. לבסוף, לחץ על הכרטיסייה Go To כדי לבצע את השינוי.

לאחר מכן, מקם את משטח העניין בצורה אורתוגונלית לאלומת האלקטרונים. לחץ והחזק את לחצן העכבר הימני, ולאחר מכן החלק אותו שמאלה או ימינה כדי למקד את הדגימה ליד ההיקף של מישור פני השטח המוכן המבוקש. שימו לב למרחק העבודה הממוקד.

לאחר מכן, באמצעות הג'ויסטיק הידני של ממשק המשתמש, העבר את התצוגה לקצה הנגדי וחזור על שיטת המיקוד. אם מרחק העבודה השתנה, הטה את הדגימה כדי להשיג הסכמה משוערת בשני המקומות. השתמשו בכרטיסייה 'קואורדינטות' בתפריט 'שלב' והזינו ערך הטיה בקואורדינטת T.

כעת, סובב את הדגימה ב-90 מעלות על ידי הזנת ערך זה לשדה הקואורדינטות R. לאחר מכן, חזור על תהליך ההטיה עד שכל המיקומים ממוקדים באותו מרחק עבודה בערך. הטכניקה המתוארת יושמה על רקמות לב מתורם השתלת לב אנושי שלא נעשה בו שימוש.

מטריצת הלב האנושית היא מארג מורכב של חלבונים צולבים בעלי דפוס דמוי חלת דבש בחתך רוחב. רוחב כל מבנה של חלת דבש הוא כ-40 מיקרון, בדרך כלל עוקף מיוציט בודד. כאשר הם מחוברים על ידי דיסקים משולבים, ניתן לדמיין מספר מיוציטים קרדיולוגיים כמוט העובר לאורכו דרך צורה דמוית מנהרה.

בנוסף למתן מידע מבני, SEM של רקמות נטולות תאים יכול לאפשר הערכה איכותית משמעותית בתגובה לפציעה או צורות לא מזיקות של קרדיומיופתיה, כגון רקמות לב אוטם מחזיר. במחקר נפרד, האיזופורם GGF2 של NRG-1 beta הוכח כטיפול טיפולי פוטנציאלי לאי ספיקת לב. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לעבד רקמות, רקמת לב, עבור מיקרוסקופ האלקטרונים הסורק, כולל הטכניקה לחשיפת פני השטח המעניינים ולהרכבת הדגימה.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בטכניקות אחרות כגון מפרט מסה, ריצוף RNA ובדיקות שונות אחרות על מנת למדוד חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ואחרים האחראים לאיתות ותופעות תצפיתיות ארגוניות אחרות. כמו כן, אל תשכח כי אוסמיום טטרוקסיד הוא כימיקל מסוכן, בשל הפוטנציאל לקיבוע אדים של הריריות. זכור תמיד לעבוד במכסה אדים עם כפפות ניטריל, באמצעות מגן התזה או אבנט מכסה המנוע.